Name: ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶゼラチンメタクリロイル（GelMA）ミクロゲルの製造・凍結乾燥・光アセンブリ法。粒状ヒドロゲル足場による3Dバイオプリンティング技術と組織工学への応用可能性を探索する。

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著者らは、ペンシルベニア州立大学(ペンシルベニア州立大学)の化学工学科の研究支援スペシャリストであるT.ポンド、ペンシルベニア州立大学のナノファブリケーションラボのスタッフ、およびナノファブリケーションプロセスに関する支援と議論を提供してくれたPartillion BioscienceのJ.デルッテ博士に感謝します。A. Sheikhiは、材料研究所(MRI)と工学部の人間レベルの材料問題シード助成金、生活多機能材料システムのためのコンバージェンスセンター(LiMC2)とクラスターオブエクセレンスリビング、適応およびエネルギー自律材料システム(livMatS)リビング多機能材料共同研究シード助成プログラム、およびペンシルベニア州立大学からのスタートアップ基金の支援を認めています。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)によって、賞番号R56EB032672で部分的にサポートされました。

<ol><li>Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgel+assembly%3A+Fabrication%2C+characteristics+and+application+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Ding, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+micro-flake+hydrogel+for+four-dimensional+living+cell+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting.</a> Advanced Materials. 34 (15), 2109394(2022).</li>
<li>Muir, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticking+together%3A+injectable+granular+hydrogels+with+increased+functionality+via+dynamic+covalent+inter-particle+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking.</a> Small. 18 (36), 2201115(2022).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+gradient+microgel+suspensions+for+spatial+control+of+differentiation+during+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication.</a> Advanced Healthcare Materials. , 2201122(2022).</li>
<li>Zoratto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+forming+microporous+gelatin+methacryloyl+hydrogel+scaffolds+from+thermostable+microgels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational%22%5BJournal%5D)">In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering.</a> Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).</li>
<li>Yuan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fused+granular+hydrogels+with+ultrastretchability%2C+strong+adhesion%2C+and+mutli-bioactivities+for+efficient+chronic+wound+care%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care.</a> Chemical Engineering Journal. 450, 138076(2022).</li>
<li>Ataie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoengineered+granular+hydrogel+bioinks+with+preserved+interconnected+microporosity+for+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting.</a> Small. 18 (37), 2202390(2022).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((25th+anniversary+article%3A+rational+design+and+applications+of+hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine.</a> Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).</li>
<li>Rajabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+on+bioprinted+gelatin+methacrylate-based+hydrogels+for+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair.</a> Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , 17/279,283 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic-enabled+bottom-up+hydrogels+from+annealable+naturally-derived+protein+microbeads%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads.</a> Biomaterials. 192, 560-568 (2019).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li>
<li>Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+of+microgel+scaffolds+with+tunable+void+fraction+to+promote+cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644(2021).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+microporous+hydrogels+formed+from+microgel+beads+with+orthogonal+thermo-chemical+responsivity%3A+Microfluidic+fabrication+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization.</a> MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).</li>
<li>Van Den Bulcke, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+rheological+properties+of+methacrylamide+modified+gelatin+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3d+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3d printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2019).</li>
<li>Claaßen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+substitution+of+gelatin+methacryloyl%3A+best+practice+and+current+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls.</a> Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).</li>
<li>Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , 17/425,027 (2022).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+fabrication+and+use+of+3d+structured+microparticles+spatially+functionalized+with+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules.</a> ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).</li>
<li>Charlet, A., Bono, F., Amstad, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+reinforcement+of+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical reinforcement of granular hydrogels.</a> Chemical Science. 13 (11), 3082-3093 (2022).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ゼラチンとその誘導体は、HMP製造に最も一般的に使用されるタンパク質ベースの生体材料です。スループットと粒子サイズの単分散性のトレードオフの課題は、ステップ乳化マイクロ流体デバイスを使用して克服できます。これらのデバイスは、変動係数が5%未満で、毎時4,000万個以上の液滴を形成することができます27。本稿では、GelMA溶液を含む液滴を微細加工し、その後、GelMA HMP、粉末、GHS、NGBに変換する方法について説明しました。
GelMAの熱応答性により、マイクロ流体対応のHMP製造と安定化が容易になります。UCSTよりも高い温度(例えば、37°C)では、GelMAは水溶液に溶解し、ステップ乳化装置における油中水型エマルジョン形成に適した水性流体を得る。温度を下げると(例えば、4°C)、液滴形成後の物理的架橋 を介して GelMA HMPを形成することができます。GelMA HMPは、さまざまなアプローチを通じてGHS製造のビルディングブロックとして使用できます。熱的に安定なHMPは、機械的に堅牢なGHSを形成...

