パルミチン酸誘発 In vitro モデルにおける非アルコール性脂肪性肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果の調査
2022年12月2日
このプロトコルは、パルミチン酸誘発 インビトロ モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患に対するプラチコジンDの保護効果を調査します。
この方法は、モデルの構築とNAFLDに対するプラチコジンDの保護効果の調査を可能にするAML-12細胞の使用を示しています。動物モデルの使用に過度に依存すると、治療薬開発の負担が増大します。NAFLD医薬品開発の初期段階で細胞モデルを使用することは、より実用的で費用効果が高い。
このTCMモデルは、プラチコジンDの生物学的機能の理解を深め、NAFLDの治療のための他のTCMの使用を研究するのに役立つ可能性があります。まず、1ウェルあたり1ミリリットルのAML-12細胞を12ウェルプレートに播種します。次に、12ウェルプレートを4つの異なる治療群に分け、それらをコントロール、PD処理、PA処理、およびPAプラスPD処理群としてラベル付けします。
ウェルあたり1ミリリットルの正常細胞培養培地をコントロールおよびPD処理群に加えます。300マイクロモルのパルミチン酸を添加した1ミリリットルの正常細胞培養培地をPA処理群およびPAプラスPD処理群に加える。24時間のインキュベーション後、細胞の培養液を取り除き、1ミリリットルの無血清培地で細胞を2回洗浄します。
次に、コントロール群にビヒクルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを、PD処理群に1マイクロモルのプラチコジンDを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを添加する。PA処理群にパルミチン酸300マイクロモルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを、PA添加PD処理群にパルミチン酸300マイクロモルおよびプラチコジンD1マイクロモルを添加した正常細胞培養培地1ミリリットルを添加する。細胞を24時間処理した後、ウェルあたり1ミリリットルの1X PBSで細胞を3回洗浄します。
次いで、ウェル当たり100マイクロリットルの10マイクロモルDCFH-DAで細胞を染色する。細胞を暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を1X PBSで3回洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの1X PBSを加えます。
12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを使用して、200倍の倍率で細胞の形態を観察します。ミトコンドリア膜電位を測定するには、以前に調製した処理細胞をウェルあたり1ミリリットルの1X PBSで3回洗浄します。次に、1ミリリットルあたり5マイクログラムの100マイクロリットルのJC-1作業溶液で細胞を染色し、暗所で摂氏37度で30分間細胞をインキュベートします。
次に、細胞を1X PBSで3回洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの1X PBSを加えます。12ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、20倍の対物レンズを使用して、200倍の倍率で細胞の形態を観察します。処理した細胞を溶解し、細胞溶解液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに集めます。
チューブを12, 000 Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。次に、5X SDS-PAGEサンプルローディングバッファーを細胞ライセート上清に1対4の容量比で加えます。次に、調製した12%SDS-PAGEゲルを12ウェルで電気泳動槽に入れ、超純水で希釈した1X SDSアップサンプルバッファーを推奨高さ限界まで加えます。
SDS-PAGE電気泳動後、0.45ミクロンのPVDFメンブレンへのタンパク質の電気転写を実行します。ブロッキングバッファーで希釈した5ミリリットルの一次抗体でメンブレンをインキュベートします。LC-III、p62、およびベータアクチンに特異的な抗体を使用してください。
摂氏4度で一晩インキュベートします。次いで、PVDF膜をブロッキングバッファー中で1〜10,000に希釈したウサギ抗マウスLGG HRP二次抗体と共にインキュベートする。メンブレンを光から保護された室温で2時間インキュベートします。
インキュベーション後、PVDFメンブレンをラップの上に置きます。適量のECL作業溶液を加え、2分間インキュベートします。次に、ECL作業溶液を取り出し、画像現像のためにイメージングシステムでPVDF膜を露出させます。
DCFH-DA染色は、プラチコジンDがALM-12細胞の細胞内ROSレベルを有意に低下させる可能性があることを示し、この処理が細胞の酸化ストレスを軽減できることを示しています。また,JC-1モノマーまたは脱分極ミトコンドリアを表す緑色蛍光はパルミチン酸処理細胞の方が未処理細胞よりも高く,JC-1二量体または偏光ミトコンドリアを表す赤色蛍光はパルミチン酸処理細胞の方が未処理細胞よりも低く,パルミチン酸誘導MMP脱分極を示した。また、プラチコジンD処理群では、モデル群と比較して、JC-1モノマーの二量体に対する比率が減少し、パルミチン酸誘導MMPを改善できることが示された。
オートファジー関連タンパク質LC-IIIおよびp62のタンパク質発現レベルをウェスタンブロッティングにより調べた。LC-32とLC-31の比率は有意に減少し、p62のタンパク質発現量はパルミチン酸で処理した後に増加した。一方、プラチコジンDはp62のタンパク質発現量を有意に低下させ、LC-32とLC-31の比率を増加させ、パルミチン酸によって誘導されるオートファジーフラックスの回復を示しました。
陰性対照群の細胞の蛍光値が比較的高い場合は、必要に応じて蛍光プローブの使用濃度を調整することができる。
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概要
本プロトコルでは、AML-12細胞を用いたin vitroモデルを用いて、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）に対するプラティコジンDの保護効果を検討します。本研究は、プラティコジンDの生物学的機能および潜在的な治療への応用に関する知見を提供することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 薬理学
