Name: マウスにおける急性骨髄性白血病発症のための腹腔内移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶマウスにおける腹腔内移植による急性骨髄性白血病発症モデルの確立方法。lin陰性細胞とSK細胞を用いて、従来法より簡便で低コストなAML研究モデルを構築する技術を解説します。

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著者らは、ペンシルベニア州立大学獣医生物医科学部動物診断研究所のハック研究所のフローサイトメトリーコアファシリティと組織病理学コアファシリティがタイムリーな技術サポートを提供してくれたことに感謝します。この研究は、米国がん研究所(KSP)、ペンシルベニア州立農業科学大学、ペンシルベニア州立がん研究所、USDA-NIFAプロジェクト4771、K.S.P.およびRFPへのアクセッション番号00000005からの助成金によってサポートされました。

<ol><li>Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).</li>
<li>Fortier, J. M., Graubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+human+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Murine models of human acute myeloid leukemia.</a> Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).</li>
<li>Ernst, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+requires+the+mixed-lineage+leukemia+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene.</a> Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).</li>
<li>Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+the+cellular+origin+in+acute+myeloid+leukemia%3A+learning+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hemasphere%22%5BJournal%5D)">The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models.</a> Hemasphere. 3 (1), 152(2019).</li>
<li>Zhan, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplant+in+mice+by+intra-femoral+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection.</a> Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).</li>
<li>Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+cells+and+monoclonal+antibodies+into+mice%3A+comparison+of+tail+vein+and+retroorbital+routes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuckow%2C+MA+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. , CRC Press Inc. (2001).</li>
<li>Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+chronic+cannulation+of+the+jugular+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice.</a> Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).</li>
<li>Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gastric+mucin+on+virulence+of+bacteria+in+intraperitoneal+injections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+part+I%3A+anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Leong, S. -K., Ling, E. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+neurons+with+fluorescent+dyes+administered+via+intravenous%2C+subcutaneous+or+intraperitoneal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route.</a> Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).</li>
<li>Ma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+magnetic+Fe3O4-nanoparticle+induces+hepatic+and+renal+tissue+injury+via+oxidative+stress+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+therapies+supplement%3A+the+peritoneum+as+an+ectopic+site+of+hematopoiesis+following+in+utero+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation.</a> Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+mesenchymal+stem+cells+is+effective+in+treating+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).</li>
<li>Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vivo+immunomodulatory+effects+of+intravenous+and+intraperitoneal+administration+of+adipose-tissue+mesenchymal+stem+cells+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+bone+marrow-derived+MSCs+improves+cisplatinum-induced+renal+injury+through+paracrine+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms.</a> Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).</li>
<li>Castelo-Branco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+but+not+intravenous+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+home+to+the+inflamed+colon+and+ameliorate+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis.</a> PLoS One. 7 (3), 33360(2012).</li>
<li>Bazhanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneally+infused+human+mesenchymal+stem+cells+form+aggregates+with+mouse+immune+cells+and+attach+to+peritoneal+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).</li>
<li>Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg5-dependent+autophagy+contributes+to+the+development+of+acute+myeloid+leukemia+in+an+MLL-AF9-driven+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model.</a> Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).</li>
<li>Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of hematopoietic stem cells.</a> Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).</li>
<li>Randall, T. D., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+population+of+cells+in+the+bone+marrow+that+phenotypically+mimics+hematopoietic+stem+cells%3A+resting+stem+cells+or+mystery+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population.</a> Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).</li>
<li>Gott, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+Cs-137+gamma+rays+and+320-kV+X-rays+in+a+mouse+bone+marrow+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dose+Response%22%5BJournal%5D)">A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model.</a> Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).</li>
<li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of mice.</a> Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).</li>
<li>Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+neural+development+to+cognition%3A+unexpected+roles+for+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin.</a> Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+treatment+reduces+leukemia+burden+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia.</a> FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).</li>
<li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+MLL-AF9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+initiated+by+Mll-AF9%3A+gene+dosage+and+critical+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells.</a> Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).</li>
<li>Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+leukemia+stem+cells+in+murine+MLL-AF9+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