HMPビルディングブロックを組み立てて組織工学の足場を形成することは、過去数年間で大きな注目を集めています1。HMPアセンブリを介して製造されたGHSは、個別のビルディングブロック間のボイドスペースに由来するセルスケールのマイクロ多孔性など、バルク対応物と比較して独自の特性を持っています。注入性、モジュール性、多孔性から分離された剛性などの追加の特性により、GHSは組織の修復と再生を強化するための有望なプラットフォームとなっています2。合成PEGベースのポリマー3,4およびアルギン酸5およびヒアルロン酸6,7などの多糖類を含む、異なる生体材料がGHS製造に使用されている。天然由来のポリマーの中で、GHS製造のための最も一般的なタンパク質ベースのバイオポリマーは、架橋性、生体適合性、生体接着性、および生分解性の生体材料であるGelMA 8,9,10,11です12,13。
HMPsは、バッチ乳化8、フローフォーカシング14、15またはステップ乳化9、11マイクロ流体デバイス、ブレンド16、または複雑なコアセルベーション17、18を介して作製することができる。通常、製造スループットとHMP単分散度の間にはトレードオフがあります。例えば、ブレンド技術により、不規則な形状で高度に分散したHMPが得られます。 バッチ乳化または複雑なコアセルベーションにより、大量の多分散球状HMPの製造が可能になります。 フローフォーカシングマイクロ流体デバイスは、変動係数が<5%の高度に単分散した液滴を製造するために使用されてきましたが、スループットは大幅に低くなっています。ステップ乳化マイクロ流体デバイスにおいて、高度に並列化されたステップにより、単分散HMP19のハイスループット製造が可能になる。
メタクリロイル修飾ゼラチン(GelMA)HMPビルディングブロックは、温度応答性および(光)化学的に架橋可能であり、容易なGHS製造を可能にする20。上限臨界溶解温度(UCST)21未満(例えば、4°C)に冷却すると、GelMA溶液を含む液滴は物理的に架橋されたHMPに変換されます。次に、これらのHMPビルディングブロックを外力(遠心分離など)を使用して充填し、詰まったミクロゲル懸濁液を生成します。隣接するHMP間に(光)化学的架橋を介して粒子間結合が確立され、機械的に堅牢なGHS14が形成されます。GHSの最も重要な特性の1つは、マイクロ多孔性であり、in vitroでの容易な細胞浸透11およびin vivoでの組織内殖の増強を可能にする22。HMPの三次元(3D)バイオプリンティングは、従来、密に充填されたミクロゲル懸濁液を用いて行われ、微多孔性を損なう23。
我々は最近、不均一に荷電したナノ粒子の吸着とそれに続くナノ粒子の可逆的自己組織化 を介した GelMAミクロゲルの界面ナノエンジニアリングに基づく新しいクラスの粒状バイオインクを開発しました。この戦略により、緩く充填されたミクロゲルのせん断収量と押出3Dバイオプリントが可能になり、積層造形されたGHS11のマイクロスケールの多孔性が維持されます。本稿では、ハイスループットのGelMA液滴作製、これらの液滴を物理的に架橋されたHMPに変換する方法、再懸濁可能な粉末を用いたGelMA HMPの作製、GelMA GHS形成、GelMAナノエンジニアリング粒状バイオインク(NGB)調製、および3Dバイオプリンティングの方法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>1H,1H-perfluoro-1-octanol</td><td>Alfa Aesar, MA, USA</td><td>B20156-18</td><td>純度98%</td></tr>の<tr><td>生検パンチ</td><td>Integra Miltex, NY, USA</td><td>33-31A-P/25</td><td>1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System</td></tr><tr><td>鈍い針</td><td>SANANTS</td><td>30-002-25</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Bruker Avance NEO 400 MHz</td><td>400 MHz Bruker NEO, MA, USA</td><td></td><td>NMR device</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf,ドイツ</td><td>5415 C</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>Celltreat, MA ,USA</td><td>229423</td><td></td></tr><tr><td>コーヒーフィルター</td><td>BUNN, IL, USA</td><td>20104.0006</td><td>BUNN 8-12 カップ コーヒー フィルター、各 6 個、100 ct</td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>5311-0250</td><td>Nalgene 真空デシケーター、PC カバーとボディ、外径 280 mm</td></tr><tr><td>酸化重水素</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>透析膜 (12-14 kDa)</td><td>Spectrum Laboratories, NJ, USA</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x)</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>56064C-10L</td><td>dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td>Corning, NY, USA</td><td>4980</td><td>Corning PYREX&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR、PA、米国</td><td>89125-188</td><td>Koptec 200プルーフ</td></tr><tr><td>外部スレッド極低温バイアル(cryovials)</td><td>コーニング、ニューヨーク、米国</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>Labconco、ミズーリ州、米国</td><td>71042000</td><td>真空ポンプを装備(カタログ#7587000)</td></tr><tr><td>ゼラチン粉末</td><td>シグマ、マサチューセッツ州、米国</td><td>G1890-5100G</td><td>豚の皮膚からタイプA、ゲル強度~300グラムブルーム</td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>VWR、PA、USA</td><td>82027-788</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>FOUR