マイクロ流体混合で調製したmRNA-脂質ナノ粒子のin vitro および in vivo 効率の試験
2023年1月20日
ここでは、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAをカプセル化する脂質ナノ粒子(LNP)を製剤化するためのプロトコルが提示されます。これらのLNPは、in vitro でHepG2細胞で、in vivo でC57BL/6マウスでその効力を試験しました。
このプロトコルがMRAを内包する一貫した脂質のナノ粒子を作り出すのに使用することができる。製剤パラメータを調整し、さまざまな脂質ナノ粒子の効力と生体内分布を評価できます。脂質ナノ粒子の調製、in vitroおよびin vivo試験のための標準化されたプロトコルを使用して、互いに比較できる一貫した脂質ナノ粒子を調製することができます。
ナノ粒子の効力を調合・評価する際には、留意すべき細かい点がたくさんありますが、どの点が考慮されたのでしょうか?製剤の調製は難しくないはずです。まず、清潔な4リットルのビーカーに200〜300ミリリットルの新鮮な10X PBSを充填し、超純水で1倍に希釈します。
PBSの最終容量が2〜3リットルであることを確認してください。脂質ナノ粒子またはLNP製剤に適した容量の透析カセットをフィールドビーカーに入れます。超純水を使用して100ミリモルのクエン酸緩衝液を10倍希釈し、mRNA希釈用の10ミリモルのクエン酸緩衝液を作成します。
次に、各脂質を100%エタノールに溶解して、C 12 200イオン化脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、脂質アンカーPEGまたは脂質PEGストック溶液を作製します。原液を37°Cで加熱混合し、完全に溶解していることを確認します。異なる脂質成分の計算された体積を円錐形のチューブに組み合わせます。
脂質を100%エタノールで希釈し、最終容量V(LNPの最終容量の25%)に希釈します。イオン化脂質とmRNAの重量比とmRNA-LNPの総量から、製剤化に必要なmRNAの量を算出します。次に、mRNAをコードするホタルルシフェラーゼを氷上で解凍します。
次に、10 mmモルのクエン酸バッファーを使用して、mRNA を最終容量の有機相の 3 倍に希釈します。デリケートなタスクワイプにRNAとDNAの表面除染剤をスプレーし、マイクロ流体機器の内部を完全に拭きます。次に、新しいマイクロ流体カートリッジを開き、インレットチャネルを下に向けて反対側に挿入します。
キャップを外した状態で、ホルダーに滅菌済みの15ミリリットルのコニカルチューブを2本配置します。完了したら、10ミリモルのクエン酸緩衝液で希釈したmRNAを含むmRNA溶液を5ミリリットルのシリンジに充填します。次に、100%エタノールで希釈した脂質を含む脂質溶液を3ミリリットルのシリンジに充填します。
シリンジから空気を抜いてください。次に、針を使わずに、mRNA溶液の入った5ミリリットルのシリンジをカートリッジの左入口に挿入し、脂質溶液の入った3ミリリットルのシリンジをカートリッジの右入口に挿入します。マイクロ流体装置の電源を入れ、クイックランを選択します。
挿入した5ミリリットルおよび3ミリリットルのシリンジに適切なシリンジタイプを選択した後、LNP調合のパラメータを水と有機物の流量比で3対1で入力してから、スタートボタンを押してmRNA-LNPを調製します。右の円錐形チューブに採取したmRNA-LNPを、カセットメンブレンに穴を開けたり触れたりすることなく、シリンジであらかじめ水和した透析カセットにセットし、mRNA-LNPの入った透析カセットをPBSの入ったビーカーに戻し、2時間以上透析します。透析後、mRNA-LNPを含む透析カセットを滅菌バイオセーフティキャビネットに入れ、針付きシリンジを使用してmRNA-LNPを取り除きます。
0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してmRNA-LNPを滅菌ろ過し、滅菌コニカルチューブに回収します。次に、65マイクロリットルのmRNA-LNP溶液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れて特性評価します。5、000 HepG2細胞を白い壁、透明な底、96ウェルプレートに100マイクロリットルの完全な細胞培養培地にプレートし、5%の二酸化炭素を含む37°Cの制御されたインキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。
細胞をmRNA-LNPで処理する前に、ウェルから完全な培地を除去します。次に、100マイクロリットルのmRNA-LNPを完全な細胞培養培地で所望の用量で希釈するか、24時間のインキュベーションの前に100マイクロリットルの完全な培地で細胞を処理します。インキュベーション後、96ウェルプレートから細胞培養培地を取り出し、各ウェルに20マイクロリットルの溶解緩衝液を加え、続いて100マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加します。
