Name: インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶ背根神経節のカルシウムイメージング法。Pirt-GCaMP3マウスを用いて最大1,800個の一次感覚ニューロンを同時観察し、機械的・熱的刺激に対する神経応答をリアルタイムで可視化する。この技術は疼痛過敏症や異常性疼痛の治療介入研究に適している。

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この研究は、国立衛生研究所の助成金R01DE026677およびR01DE031477(Y.S.K.)、UTHSCSA startup fund(Y.S.K.)、およびテキサス大学システム(Y.S.K.)からのライジングスター賞によってサポートされました。

<ol><li>Rivero-Melián, C., Grant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lumbar+dorsal+root+fibers+in+the+lower+thoracic+and+lumbosacral+spinal+cord+of+the+rat+studied+with+choleragenoid+horseradish+peroxidase+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate.</a> The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).</li>
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<li>Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+further+loss+of+dorsal+root+ganglion+cells+after+axotomy+in+p75+neurotrophin+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).</li>
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<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjacent+intact+nociceptive+neurons+drive+the+acute+outburst+of+pain+following+peripheral+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).</li>
<li>Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+in+vivo+recording+of+sensory+neuron+activity+with+GCaMP6%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6.</a> eNeuro. 5 (1), (2018).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+distinct+modality-specific+subsets+of+somatosensory+neurons+using+GCaMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP.</a> Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).</li>
<li>Ishida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+visualizes+incision-induced+primary+afferent+sensitization+and+its+amelioration+by+capsaicin+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>MacDonald, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+cold-sensing+neurons+contribute+to+cold+allodynia+in+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain.</a> Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).</li>
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<li>Kucharczyk, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+bone+cancer+on+the+peripheral+encoding+of+mechanical+pressure+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli.</a> Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).</li>
<li>Kim, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+phosphoinositide-binding+protein%2C+functions+as+a+regulatory+subunit+of+TRPV1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1.</a> Cell. 133 (3), 475-485 (2008).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+terminal+sensitization+of+TRPV1+by+descending+serotonergic+facilitation+modulates+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain.</a> Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mahadevan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoNet%3A+Spatiotemporal+network+analysis+of+cell+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities.</a> PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+representation+of+taste+quality+at+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The neural representation of taste quality at the periphery.</a> Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).</li>
<li>Leijon, S. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+thermosensing+by+murine+trigeminal+neurons%3A+modulation+by+capsaicin%2C+menthol+and+mustard+oil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil.</a> The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
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<li>Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+cutaneous+temperature+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The coding of cutaneous temperature in the spinal cord.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).</li>
<li>Yarmolinsky, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+and+plasticity+in+the+mammalian+thermosensory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system.</a> Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).</li>
<li>Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+chronic+pain+of+predominantly+neuropathic+origin.+Results+from+a+general+population+survey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey.</a> The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).</li>
<li>Shannonhouse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meclizine+and+metabotropic+glutamate+receptor+agonists+attenuate+severe+pain+and+Ca%282%2B%29+activity+of+primary+sensory+neurons+in+chemotherapy-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).</li>
<li>Luiz, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+sensing+by+Na%28V%291.8-positive+and+Na%28V%291.8-negative+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
<li>Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+pain+from+facial+skin+and+oral+mucosa%3A+Unique+neurobiology+and+challenging+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).</li>
<li>Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin-1+mutations+increase+levels+of+ryanodine+receptors+and+calcium+release+in+PC12+cells+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).</li>
<li>Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G-protein+signaling+in+receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulators of G-protein signaling in receptor complexes.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).</li>
<li>Yoshihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca%282%2B%29+responses+in+the+spinal+dorsal+horn+by+noxious+stimuli+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).</li>
<li>Tan, C. H., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRPM2+ion+channel+is+required+for+sensitivity+to+warmth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth.</a> Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).</li>
<li>Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+electric+signals+with+genetically+targeted+voltage-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+recording+of+neural+spikes+in+awake+mice+and+flies+with+a+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor.</a> Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).</li>
<li>Harada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+protein-based+cAMP+indicator+applicable+to+optogenetics+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

