Name: クニダリアンモデル系Exaiptasia diaphanaにおけるクロマチン免疫沈降 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法でExaiptasia diaphanaのエピゲネティック制御を研究する方法。組織の高い粘液産生や水分比率の課題に対応した最適化プロトコルにより、共生刺胞動物の環境応答メカニズムを解明できます。

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上記のプロトコールに従って、得られたDNAをChIP-qPCRおよびChIP-Seqに成功裏に使用しました。H3K4me3については、以前に他の生物から報告されたものと同じ一般的なピークプロファイル26,27,28がここで得られ、ChIP-qPCRではTSS付近が最も高いピークと予想される部位で高い濃縮が見られました。ChIP-Seqデータにおけるマルチプルマッピングリードの数が比較的多いのは、PCRの重複が原因である可能性があります。DNAライブラリ調製プロトコルを変更してPCRの重複を減らすことで、一意にマッピングされたリードの量を増やすことができます。ChIP-qPCRデータにはいくつかの正規化方法があり、ここで紹介するインプット法の割合がより一般的に使用されています。この方法では、IP サンプルとモック サンプルが入力に直接正規化されますが、ChIP 中に入力が IP サンプルやモック サンプルとは異なる方法で処理されるため、エラーが発生する可能性があります。別のフォールドエンリッチメント法は、同じプライマーセットを使用してモックのシグナルに基づいてIPのシグナルを正規化し、シグナル対バックグラウンドの比率を与えます。ただし、モックサンプルの信号強度は大きく異なる場合があり、それがデータに大きな影響を与えます。ChIP-qPCRとデータ標準化の詳細については、Haring et al.29を参照してください。
一般的なChIPプロトコルと比較した上記の方法の主な調整点は、ヒストンタンパク質の約15分から一晩のインキュベーションまでの架橋時間がはるかに長いことです。この調整の主な目的は、固定ホルムアルデヒドが粘液層を通ってE.diaphanaのより深い組織に浸透するのを促進し、核内のタンパク質-DNA相互作用を維持することです。このステップの最適化は、超音波処理によるクロマチンのせん断が効果を失わないように、タンパク質-DNA相互作用を保存するための十分な架橋を確保するために重要です。SDSなどの洗剤を添加すると、超音波処理効率も向上させることができます29。さらに、ホルムアルデヒドとの長時間のインキュベーションにより、均質化ステップが容易になり、架橋ステップの前に均質化された新鮮または凍結のアネモネと比較して、より細かく均一に粉砕されたサンプルが得られることがわかりました。フラグメント長の推奨範囲は、100 bpから1,000 bp29,30の間で変化し、標的タンパク質によって異なる場合があります。過剰超音波処理はタンパク質を変性させ、したがってIP31に影響を与える可能性があるため、各ユーザーは、できるだけ少ない超音波処理力で目的のフラグメント長に到達するために超音波処理条件を最適化することが重要です。ChIPのもう一つの制限は、必要な材料の量であり、これは特にイソギンチャクのような比較的小さな生物に影響を及ぼします。この問題は、ステップ間のサンプルの損失を減らすことで解決されました。サンプルをホモジナイズした後、すぐに溶解したため、いくつかの一般的な核調製ステップが省略されました。20種類のイソギンチャクから得られたサンプルプールには、通常、3つのIPとモックコントロールとインプットコントロールの両方に十分なクロマチンが含まれていました。出発物質の量(すなわち、イソギンチャクの数)は、特に標的タンパク質を1つだけでChIPを行う場合、将来さらに減少する可能性があります。目的のダウンストリーム方法に応じて、コントロールを調整する必要があります。ChIP-qPCRの場合、追加のコントロール29を含むことを考慮すべきであるが、一方、ChIP-seqの場合、モックは入力コントロールを優先して省略することができる。
抗体の検証はこのプロトコールの範囲外であるため、ここでは簡単に触れただけですが、ChIPを実施する前の重要なステップです。特に、無脊椎動物種に市販の抗体を使用する場合、目的の標的に対する特異的抗体の利用可能性が制限となる可能性があります。最初のステップでは、 E. diaphana とゼブラフィッシュやマウスなどの他のモデル生物のH3 N末端尾部配列を比較し、高度に保存されていることを発見しました12。次に、抗体特異性を免疫蛍光法を用いて試験し、核酸と抗体のシグナルを共局在化させました。シーケンシングデータから得られたTSS周辺のH3K4me3のピークプロファイルは、抗体の特異性についてさらに確信を与えてくれます。
抗体特異性に関する別の考慮事項は、 E. diaphanaや他の多くのアントゾアンが細胞内で宿主とする共生渦鞭毛藻類との相互作用の可能性です。 Lingulodinium32 属および Symbiodinium33 属の渦鞭毛藻類におけるトランスクリプトーム解析により、コアヒストンH3およびいくつかのH3変異体を含むヒストンをコードする遺伝子が低発現レベルで発見されており、ヒストンコードの機能保存の程度は不明である34。MarinovとLynch34 は、渦鞭毛藻種内および渦鞭毛藻種間のH3変異体N末端尾部の配列保存を比較し、 Symbiodiniaceae 種は、特に隣接するアミノ酸とリジン4の一致を因子として考慮した場合に、尾部配列のリジン4の周囲に高い分岐を示しました。また、この領域は、 シロイヌナズナ、 ショウジョウバエ・メラノガスター、 Saccharomyces cerevisiaeなどの他のモデル種とは異なることも示されており、 これらはE. diaphana12の配列と一致しています。したがって、H3K4me3に対する抗体と渦鞭毛藻H3との意図しない相互作用のリスクは低いです。さらに、配列は E.diaphana ゲノムにのみアラインメントされており、qPCRプライマーは E.diaphana 配列に特異的であるべきであり、意図せずに沈殿した配列のろ過の追加層を提供します。
提示されたChIPプロトコルは、qPCRおよび次世代シーケンシングに十分なDNAを採取し、各ユーザーによる個別の最適化が必要になる可能性がありますが、おそらく共生と環境変化の文脈で、底生刺胞動物におけるタンパク質-DNA相互作用の研究を増やすための出発点を提供します。