プレートを光から保護し、プレートをプレートリーダーに入れて生物発光シグナルを測定します。滅菌PBSを用いてmRNA-LNP溶液を希釈し、尾静脈注入量100マイクロリットル中に2マイクログラムの総mRNAが存在するようにします。29ゲージのインスリンシリンジに100マイクロリットルのmRNA-LNPまたは100マイクロリットルのPBSを充填し、シリンジから気泡を取り除きます。
斜角を上に向けて針をマウスの側尾静脈に挿入し、100マイクロリットルのmRNA-LNPまたはPBSをゆっくりと注入します。注射の6時間後に、滅菌PBS中のD-ルシフェリンカリウム塩の15ミリグラム/ミリリットルのストック溶液を調製します。in vivo イメージングシステム(IVIS)用のイメージングソフトウェアで、発光の横のボックスを選択してから初期化を押して、データ取得用の装置を準備します。
次に、以前に治療したマウスに200マイクロリットルのD-ルシフェリンを腹腔内に投与し、ルシフェラーゼシグナルが安定するまで10分間待ってからマウスに麻酔をかけます。麻酔をかけたマウスをin vivoイメージングシステム内のノーズコーンに移し、腹部を露出させて仰向けになったことを確認してから、チャンバーのドアを閉めます。イメージングソフトウェアで、正しい視野が選択されていることを確認し、露光時間を自動に設定し、ソフトウェアの取得ボタンをクリックして生物発光画像を取得します。
mRNA-LNPのカプセル化効率は、ここに示した修飾蛍光アッセイと式を用いて92.3%と決定しました。5, 000 個の HepG2 細胞を mRNA-LNP の用量を増やして処理すると、生物発光の増加が観察されました。ルシフェラーゼの発現は、この研究の最低用量であるウェルあたり5ナノグラムで容易に検出されました。
調製LNPで処理したマウスの上腹部に強い生物発光シグナルが観察され、肝臓シグナルの周囲に関心のある領域を描画して、総発光フラックスを計算しました。全発光束は10倍から約5倍から9倍であった。
LNPを調製する際には、イオン化可能な脂質と核酸の重量比を常に維持してください。有機相の各容量には、水相の 3 容量の mRNA に対応するイオン化脂質が含まれている必要があります。
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概要
本記事では、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAを封入した脂質ナノ粒子（LNP）の調製プロトコルを紹介します。作成したLNPの効力は、in vitroでのHepG2細胞およびin vivoでのC57BL/6マウスを用いて評価されました。
研究の主要構成要素
科学分野
- ナノ粒子製剤
- mRNAデリバリーシステム
- in vitroおよびin vivo試験
背景
- 脂質ナノ粒子はmRNAのデリバリーにおいて極めて重要です。
- 製剤化パラメータは、ナノ粒子の性能に大きな影響を及ぼす可能性があります。
- 標準化されたプロトコルは、再現性と比較可能性を向上させます。
- 治療への応用には、力価と生体内分布の理解が不可欠です。
研究目的
- LNP製剤作製のための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 異なる生物学的コンテキストにおけるLNPの効力を評価すること。
- さまざまなLNP製剤を比較するための枠組みを提供すること。
使用方法
- mRNAを封入した脂質ナノ粒子の調製。
- HepG2細胞を用いたin vitro試験。
- C57BL/6マウスを用いたin vivo試験。
- 製剤パラメータおよび生体内分布の評価。
主な結果
- mRNAを封入したLNPの調製に成功した。
- in vitroおよびin vivoの両モデルにおいて有効性が実証された。
- 性能に影響を与える主要な調製パラメータを特定した。
- プロトコルを標準化したことで、一貫性のある比較が可能となった。
結論
- 開発されたプロトコルは、LNPの調製に有効である。
- in vitroおよびin vivo試験により、mRNAデリバリーにおけるLNPの有用性が確認された。
- 今後の研究では、このフレームワークに基づいてさらなる最適化を行うことができる。
よくある質問
業界における重要性