持続的な痛みはさまざまな障害に存在し、約8%の人々の生活の質を衰弱および/または低下させます29。一次感覚ニューロンは皮膚の有害な刺激を検出し、その可塑性は持続的な痛みに寄与します8。ニューロンは細胞培養や外植片で研究することができますが、そうすることで通常の生理学的状況からニューロンが取り除かれます。DRGの外科的曝露とそれに続くPirt-GCaMP3Ca2+イメージングにより、後肢に加えられた刺激を使用して、通常の生理学的状況で一次感覚ニューロンの研究が可能になります。Ca2+イメージングのこの方法の主な利点は、多数のニューロンを同時にモニターできることである。この方法は、モダリティ、ニューロン直径、および共役活性化10、11、12、13、14、15、16、<sup class="xref...

一次感覚ニューロンは皮膚を直接神経支配し、体性感覚情報を中枢神経系に運び戻します1,2。背根神経節(DRG)は、10,000〜15,000個の一次感覚ニューロンの細胞体クラスターです3,4。DRGニューロンは、多様なサイズ、髄鞘形成レベル、および遺伝子および受容体発現パターンを提示します。より小さい直径のニューロンは、疼痛感知ニューロンを含み、より大きな直径のニューロンは、典型的には、非疼痛の機械的刺激に応答する5、6。傷害、慢性炎症、末梢神経障害などの一次感覚ニューロンの障害は、これらのニューロンをさまざまな刺激に感作し、慢性疼痛、異痛症、および疼痛過敏症に寄与する可能性があります7,8。したがって、DRGニューロンの研究は、一般的な体性感覚と多くの痛みやかゆみの障害の両方を理解する上で重要です。
生体内で発火するニューロンは体性感覚に不可欠であるが、最近まで、生体内で無傷の神経節を研究するためのツールは比較的少数の細胞に限られていた9。ここでは、生体内の集団レベルでニューロンの活動電位または活動をアンサンブルとして研究するための強力な方法について説明します。この方法は、細胞質Ca2+ダイナミクスに基づくイメージングを採用しています。Ca2+高感度蛍光指示薬は、通常は低濃度の細胞質Ca2+のため、細胞活性を測定するための優れたプロキシです。これらの指標は、マウス9、10、11、12、13、14、15、16およびラット17における数百〜数千の一次感覚ニューロンの同時モニタリングを可能にした。この研究に記載されているin vivo Ca2+イメージングの方法は、機械的、低温、熱的、および化学的刺激に対する集団レベルの応答を直接観察するために使用できます。
ホスホイノシチド結合膜タンパク質であるPirtは、ほぼすべての(>95%)一次感覚ニューロン18,19で高レベルで発現しており、Ca2+センサーGCaMP3の発現を駆動して、in vivoでニューロンの活動をモニターするために使用できます20。このプロトコールでは、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM)を用いて、インビボDRG手術、Ca2+画像化、およびPirt−GCaMP3マウス14の右側腰椎5(L5)DRGにおける分析を行うための技術が記載されている。