気候変動に関する政府間パネル(IPCC)による2022年の報告書は、意識の高まりと緩和努力にもかかわらず、ますます激しく頻繁な海洋熱波により、サンゴ礁が今後数十年以内に大規模な白化と大量死亡のリスクにさらされていることを強調しています1。サンゴ礁の保全と回復の取り組みに情報を提供するために、環境条件の変化が底生刺胞動物に及ぼす現在および予測される影響を複数の生物学的レベルで調査し、応答と回復力の根本的なメカニズムを理解しています2。
この課題に対応するためには、底生刺胞動物に適用可能な調査ツールの利用可能性が重要であり、これらのツールの開発には、他の分野で確立された知識と技術を海洋生物に移転するための積極的な努力が必要です3。多くのサンゴ種を扱う際の障害は、イソギンチャクExaiptasia diaphana(一般にAiptasiaと呼ばれる)4などのモデルシステムを使用することで部分的に軽減されます。これらの急速に成長し、通性共生性のイソギンチャクは、実験室での飼育が比較的容易で、有性生殖と無性生殖の両方で、炭酸カルシウムの骨格を欠いています5。E. diaphanaのオープンアクセスリファレンスゲノム5は、シーケンシングを必要とするエピジェネティックな方法の使用を容易にします。しかし、水分含有量が高いこと、粘液が産生されること、個体当たりの組織量が少ないことなどの特徴は、複製可能なプロトコルの確立に対する課題であり、したがって、E. diaphana や同様の特徴を持つ他の刺胞動物のエピジェネティックな研究を抑制しています。
エピジェネティックな修飾は、クロマチン関連プロセスを調節することにより、生物のゲノムヌクレオチド配列を変更することなく表現型を変更することができます6。クニダリアンのエピジェネティックな制御は、主に進化の歴史と発達の文脈で研究されています7,8,9,10、共生の確立と維持11,12,13、および環境変化への応答14,15の文脈で研究されています.具体的には、温暖化13や海洋酸性化16などの環境条件の変化に応じて、ほとんどの場合、シトシン塩基へのメチル基の付加を伴うDNAメチル化のパターンの変動が観察されている。DNAメチル化パターンは世代間で遺伝することも示されており、環境ストレス要因に対するサンゴの順応におけるエピジェネティクスの役割を強調しています17。DNAメチル化と比較して、刺胞動物におけるノンコーディングRNA11,18,19、転写因子9,10、ヒストン翻訳後修飾(PTM)など、他の重要なエピジェネティックな調節因子に関する研究は比較的少ないです20。DNA関連タンパク質の研究は、利用可能な方法が研究生物の参照ゲノムへのアクセスを必要とし、サンプルサイズが大きく、特異性が高い抗体が必要であるため高価であるため、特に要求が厳しいです3。特定のヒストン残基にPTMを形成する化学基は多種多様であるため、刺胞動物のクロマチン修飾ランドスケープを理解することは、特に差し迫った環境ストレスの状況下で、依然として大きな課題です。
この研究の目的は、サンゴモデル E.diaphana (Bodegaらによるオリジナルプロトコル21)に最適化されたクロマチン免疫沈降(ChIP)プロトコルを提示することにより、刺胞動物におけるヒストンPTM、ヒストン変異体、およびその他のクロマチン関連タンパク質の研究を進めることです。ChIPは、定量PCRと組み合わせて遺伝子座特異的なタンパク質-DNA相互作用を特徴付けたり、次世代シーケンシング(NGS)と組み合わせてこれらの相互作用をゲノム全体にマッピングすることができます。一般に、タンパク質とDNAは可逆的に架橋されているため、目的のタンパク質(POI)は in vivoで結合しているのと同じ遺伝子座に結合したままです。哺乳類モデルシステムで広く使用されている一般的な架橋法は、通常、室温で15分以下に保たれていますが、架橋法は、ホルムアルデヒドが E.diaphana によって生成された粘液をより効果的に浸透できるように最適化されました。次に、組織を液体窒素で瞬間凍結し、均質化し、溶解して細胞から核を抽出します。これらのステップでの材料の損失は、1つの溶解バッファーのみを使用し、その後直接超音波処理に移り、クロマチンを~300 bpの長さのフラグメントに断片化することで回避できます。これらのフラグメントは、POIに特異的な抗体とPTMレベルの精度でインキュベートされます。抗体-タンパク質-DNA免疫複合体は、一次抗体に結合する磁気ビーズを使用して沈殿するため、POIに関連するDNAセグメントのみが選択されます。クロスリンク反転と沈殿物のクリーンアップ後、得られたDNAセグメントは、セグメントを参照ゲノムにマッピングするためのシーケンシングのためのqPCRまたはDNAライブラリ構築に使用でき、したがって、POIが関連付けられている遺伝子座を同定できます。各ステップの考慮事項の詳細については、Jordán-PlaおよびVisa22をご覧ください。