mRNA-脂質ナノ粒子（LNP）の標準化されたマイクロ流体調製および定量的試験により、核酸治療薬の初期開発において極めて重要なデリバリー効率と生体内分布の堅牢な評価が可能になります。このワークフローは、in vitroおよびin vivoモデルにおけるLNP性能の予測的な信頼性を裏付け、go/no-go判断やポートフォリオの選別を支援します。一貫した封入効率と活性評価は、mRNAベースのモダリティに向けた、スケールアップ可能で再現性のあるR&Dパイプラインの基盤となります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 配送効率向上のためのLNP処方パラメータの体系的な検討を可能にします。
- 適切な細胞株および動物モデルにおけるmRNAの導入効率と発現量を定量化することで、生物学的リスクの低減をサポートします。
- 後続の最適化工程に先立ち、LNP-mRNA構築物の機能的な検証を容易にします。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- スクリーニングキャンペーンに向けたLNPの調製および特性評価のための、再現性のあるプラットフォームを提供します。
- 用量反応および力価評価のための定量的なバイオルミネッセンス読み取り値を提供します。
- LNP製剤におけるアッセイの標準化およびバッチ間の比較可能性を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- in vitroおよびin vivoのデータを整合させ、デリバリーシステム評価におけるトランスレーショナルな連続性を担保します。
- 生体内分布および臓器特異的なデリバリーを定量化し、前臨床リスクアセスメントに役立てます。
- 定量的な性能指標に基づき、リスク調整されたLNP候補の推進を支援します。
パイプラインおよびワークフローへの統合
本プロトコルは、初期の探索から前臨床評価までを統合し、製剤化、in vitroでの活性評価、およびin vivoでの生体内分布評価を橋渡しするものです。
- ディスカバリーバイオロジー：標準化された定量アッセイを用いて、LNP組成およびデリバリー効率に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：生物発光出力を利用し、LNPバッチの再現性のある調製および力価スクリーニングを可能にします。
- 分析：比較分析のための定量的な封入効率および発光束測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroのトランスフェクションデータとin vivoの生体内分布を関連付け、候補物質の選定に役立てます。
- エンタープライズでの再利用：複数のプログラムにわたるLNP-mRNA評価のための、再利用可能な標準化ワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 生体システムにおけるLNPのデリバリーおよび発現の予測信頼性を向上させます。
- 運用上の価値： ナノ粒子調製および試験における標準化、再現性、およびスケールアップを促進します。
- 戦略的価値： 堅牢な定量データを提供することで、ゴー/ノーゴー（継続・中止）の判断に寄与し、後期の開発リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響： さらなる開発に向けたLNP候補物質のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- ナノ粒子製剤の調製および定量的生物発光アッセイに関する専門知識が必要です。
- マイクロ流体ミキシング装置およびin vivoイメージングシステムを利用できる環境が必要です。
- 製剤調製およびアッセイプロトコルの厳格なチーム間標準化が求められます。
- 異なるmRNAカーゴや標的組織に合わせて最適化が必要な場合があります。
- 実用上の制限として、脂質対mRNA比の一貫性の維持およびバッチ間の再現性の確保が挙げられます。
バイオファーマに関するよくあるご質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:50
Pre-Formulation Preparation
1:51
Preparation of the Lipid and Nucleic Acid Mixes
2:33
Microfluidic Formulation of mRNA-LNPs
3:56
Post-Formulation Processing and Characterization of the mRNA-LNPs
4:51
In Vitro Transfection of HepG2 Cells
5:55
In Vivo Evaluation of mRNA-LNPs in Mice Following Tail Vein Injection
7:34
Results: Formulation of mRNA-LNPs and the Assessment of In Vitro and In Vivo Performance
8:24
Conclusion