<table><tbody><tr><td>Anased Injection (Xylazine)</td><td>Covetrus, Akorn</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC</td><td>Cal Zeiss</td><td>422642-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップ アプリケーター</td><td>McKesson</td><td>24-106-1S</td><td></td></tr><tr><td>湾曲止血</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>13007-12</td><td></td></tr><tr><td>DC 温度コントローラー</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC温度コントローラー加熱パッド</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>デュモンセラミックコーティング鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>FHC DC温度</td><td>コントローラーFHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso(イソフルラン)</td><td>MWI動物の健康、Piramalグループ</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>フリードマン・ピアソンRongeurs</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>ファイザー</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>ケタセット(ケタミン)</td><td>ゾエティス</td><td>KET-00002R2</td><td></td></tr><tr><td>発光グリーンステージテープ</td><td>JSITON/Amazon</td><td>B803YW8ZWL</td><td></td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 イソフルラン気化器</td><td>ミッドマーク</td><td>91305430</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖スプリングはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ばねはさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-5677</td><td></td></tr><tr><td>ミニ直腸サーミスタプローブ</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>手術ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Pirt-GCaMP3 C57BL/6J マウス</td><td>ジョンズホプキンス大学</td><td>N/A</td><td>どちらの性別も同じようにイメージできます。マウスは、若いマウスではピルトプロモーターの発現が弱いか断続的であるため、少なくとも8週齢である必要があります。.</td></tr><tr><td>SMALGO 小動物用高分子計</td><td>Bioseb In vivo 研究機器</td><td>BIO-SMALGO</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置フレーム</td><td>Kopf モデル 923-B 923-B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>td-Tomato C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>トッププレート、6インチ x 10</td><td>ニューポート</td><td>290-TP</td><td></td></tr><tr><td>TrpV1-Cre C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>17769</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス LSM 800 共焦点顕微鏡</td><td>Cal Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen 2.6 Blue Edition ソフトウェア</td><td>Cal Zeiss</td><td>Zen (Blue Edition) 2.6</td><td></td></tr></tbody></table>

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+イメージングは、活動電位および細胞質へのCa2+侵入または細胞内Ca2+貯蔵の放出を含む様々なシグナル伝達機構を含む細胞活動の代理として使用することができる。マウスの背根神経節(DRG)の一次感覚ニューロンのPirt-GCaMP3ベースのCa2+イメージングは、多数の細胞を同時に測定できるという利点を提供します。最大1,800個のニューロンをモニターできるため、ニューロンネットワークと体性感覚プロセスを、in vivoの集団レベルで通常の生理学的状況でアンサンブルとして研究できます。監視されるニューロンの数が多いため、他の方法では検出が困難な活動パターンを検出できます。刺激をマウスの後足に適用することができ、DRGニューロンアンサンブルに対する刺激の直接的な影響を研究することができます。Ca2+トランジェントを生成するニューロンの数とCa2+トランジェントの振幅は、特定の感覚様式に対する感受性を示しています。ニューロンの直径は、活性線維の種類(非侵害性メカノ線維と有害な疼痛線維、Aβ、Aδ、およびC線維)の証拠を提供します。特定の受容体を発現するニューロンは、Pirt-GCaMPと一緒にtd-Tomatoおよび特定のCreリコンビナーゼで遺伝的に標識することができます。したがって、DRGのPirt-GCaMP3 Ca2+イメージングは、痛み、かゆみ、触覚、およびその他の体性感覚信号を研究するための集団レベルでアンサンブルとして機能する特定の感覚モダリティおよびニューロンサブタイプの分析のための強力なツールとモデルを提供します。

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64826/64826fig04.jpg"> 図4:Pirt-GCaMP3マウスのL5後根神経節の代表的な画像。 (A,D)Pirt-GCaMP3マウスのL5後根神経節の単一フレーム高解像度スキャンが示されている。(B,E).刺激がない場合の、パネルAおよびパネルDからのそれぞれ15フレームのPirt-GCaMP3 L5 DRG神経節の平均強度投影。自発的なCa2+トランジェントを産生したいくつかのニューロンは、黄色の矢印で呼び出されます。(C)100 g後足プレス中のパネルAからの刺激前の2フレームと5フレームすべての刺激の平均強度投影。刺激中にCa2+トラン...

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+ イメージングした。

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...