E'S SCIENTIFIC</td><td></td> MI0102003 <td>5 インチ マグネティック ホットプレート スターラー Max Temp 280 &deg;C/536 >F&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fischer scientific, MA, USA</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1000 ネガティブフォトレジストシリーズ</td><td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td><td>121619</td><td>KMPR1025とKMP1035が含まれています</td></tr><tr><td>LAPONITE XLG</td><td>BYK USA Inc., CT, USA</td><td>2344265</td><td></td></tr><tr><td>Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)</td><td>Sigma, MA, USA</td><td>900889-1G</td><td>>95%</td></tr><tr><td>Luer-Lokコネクタ</td><td>BD, NJ, USA</td><td>BD 302995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MA / BA Gen4-シリーズマスク & ボンドアライナー</td><td>S&Uuml;SS MicroTeck、ドイツの</td><td></td><td>ナノファブリケーションデバイス</td></tr><tr><td>無水メタシル酸シ</td><td>グマ、マサチューセッツ州、米国</td><td>276685-100ML</td><td>には2,000が含まれています&nbsp;阻害剤としてのppmトパノールA、94%</td></tr><tr><td>Milli-Q水</td><td>Millipore Corporation、MA、USA</td><td>ZRQSVR5WW</td><td>電気抵抗率および漸近線; 18 M&Omega; 25 &deg;C、Direct-Q 5 UVリモート浄水システムNovec</td></tr><tr><td>7500エンジニアリング流体</td><td>3M、MN、USA</td><td></td><td>3M ID&nbsp;7100003723</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>VWR、PA、USA</td><td>VWR-1410</td><td>1410 真空オーブン</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャー scientific、マサチューセッツ州、米国</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>VWR、PA、米国</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR、PA、米国</td><td>25384-092</td><td>ポリスチレン</td></tr><tr><td>ピコサーフ</td><td>スフィア 流体工学、英国</td><td>C022</td><td>(Novec 7500 の 5% (w/w))</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>VWR、PA、USA</td><td>89079-970</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>VWR、PA、USA</td><td>87006-060</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナーチャンバー</td><td>Harrick Plasma、NY、USA</td><td>PDC-001-HP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン</td><td>ダウコーニング、ミシガン</td>州<td>、米国&nbsp;2065623</td><td>SYLGARD 184 シリコーン エラストマー キット</td></tr><tr><td>容積式ピペット</td><td>Microman E M100E, Gilson, OH, USA</td><td>M100E</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>UniversityWafers, MA, USA</td><td>452/1196</td><td>4インチ メカニカルグレード</td></tr><tr><td>へら</td><td>VWR, PA,</td><td>USA 231-0104</td><td>ディスポーザブル</td></tr><tr><td>SU-8&nbsp;</td><td>Kayaku Advanced Materials, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Harvard Apparatus, MA, USA</td><td>70-2001</td><td>PHD 2000</td></tr><tr><td>Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane</td><td>Millipore Sigma, MA, USA</td><td>448931-10G</td><td>97%</td></tr><tr><td>Tygon tubings</td><td>Saint-globain, PA, USA</td><td>AAD04103&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UVライト&nbsp;</td><td>QUANS</td><td></td><td>電圧: 85 V-265 V AC / 電源: 20 W</td></tr><tr><td>真空ろ過ユニット</td><td>VWR, PA, US</td><td>10040-460</td><td>0.20 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fischer scientific、米国</td><td>14-955-151</td><td>ミニボルテックスミキサー</td></tr></tbody></table>

ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3dバイオプリンティング

Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting

ヒドロゲル微粒子(HMP)を組み立て ることによって 製造された粒状ヒドロゲル足場(GHS)の出現により、 その場での微多孔性足場の形成が可能になりました。従来のバルクヒドロゲルとは異なり、GHSの相互接続されたマイクロスケールの細孔は、分解に依存しない細胞浸潤、ならびに酸素、栄養素、および細胞の副産物の移動を促進します。メタクリロイル修飾ゼラチン(GelMA)は、細胞接着性および生分解性部分を含む(光)化学的に架橋可能なタンパク質ベースの生体ポリマーであり、細胞応答性/有益な生体材料として広く使用されています。バルクGelMAをGHSに変換すると、組織工学と再生のための多くの機会が開かれる可能性があります。本稿では、ハイスループットGelMAミクロゲル作製、再懸濁乾燥ミクロゲル(マイクロエアロゲル)への変換、ミクロゲルの化学集合 体による GHS形成、および押出バイオプリンティングのための顆粒バイオインク作製の手順を示す。冷却と光架橋 による 逐次物理化学的処理により、機械的に堅牢なGHSの形成がどのように可能になるかを示します。光にアクセスできない場合(例えば、深部組織注入中)、個別に架橋されたGelMA HMPは、トランスグルタミナーゼを用いた酵素架橋 を介して 生物学的に直交的に組み立てることができます。最後に、低HMP充填密度での微多孔性GHSの3次元(3D)バイオプリンティングは、不均一に荷電したナノ粒子の界面自己組織化 を介して 実証される。

GelMAは、図1Aに示すように、ゼラチンとMAの反応によって合成されました。MA濃度などの反応条件を調整することにより、異なる程度のMA置換が得られた。MA置換の程度を定量化するために、GelMAを1H NMR分光法を介して評価した(図1B)。~5-6 ppmの化学シフトに代表的なピークを持つビニル官能基は、ゼラチンからのGelMA合成の成功を確認しました。透析および滅菌濾過後の反応収率は&gt;70%(GelMAのmg/ゼラチンのmg)であった。液滴/ミクロゲル作製収率は~100%であった。置換度24を定量化するために、異なる方法を用いることができる。リジンアミノ酸(1級アミン)の減少を、影響を受けていない芳香族酸プロトンを用いて式(1)に基づいて正規化して評価した。
HMPは通常、DPBSや細胞培養培地などの水性培地に懸濁されます。HMP...