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド溶液 (w/v)、メタノールフリー</td><td>Thermo scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>5 mL チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock チューブ</td><td>Quantabio</td><td>2302820</td><td>Phase lockゲル - 軽い</td></tr><tr><td>AGANIの針25 G</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie</td><td></td><td></td><td>open source, available from</td></tr><tr><td>https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml Branson sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td><td>Sonicator&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>15 mLおよび1.5 mLチューブ用ローター付き</td></tr><tr><td>ChIPグレード抗体(ここではポリクローナルH3K4me3抗体)</td><td>Diagenode</td><td>C15410003</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTAフリープロテアーゼ阻害剤</td>カクテル<td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td>100xストック用水2錠/mL カバー</td></tr><tr><td>ガラス</td><td>vwr</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てヘラ</td><td>vwr</td><td>80081-188</td><td></td></tr><tr><td>DNA精製キット(ここではQIAGEN QIAquick PCR精製キット)</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Dounce tissue grinder</td><td>Wheaton</td><td></td><td>tight sptle</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1x</td><td>gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>臭化</td><td></td><td></td><td></td>エチジウム</tr><tr><td>FASTQC v0.11.9</td><td></td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ ドキュメンテーションシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td>ゲルイメージングシステム</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F ツベルクリンシリンジ 1 mL</td><td>B. Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>リニアアクリルアミド (5 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>ローリテンション 1.5 mL チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用</td><td>磁気分離ラック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モデルベース Analysis of ChIP-Seq (MACS)</td><td></td><td></td><td>オープンソース</td></tr><tr><td>Mortar and pestle, porcelain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c spectrophotometer</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61739</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール混合物 (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K (20 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>パープルローディング染料 6x</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase Cocktail Enzyme Mix</td><td>Invitrogen</td><td>AM2286</td><td>RNase A = 500 U/mL, RNase T1 = 20000 U/mL</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>TAE バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>危険:癌を引き起こす可能性があります。生殖能力または胎児に損傷を与える疑いがある</td></tr><tr><td>チューブローテーター SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Solution, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