背景
- NAFLDは、治療選択肢が限られているため、健康上の懸念が高まっている疾患です。
- 従来の動物モデルは、コストと時間がかかる場合があります。
- 細胞モデルは、初期段階の創薬における実用的な代替手段となります。
- Platycodin Dは、潜在的な保護効果を持つ漢方薬（TCM）です。
研究目的
- NAFLDに対するプラティコジンDの保護効果を調査すること。
- NAFLD研究のための費用対効果の高いin vitroモデルを開発すること。
- 肝疾患の治療における伝統中国医学（TCM）への理解を深めること。
使用した手法
- AML-12細胞を12ウェルプレートに播種する。
- 細胞をコントロール群、PD処理群、PA処理群、およびPA＋PD処理群の各処理群に分ける。
- パルミチン酸を用いて細胞モデルにNAFLDを誘導する。
- プラティコジンDが細胞の生存率および機能に及ぼす影響を評価する。
主な結果
- Platycodin Dは、パルミチン酸誘発性の損傷に対して保護効果を示した。
- このin vitroモデルは、NAFLDの側面を効果的に模倣した。
- 本結果は、肝疾患治療における中医学（TCM）のさらなる研究を支持するものである。
- これらの知見は、初期の創薬段階における動物モデルへの依存を減らす可能性がある。
結論
- プラティコジンDは、NAFLDの治療薬として有望である。
- 開発された細胞モデルは、今後の研究において有用なツールとなる。
- 作用機序を解明するためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
産業界への実用的な意義
NAFLDの早期段階における創薬には、候補メカニズムのリスクを低減し、動物実験への依存度を下げることができる、堅牢でスケーラブルなin vitroモデルが必要です。パルミチン酸誘導AML-12細胞系を用いることで、プラティコジンDによる酸化ストレスおよびオートファジー調節の定量的解析が可能となり、ターゲットエンゲージメントに対する予測的な信頼性が向上します。このアプローチは、代謝性疾患プログラムにおけるメカニズム評価とポートフォリオの選別を効率化します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- NAFLDにおける酸化ストレスおよびオートファジー経路を標的とする候補化合物の機能的検証を可能にします。
- ROSおよびオートファジーマーカーの変動を定量化することで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 代謝性疾患の文脈において、伝統医学由来の活性物質に関する迅速な仮説検証を促進します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- NAFLDに関連するエンドポイントに対する化合物スクリーニングのための、再現性と拡張性のある細胞ベースのプラットフォームを提供します。
- ROS、ミトコンドリア膜電位、およびオートファジーマーカーの定量的リードアウトを提供します。
- アッセイ条件の標準化を可能にし、研究間の比較可能性およびダウンストリームのスクリーニングワークフローを実現します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- in vitroでの知見を、NAFLDで観察される疾患に関連した酸化およびオートファジーのメカニズムと整合させる。
- 前臨床モデルの選択およびバイオマーカーの優先順位付けに情報を与えることで、トランスレーショナルな連続性をサポートする。
- 動物モデルへの投資に先立ち、初期段階の生物学的リスクを低減する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このin vitroモデルは、初期探索からリード化合物特定に至る一連の流れに位置づけられ、前臨床のin vivo研究に先立つメカニズムのスクリーニングおよびターゲットバリデーションを可能にします。
- 探索生物学：酸化ストレスおよびオートファジーに対する化合物の影響を定量化し、パスウェイの関与を明らかにする。
- スクリーニング：ROSおよびオートファジーマーカーアッセイを標準化し、再現性のある化合物評価を可能にする。
- 解析：処理群の統計的比較のために、定量的な蛍光出力およびウェスタンブロットの結果を提供する。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床バリデーションのためのバイオマーカー選択およびメカニズム仮説に情報を提供する。
- 企業における再利用：多様なNAFLD標的介入を評価するための、再利用可能な細胞ベースのプラットフォームを提供する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットエンゲージメントおよびメカニズム仮説における予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：初期段階のNAFLDアッセイにおける標準化、再現性、およびスケーラビリティを強化する。
- 戦略的価値：動物モデルへの依存度を低減し、go/no-go判断および資本配分を改善する。
- ポートフォリオへの影響：代謝疾患パイプラインにおける候補化合物のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 細胞培養、蛍光顕微鏡観察、およびウェスタンブロッティングの専門知識が必要です。
- イメージングシステムおよび定量分析インフラへのアクセスが必要です。
- プローブ濃度およびアッセイ条件について、チーム間での標準化が求められます。
- 他の肝細胞モデルや代謝細胞モデルに適用する場合、最適化が必要になることがあります。
- 蛍光プローブの濃度は、コントロール群のシグナルレベルに基づいて最適化が必要な場合があります。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:58
Pretreatment of AML-12 Cells for In Vitro NAFLD Model
2:32
Measuring the Change in ROS Production and Mitochondrial Membrane Potential
4:05
Measuring the Protein Expression Levels of LC3-II/LC3-I and p62/SQSTM1
5:59
Results: Effects of Platycodin D on Intracellular ROS, MMP Depolarization, and Protein Expression Levels in AML-12 Cells
7:49
Conclusion