この記事では、マイクロ流体デバイスを使用したハイスループットゼラチンメタクリロイルミクロゲル製造、ミクロゲルの再懸濁可能な粉末(マイクロエアロゲル)への変換、粒状ヒドロゲル足場を形成するためのミクロゲルの化学集合、および3Dバイオプリンティング用のマイクロ多孔性が保存された粒状ヒドロゲルバイオインクの開発のプロトコルについて説明します。

ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング

The emergence of granular hydrogel scaffolds (GHS), fabricated via assembling hydrogel microparticles (HMPs), has enabled microporous scaffold formation ...

細胞外マトリックスまたはECM数値ヒドロゲル微粒子は、足場製造のためのビルディングブロックとして使用され得る。このプロトコルは、ゼラチンメタクリロイルまたはGelMAヒドロゲル微粒子の製造、精製、凍結乾燥、写真アセンブリ、および3Dバイオプリンティングを実証します。GelMAは、細胞接着性および生分解性部分を含む光化学的、架橋性、タンパク質ベースの生体ポリマーであり、細胞応答性および有益な生体材料として広く使用されている。従来のバルクヒドロゲルと比較して、GelMA粒状ヒドロゲル足場は微孔性であり、ビルディングブロックサイズによって調整できる迅速な細胞浸潤を可能にします。GelMA粒状ヒドロゲル足場は、安価なプラットフォームと再生工学で厚い組織、臓器、および疾患の3Dバイオプリンティングの新しい機会を開く可能性があります。まず、10ミリグラムのLAPを10ミリリットルのDPBSに加えて、0.1%光開始剤溶液を調製します。溶液をアルミホイルで包んで光から保護し、ラベルを付けます。次に、光開始剤溶液に所望量のGelMAを溶解する。アルミホイルで包んだ溶液を摂氏37度のオーブンに1時間入れて、透明な溶液を作ります。油相を調製するには、エンジニアリング液に2%生体適合性界面活性剤溶液を作ります。PDMSデバイスの入口と出口にタイゴンチューブを挿入し、インレット用のタイゴンチューブのもう一方の端に25ゲージの鈍い針を挿入します。デバイスを顕微鏡下に置き、ヘアドライヤーまたはスペースヒーターを使用して摂氏約40度で環境を暖かく保ちます。水溶液と油溶液を、デバイスに接続された別々のシリンジに入れます。毎分160マイクロリットルの流量で油相用のシリンジポンプを始動します。オイルがチャネルを満たした後、毎分80マイクロリットルで水相を開始します。顕微鏡で液滴形成を確認します。液滴を容器に回収し、光学顕微鏡イメージングによりイメージングチャンバー内で評価します。液滴を光から保護しながら一晩摂氏4度に保ち、GelMAミクロゲルの物理的架橋を開始し、液滴を安定したミクロゲルに変換します。マイクロエンジニアリングされたエマルジョンから粉末へのMEtoP法を実施するには、熱的に耐久性のあるマイクロ遠心チューブまたはクライオバイアルを使用して、エンジニアリング流体中の物理的に架橋されたミクロゲルを収集します。開いたチューブを実験室用ワイプとテープで密封します。物理的に架橋されたミクロゲルを液体窒素中で10分間急速凍結し、凍結乾燥を進行させます。凍結乾燥後、固体粉末が得られるであろう。凍結乾燥粉末に摂氏4度で冷却した0.1%光開始剤溶液1ミリリットルを加えて、ミクロゲル懸濁液を作ります。ボルテックス混合物を3, 000gで15秒間遠心分離します。上清を廃棄した後、充填したミクロゲル懸濁液を容積式ピペットを用いて型に移し、波長400ナノメートルの光に15ミリワット/平方センチメートルの強度で60秒間さらして、粒状のヒドロゲル足場またはGHSを形成する。400マイクロリットルのミクロゲル懸濁液に対して、物理的に架橋されたGelMAミクロゲルに等量の氷冷PFO溶液、20%インエンジニアリング液を加えます。次いで、ボルテックス混合物を300gで15秒間遠心分離し、ピペッティングによってGelMAミクロゲルから油相を除去する。次に、400マイクロリットルの氷冷、0.1%光開始剤溶液をミクロゲル懸濁液に加えます。ボルテックス溶液を300gで15秒間遠心分離した後、オイルを廃棄します。