クニダリアンモデル系exaiptasia diaphanaにおけるクロマチン免疫沈降

Chromatin Immunoprecipitation in the Cnidarian Model System Exaiptasia diaphana

ヒストン翻訳後修飾(PTM)およびその他のエピジェネティックな修飾は、転写機構に対する遺伝子のクロマチンアクセシビリティを調節し、環境刺激に対する生物の応答能力に影響を与えます。クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)の組み合わせは、エピジェネティクスおよび遺伝子調節の分野でタンパク質-DNA相互作用を同定し、マッピングするために広く利用されています。しかし、刺胞動物のエピジェネティクスの分野は、共生イソギンチャク Exaiptasia diaphanaのようなモデル生物のユニークな特徴が一因であり、その高い含水率と粘液量が分子法を阻害するなど、適用可能なプロトコルの欠如によって妨げられています。ここでは、 E. diaphana 遺伝子制御におけるタンパク質-DNA 相互作用の研究を容易にする特殊な ChIP 手順を示します。架橋およびクロマチン抽出ステップは、効率的な免疫沈降のために最適化され、その後、ヒストンマークH3K4me3に対する抗体を用いてChIPを行うことでバリデーションされました。その後、定量的PCRを用いていくつかの恒常的に活性化された遺伝子座周辺のH3K4me3の相対占有率を測定し、ゲノムワイドスケール解析のための次世代シーケンシングにより、ChIPアッセイの特異性と有効性を確認しました。共生イソギンチャクE . diaphana に最適化されたこのChIPプロトコルは、サンゴなどの共生刺胞動物に影響を与える環境変化に対する生物の応答に関与するタンパク質-DNA相互作用の研究を容易にします。

上記のプロトコールに従って、ヒストン3リジン4(H3K4me3)のトリメチル化に関連するDNAを免疫沈降させた。ChIP-seqグレードの抗体は、以前にイソギンチャク Nematostella vectensis7 に使用されていましたが、ここでは E. diaphana 組織切片の免疫蛍光染色によって検証されました(図3)。DNA収量はインプット材料の量によって異なりますが、通常は約100 ng/μLでした。得られたDNA断片をシーケンシングとqPCR( 補足ファイル1のプライマーリスト)により解析しました。
シーケンシング深度 4,000 万リードでは、~1,760 万の一意にマッピングされたリードが得られました。品質チェックの後、生のリードをトリミングし、Bowtie24を使用してE.diaphanaゲノムにマッピングしました(材料の表を参照)。MACSを用いたChIP-Seqデータのモデルベース解析(資料表参照)により、合計19,107のピークが同定された25。H3K4me3では予想通り、ほとんどのピークが転写開始部位(TSS)付近にあり、TSSの両側、特に遺伝子本体に向かってピークカウント頻度が急激に減少しました(図4)。
シーケンシングデータから、TSSの周囲に高いピークを持つ3つの遺伝子を同定し、これらの遺伝子内の高いピークのいくつかの遺伝子座を標的とするようにqPCRプライマーを設計しました。qPCRデータは、インプットメソッドの割合を使用して正規化しました(図5)。H3K4me3 のインプットおよびモックコントロールに対する高い濃縮度が観察されました。インプットの割合は2.7%から10.7%の間で変動し、遺伝子間および同じ遺伝子内の異なる遺伝子座間で濃縮度の違いが観察されました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig03v2.jpg"> 図3:H3K4me3の免疫蛍光染色。E. diaphana組織切片を、(A)青色のHoechst核酸染色剤および(B)H3K4me3に対する一次抗体に対する黄色の蛍光色素標識二次抗体で染色した。(C)原子核内での共局在を示すAとBの重なり。スケールバー = 20 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig4v2.jpg"> 図4:転写開始部位付近のピークカウント頻度が高い。 転写開始部位(TSS)の周りの上流(-)と下流(+)2,000bpにわたるH3K4me3修飾のピークカウント頻度の分布。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64817/64817fig05.jpg"> 図5: Exaiptasia diaphanaにおけるH3K4me3 ChIP-qPCR。 結果は、入力に対する割合 (%) で表されます。各遺伝子(AIPGENE12312、AIPGENE26042、およびAIPGENE5950)の転写開始部位付近の遺伝子座をChIP-qPCRに選択しました。エラーバーは、反復間の標準偏差(n = 3)を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/64817fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:qPCRに使用したプライマーのリスト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64817/ChIP_JoVE_SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

モデル生物 Exaiptasia diaphana のヒストンマークH3K4me3に対するクロマチン免疫沈降(X-ChIP)アッセイが提示されます。アッセイの特異性と有効性は、定量的PCRと次世代シーケンシングによって確認されます。このプロトコルにより、イソギンチャク E.diaphanaのタンパク質-DNA相互作用の研究を増やすことができます。

クニダリアンモデル系Exaiptasia diaphanaにおけるクロマチン免疫沈降

Histone post-translational modifications (PTMs) and other epigenetic modifications regulate the chromatin accessibility of genes to the transcriptional ...