この方法を使用して監視されるニューロンの数は、古い方法または他の方法では不可能であろうニューロンネットワークデータの収集を可能にする。この技術の主な利点は、後足に加えられた刺激に直接反応して、一度に約2, 000の一次感覚ニューロンを監視できることです。この手順は、末梢性異痛症および疼痛過敏症の治療的介入の研究に特に適しています。この方法は、三叉神経節または膝状神経節の研究に適合させることができ、またはサイクリックAMPなどの電圧または細胞シグナル伝達分子用の遺伝的にコードされたセンサーとともに使用することができます。この手術を行うには練習が必要です。1匹の動物で最大6つの背側根神経節で練習できます。手順のデモンストレーションは私自身であり、ジョン・シャノンハウスとルーベン・ゴメス氏の支援を受けます。まず、マウスを加熱パッドの上に置いて体温を摂氏37度に維持します。マウスの骨盤骨を感じて腰椎の肥大を見つけます。次に、腰椎肥大の領域より上でマウスの背中を剃ります。ハサミを使用して、腰椎の拡大の上に3面の長方形の切開を行い、鉗子で皮膚を折り畳みます。13ミリメートルのスプリング解剖はさみを使用して、脊椎の右側に3〜4ミリメートルの切開を行います。はさみを使用して皮膚と筋肉を側面に切り戻し、背骨を露出させます。次に、8ミリメートルのはさみを使用して、筋肉と結合組織を切り取り、右側のL5 DRGの横突起をきれいにします。綿またはゲルフォームを使用して血液を吸収することにより、出血を最小限に抑えるようにしてください。DRGに触れないように注意しながら、フリードマン-ピアソンロンジャーまたは強力な細かい鉗子を使用して右側のL5横突起を切り開きます。次に、マウスと加熱パッドをカスタムステージに移動します。ステージテープを使用して、動物と加熱パッドを所定の位置に固定します。動物の鼻をノーズコーンに入れて、イソフルランを継続的に麻酔します。右後足をステージから離れた位置に突き出して固定し、刺激を簡単に適用できるようにします。L5 DRGの吻側と尾側の椎骨または骨盤骨の皮膚にステージクランプで脊椎を所定の位置に固定します。クランプとステージを調整して、DRGの表面をできるだけ水平にします。次に、ステージを顕微鏡の下に置き、対物レンズが下げたときにDRGの真上8ミリメートルになるようにします。直腸体温計を挿入します。電力線を加熱パッドと直腸温度計に接続します。ノーズコーンをイソフルランガスラインに接続します。10x 0.4 DIC対物レンズとイメージング用の関連ソフトウェアを備えた正立共焦点顕微鏡を使用します。495ナノメートルの励起、519ナノメートルの発光、および500〜580ナノメートルの検出波長の緑色のFITCフィルター設定を使用します。顕微鏡下で、DRGの表面を見つけま

in-vivo-calcium-imaging-neuronal-ensembles-networks-primary-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Shannonhouse, J., et al.In vivo 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロン集団のカルシウムイメージング。J. Vis. Exp. （2023年).このビデオは、トランスジェニックマウスの後根神経節(DRG)のニューロン活動を監視するためのin...

マウスの無傷の背根神経節におけるニューロン群のin vivoカルシウムイメージング

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、...

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

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末梢神経刺激研究のためのin vivo胸部背根神経節(DRG)カルシウムイメージングとECG記録

このプロトコルは、無傷の三叉神経節(TG)ニューロンの in vivoGCaMPカルシウムイメージングを記述します。この説明には、TG 曝露手術、TG ニューロンの in vivo 共焦点顕微鏡イメージング、TG ニューロン顕微鏡イメージング中の体細胞刺激の適用、および in vivo GCaMP カルシウム イメージング...

インビボ 無傷の三叉神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

神経回路網の開発の自発的な活動は、カルシウム感受性インジケータ染料のAM...

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

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動物を振る舞う、覚醒中のシングルユニット記録のためにマイクロワイヤの組織化された配列を移植するための手順

学ぶ背根神経節のカルシウムイメージング法。Pirt-GCaMP3マウスを用いて最大1,800個の一次感覚ニューロンを同時観察し、機械的・熱的刺激に対する神経応答をリアルタイムで可視化する。この技術は疼痛過敏症や異常性疼痛の治療介入研究に適している。

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