RPA-CRISPR/Cas12A-SPMとディープラーニングに基づくDNAウイルス検出システム

私たちのプロトコルは、カエルウイルス3の迅速で高感度な検出システムを導入しています。重要なことに、この方法はDNAウイルスのポイントオブケア検出を可能にし、パンデミック疾患の発生を防ぐ上で重要な役割を果たします。この技術の主な利点は、RPAとCRISPR/Cas12aシステムの統合にあり、スマートフォンベースのポータブル顕微鏡とAI分類によって補完されています。

この統合により、検出効率と精度が大幅に向上すると同時に、人的要因に起因するエラーが減少します。まず、反応バッファーに4つの主要なRPA酵素を加えます。次に、事前に設計されたプライマーを混合物に加えます。

混合物を完全にボルテックスします。カエルウイルス3から得られた標的DNAを各RPA反応に1マイクロリットル加え、ボルテックスしてよく混ぜ合わせます。次に、100ミリモルの塩化マグネシウムを7マイクロリットルピペットで動かして反応を開始します。

混合物を摂氏37度で30分間インキュベートして、アッセイを完了します。Lachnospiraceae細菌CAS12aタンパク質をCRISPR RNAで調製して、機能的な複合体を形成します。細菌タンパク質と10 X CRISPR/Cas12a反応バッファーを混合します。

次に、500ナノモルの一本鎖DNAレポータープローブを追加します。1マイクロリットルのRPA反応生成物をCRISPR/Cas12a CRISPR RNA反応混合物に加えます。混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。

マイクロプレートリーダーで蛍光シグナルを測定します。スマートフォンの顕微鏡で検出するには、まず、準備した反応混合物を後退したスライドガラスにピペットで移します。次に、インキュベーション前にカバーガラスで覆います。

スライドをスマートフォンの顕微鏡のステージに置き、焦点距離と明瞭度を調整します。蛍光シグナルを測定するための画像を取得します。ImageJ を使用して、各画像の平均グレー値と、濃度グループ内の平均グレー値の標準偏差を測定します。

分類には深層学習モデルAlexNet 33を採用します。次に、Python を使用して、入力画像を 224 x 224 に 3 つのチャンネルで形状変更します。最後に、ImageNet データセットを含む事前学習済みのバックボーン ネットワークを使用して、画像の特徴を抽出します。

6組目のプライマーが最大の増幅効率を提供し、選択されました。CRISPR RNA-3は、側副切断に最も効率的であることが証明されました。選択したRPAプライマーとCRISPR RNAを用いた開発された検出システムを使用したところ、10 aM FV3とコントロールの間に有意差が生じました。

覚えておくべき最も重要な点は、特定のCAS 12a検出ステップです。反応のCRISPR RNAは、CAS 12a検出に基づいて、他のDNAウイルスを標的とするように修飾または再設計することができます。提案手法は、標的ウイルスの量の予備評価に役立ちます。

これに基づいて、qPCRなどの他の方法を使用して、より正確なウイルス量を得ることができます。この技術は、DNAウイルスのポータブル検出に向けた予備的な試みを提供します。このプロトコルで使用されるカエルウイルス3に関しては、タイムリーな検出は効果的な保護対策を促し、繁殖産業の損失を減らすことができます。