アイプタシアでChIP-seqプロトコルを確立することは、共生刺胞動物のエピジェネティックなランドマークと、これらが生物の環境との相互作用をどのように制御するかを調査するための最初のステップです。このプロトコールは、架橋時間を長くし、組織の損失を最小限に抑えることにより、高い粘液産生や高い水分対組織比など、刺胞動物の困難な特徴に対処するために最適化されています。イソギンチャクを15ミリリットルのチューブに集め、チューブの底に落ち着かせます。あるいは、室温で数秒間遠心分離機で回転させ、最大3, 500 gまで回転させます。その後、真空ポンプで余分な海水を取り除きます。アネモネをDPBSに懸濁して洗います。そして、洗浄後にDPBSを取り外します。ピンセットまたはプラスチック製のヘラを使用して、余分なバッファーを使わずに、アネモネを0.5%架橋バッファーに移します。それらを回転子で1分間12回転、摂氏4度の速度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、イソギンチャクを含むチューブから0.5%架橋バッファーを取り出します。チューブに1%架橋バッファーを補充します。そして、ローテーターで毎分12回転、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、1%架橋バッファーを除去した後、イソギンチャクをクエンチバッファーに懸濁し、懸濁液をローテーター上で12回転/分、摂氏4度で20分間インキュベートすることにより、架橋反応をクエンチします。次に、クエンチングバッファーを取り外し、アネモネをDPBSで2回洗浄します。DPBSをデカントします。そして、イソギンチャクを紙のティッシュに空にして、できるだけ多くの液体を取り除きます。モルタルに液体窒素を注ぎ、ピンセットを使用してイソギンチャクを移します。乳棒を使用して、組織を慎重に分割することから始めます。霜取りを防ぐために、必要に応じて液体窒素を補充し続けます。サンプルが微粉末になるまで粉砕を続けます。スパチュラを使用してサンプルを採取し、溶解バッファーに移し、サンプルがバッファーに溶解することを確認します。サンプルを氷の上に1分間置いてから、反転して混合します。次に、ダウンスティッシュグラインダーを溶解バッファーで洗浄した後、サンプルを移し、きつい乳棒で20〜30回ダウンスします。サンプルをチューブに戻します。そして、ローテーターで毎分14回転、摂氏4度で一晩インキュベートします。針をチューブの底から1センチメートル上に置き、壁に触れないようにして、サンプルをソニシエーターに入れます。ソニシエーターを起動し、サンプルに泡が生成されていないことを確認します。出力電力をゆっくりと2に増やし、さらに2分間超音波処理します。その後、ソニシエーターのスイッチを切り、出力電力をゼロに戻し、サンプルを休ませて2分間冷まします。サンプル量と計画する免疫沈降(IP)の数に応じて、10%Triton X-100および100X Protease Inhibitor Cocktail(PIC)をそれぞれ1%および1Xの最終濃度に追加して、総サンプル量を増やします。各IPの容量を、クロマチン免疫沈降(ChIP)用の個別の低保持1.5ミリリットルチューブに移し、続いて定量PCR(qPCR)を行います。モックコントロールとして、サンプルの等量を別の1.5ミリリットルチューブに入れます。IPのボリュームの10%を入力コントロールとして、摂氏マイナス20度で保存します。各 IP に 4 マイクログラムの抗体ヒストン 3 リジン 4 トリメチル化 (H3K4 トリメチル化) を追加しますが、モックには追加しません。IP反応とモックをチューブローテーターで一晩、毎分12回転、摂氏4度でインキュベートします。ピペットチップの先端を切り取って直径を広げます。また、50マイクロリットルの磁気ビーズを、IPごとに1本、モック用に1本ずつ、別々のチューブに移します。各チューブに1ミリリットルのブロッキング溶液を追加します。そして、前と同じように、それらをローテーターで30分間インキュベートします。ピペットを使用して、ブロッキング溶液の上清を取り除いて廃棄し、IPまたは模擬反応で壁からビーズを洗い流します。サンプルが入ったそれぞれの低保持チューブにミックスを戻します。前と同じように、すべてのチューブを3時間インキュベートします。インキュベーション後、IPとモックを磁気ラックに置き、磁石が分離するまで約10〜20秒待ちます。上清を捨て、低塩で1ミリリットルの洗浄緩衝液を追加します。チューブを前回と同様に5分間インキュベートした後、チューブを磁気ラックに戻します。低塩で洗浄バッファーを取り除きます。高塩分を含む1ミリリットルの洗浄バッファーを加え、さらに5分間インキュベートします。ピペットを使用して上清を取り出して廃棄し、1ミリリットルのTE塩緩衝液で洗浄します。