光開始剤溶液添加と遠心分離の工程を繰り返すが、今回は3, 000gで遠心分離し、充填したGelMAミクロゲルの上清を廃棄する。充填したGelMAミクロゲルを型に移し、続いて光露光してGHSを形成する。100ミリグラムのナノプレートレット粉末を3ミリリットルの氷冷超純水に加えて、3.33%ナノ粒子分散液を形成します。4°Cの冷蔵庫内で分散液を15分間激しくボルテックスして、凝集したナノ粒子を剥離します。適切に剥離されたナノ粒子は、透明な分散液を生成する。50ミリグラムのLAPを5ミリリットルの氷冷超純水に溶解し、1%光開始原液を調製します。次に、剥離したナノ粒子分散液に333マイクロリットルの1%光開始剤溶液を加え、周囲光から保護するためにアルミホイルで包みます。この混合物を1分間ボルテックスし、ナノ粒子分散液と光開始剤とを混合する。氷冷PFO、20%インエンジニアリング液を物理的に架橋されたGelMAミクロゲルに1対1の体積比で加えます。ボルテックス混合液を300gで15秒間遠心分離した後、界面活性剤を含む油相を廃棄する。氷冷したLAP添加ナノ粒子分散液を洗浄したGelMAミクロゲルに加えます。3, 000gで15秒間遠心分離した後、底部に残った油分と上澄み液分散液を捨てる。懸濁液を摂氏4度で保管し、アルミホイルを使用して光から1日間保護し、製品GelMAナノエンジニアリング粒状バイオインクまたはNGBを生成します。翌日、NGBを3ミリリットルのシリンジに入れます。装填したシリンジをキャップとパラフィルムで密封し、200gでパルス遠心分離を行って閉じ込められた空気を取り除きます。雌 - 雌ルアーロックコネクタを使用して、バイオインクを3ミリリットルのカートリッジに移します。カートリッジを再び200gで短時間遠心分離して閉じ込められた空気を取り除き、NGBを摂氏4度に保ってから使用してください。次に、調製したマウス線維芽細胞懸濁液を3ミリリットルのシリンジに入れる。雌-雌ルアーロックコネクタを使用してNGBとセルロードシリンジを結合し、内容物を40回前後に押して穏やかに混合します。3ミリリットルのプリントヘッドにノズルをロードすることにより、標準の円錐形ノズルを備えた適切なバイオプリンターを使用してNGBまたは細胞を含んだNGBを印刷します。印刷ベッドの温度を摂氏10度未満に保ち、速度や背圧などのパラメータを最適化します。目的のgcodeまたはSTLファイルを選択します。次に、標準の円錐形ノズルを備えた空気圧式3ミリリットルシリンジの基板とノズルタイプを選択します。デバイスのガイドラインを使用してバイオプリンターを校正し、印刷を開始して3D構造を取得します。MEtoP技術は、ミクロゲルを凝集や激しい変形から保護しながら、低圧凍結乾燥によって再懸濁可能な乾燥ミクロゲル粉末を生成しました。SEM画像は、この技術を使用して乾燥したGelMA微粒子が、従来の凍結乾燥で観察された凝集と比較して、凍結乾燥後も球形を保持することを示しました。高分子量蛍光色素を用いたGelMA、GHS、およびNGBのマイクロポア特性評価は、相互接続されたマイクロスケールのボイドスペースを示しました。また、カスタム記述されたMATLABスクリプトを使用して評価された蛍光画像は、細孔を検出しました。ボイド率と中央細孔等価直径の測定値は、NGBを使用して3Dプリントされた足場のマイクロスケール細孔の可用性と相互接続性を証明する有意差を示さなかった。ハンギングフィラメント長測定により、NGB足場が密集および緩充填されたGelMAミクロゲルに対して優れていることが明らかになり、NGBは充填されたミクロゲルよりも長い長さを有することが明らかになりました。緩く充填されたミクロゲルはフィラメントを生じなかった。中空のシリンダーを3Dプリントし、構造全体を光架橋のために光にさらしました。印刷された構造は、形状、忠実度、および構造の完全性を示すために物理的に保持されました。足場が生物学的評価に使用される場合、例えば、細胞を含んだバイオプリンティングにおいて、生物学的安全キャビネットの下で、特定の条件下ですべてのステップを実行することを忘れないでください。私たちは、生物医学における新たに出現した生体材料プラットフォームとしての粒状ヒドロゲル足場の使用を非市場化したいと考えています。