もう一度洗浄を繰り返し、チューブキャップからビーズを洗い流します。2回目のTE塩緩衝液洗浄液を廃棄した後、各反応に210マイクロリットルの溶出緩衝液を加えます。磁気ビーズを懸濁し、摂氏65度で溶出させ、毎分700回転で15分間振とうします。反応液を磁気ラックに置き、溶離液を回収して、新しい1.5ミリリットルのチューブに入れます。次に、フリーザーからインプットを取り出し、溶出バッファーを合計420マイクロリットルまで追加します。すべての溶離液とインプットを逆架橋し、摂氏65度でインキュベートし、毎分700回転で一晩中インキュベートします。RNA消化のためには、10マイクロリットルのRNaseカクテルを加え、摂氏42度、毎分700回転で30分間インキュベートします。タンパク質の消化には、8マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏55度、毎分700回転で1時間インキュベートします。ドラフトの下に、1つのサンプルと同量のフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール混合物を各フェーズロックゲルチューブに加えます。チューブを激しく振って、泡立つ白い層が形成されるまで、チューブを短時間渦巻きにします。摂氏4度と20, 000 gで10分間回転させます。水相が透明であることを確認してください。ピペットを使用して水相を新しいチューブに移します。サンプル量の2倍に相当する100%エタノールを加えて振とうします。マイナス20°Cで一晩、またはマイナス80°Cで30分間インキュベートします。サンプルを15, 000 gで30分間回転させることにより、DNAをペレット化します。慎重に、上清をデカントし、ペレットを1ミリリットルの70%エタノールで洗います。最高速度で5分間、摂氏4度で回転します。ピペッティングですべてのエタノールを除去する前に、慎重にデカントします。ペレットを30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。ヒストン3リジン4、またはH3K4のトリメチル化に関連するDNAを免疫沈降させ、E.diaphana組織切片を免疫蛍光染色により染色しました。得られたDNA断片をシーケンシングとqPCRにより解析した。ChIP-seqデータのモデルベース解析により、19, 107のピークが同定されました。H3K4トリメチル化について予想されたように、ほとんどのピークは転写開始部位(TSS)の近くに位置しており、ピークカウント頻度はTSSの両側、特に遺伝子体に向かって急激に減少しました。qPCRプライマーは、3つの遺伝子のそれぞれのTSS近くのいくつかの遺伝子座を標的とするように設計されました。インプットコントロールおよびモックコントロールと比較して、H3K4トリメチル化の高い濃縮が観察されました。インプットの割合は2.7〜10.7%の間で変動し、濃縮度は遺伝子間および同じ遺伝子内の遺伝子座によって異なりました。うまくいけば、気候危機によって引き起こされた環境変化に応じた刺胞動物のエピジェネティックな調節を理解することで、サンゴ礁の保全と回復の取り組みに役立つ可能性があります。

chromatin-immunoprecipitation-cnidarian-model-system-exaiptasia

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

出典:Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.

ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

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シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

私たちは、 カタユウレイボヤにマイクロインジェクションやエレクトロポレーション技術を使用して、脊椎動物への脊索動物の姉妹グループを、一過性遺伝子導入および遺伝子ノックダウンを提示します。このような方法は、脊索とヘッド感覚上皮、およびヒト疾患関連遺伝子の多くのオルソログを含む脊椎動物の基本的な特性を備えています。この単純な無脊椎動物における機能ゲノミクスを容易にします。...

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

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クニダリアンモデル系Exaiptasia diaphanaにおけるクロマチン免疫沈降

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