gelatin-methacryloyl-granular-hydrogel-scaffolds-high-throughput

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

bioprinter、犠牲型に基づいてパターン化されたハイドロゲルを作成するために使用された。ポロキサマー型は第二のヒドロゲルで埋め戻した後、溶出し、第三のハイドロゲルを充填した空隙を残していた。この方法では、生体高分子から複雑なアーキテクチャを生成する高速溶出及びポロキサマーの良い印刷適性を使用しています。...

模様の作成3D細胞培養のための2つの成分​​のために温度応答性ハイドロゲルリバース金型の印刷

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D...

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

ハイドロゲルを用いたマイクロ磁気応答性の高いコンポーネントとの容易な迅速な製造のための製造技術の添加剤

ここで提示するゼラチンメタクリロイルの3Dバイオプリンティングのための方法である。...

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

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バルクヒドロゲルの断片化と生物医学的応用のための粒状ヒドロゲルへの加工

相補的な反応性基を有するミクロゲルロッドは、水溶液中で相互連結する能力を有するマイクロフルイディクスを介して製造される。異方性ミクロゲルは、球形ベースのシステムと比較して、より大きな細孔を有する安定した構築物に詰まりそして相互連結する。GRGDS-PCで修飾されたミクロゲルは、細胞培養に使用できるマクロポーラス3Dコンストラクトを形成します。...

ミクロゲルロッドからの連結マクロポーラス3D足場

このプロトコルは、様々な再生医療用途に使用することができる微多孔性アニール粒子足場のためのミクロゲルビルディングブロックを合成するための一連の方法を記載している。...

微多孔性アニール粒子足場用ミクロゲルビルディングブロックのマイクロ流体合成

ヒドロゲル形成中のせん断処理は、剪断薄いが剪断力の除去後に急速に再構築するミクロゲル懸濁液の生成をもたらす。このような材料は、バイオプリンティング複合体、細胞を含んだ構造のための支持マトリックスとして使用されてきた。ここでは、支持床および適合バイオインクを製造するために使用される方法が説明される。...

懸濁3Dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

この研究では、自己修復アニーリング可能な粒子-細胞外マトリックス複合材料内の神経幹細胞の自由形状埋め込み3D印刷のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、相互接続されたヒト神経組織構築物のプログラム可能なパターニングを高い忠実度で可能にします。...

ヒト神経構築物の埋め込み3D印刷のためのミクロゲル-細胞外マトリックス複合サポート

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

学ぶゼラチンメタクリロイル（GelMA）ミクロゲルの製造・凍結乾燥・光アセンブリ法。粒状ヒドロゲル足場による3Dバイオプリンティング技術と組織工学への応用可能性を探索する。

ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング

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