これらの上記の研究は、Lin細胞の 移植が1°マウスAMLの生成においてLSK細胞に匹敵するという支持的な証拠を提供します。さらに、現在のデータは、i.p.注射が静脈内(またはr.o.)注射と比較してマウスAMLを確立するための効率的で便利な方法であることも示しています。
LSK細胞に加えて、顆粒球単球前駆細胞(GMP)、共通リンパ系前駆細胞(CLP)、および共通骨髄系前駆細胞(CMP)などの他の集団が、さまざまなインキュベーション期間31,32の1°MLL-AF9誘導AMLの生成においてドナー細胞として置換されることが報告されていますが、最適な選択を示唆するための定量的比較は不足しています。現在の研究では、同じドナーマウスから単離されたLin-およびLSKは、形質導入された骨髄系前駆細胞(Sca-1-)がAML33を開始できたことを考えると、1°MLL-AF9誘導AMLの生...

急性骨髄性白血病(AML)は、予後不良の多様な病因の血液悪性腫瘍の一種です1。AML動物モデルの生成は、その複雑な変異と病理生物学を理解するための基礎を築き、新しい治療法を発見します2。マウスの白血病発生は、AMLを強力に誘導する混合系統白血病(MLL)遺伝子を含む融合癌タンパク質を発現するドナー細胞を移植して、ヒトの疾患を模倣することを含みます3。MLL遺伝子関連AML4の移植では、ドナー細胞の様々な細胞起源が報告されており、疾患起源の原因となる細胞についてはほとんど知られていない。
マウスへの移植のために複数の経路が開発されている。変異ドナー細胞を骨髄5に直接導入する大腿骨内注射ではなく、静脈副鼻腔神経叢、尾静脈、頸静脈を利用する静脈内注射がマウスAMLモデル6、7、8、9の作製に広く用いられている。眼窩後方(r.o.)注射の場合、体積制限、高い技術的要求、繰り返しの試行またはエラーの可能性の少なさ、潜在的な眼の損傷など、さまざまな固有の欠点が大きな障害であり、実行可能な代替手段が限られているか、まったくありません7。尾静脈注射は、局所的な怪我以外にも同様の問題を引き起こす可能性があります。手順を容易にするために、マウスはしばしば尾静脈を拡張するためにウォームアップする必要があります10。また、特にC57BL/6系統のマウスでは、追加の光源なしで尾静脈を見つけることは困難です。頸静脈注射の場合、研究担当者は静脈を特定し、起こりうる合併症を制限するために十分なトレーニングを必要とします。さらに、静脈洞と頸静脈の両方の注射を麻酔下で行う必要があり、これは別のレベルの複雑さを追加します。したがって、AMLマウスモデルの確立を促進するために、移植の新しいルートを模索するのは魅力的です。
腹腔内(i.p.)注射は、薬物、染料、および麻酔薬の投与に一般的に使用されます11、12、13、14、15;また、異所性造血のための造血細胞の導入16や、骨髄由来間葉系幹細胞の移植にも使用されています17、18、19、20、21。しかし、マウスの造血器悪性腫瘍の確立、特にAML疾患の進行を研究するためにめったに使用されていません。
本研究では、ドナー細胞としての系統陰性(Lin-)およびLin-Sca-1+c-Kit+(LSK)集団の移植効率を比較することに加えて、AMLマウスモデルの生成におけるi.p.注射の実現可能性について説明します。これらの知見は、AMLおよび関連する骨髄性白血病の実験モデルを簡単かつ効率的に生成する方法を提供する。このような方法は、疾患メカニズムの理解を深めるだけでなく、実験的治療法をテストするための比較的簡単なモデルを提供する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>a-コンピテントセルを選択&nbsp;</td><td>バイオライン</td><td>BIO-85027</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>猫# A-9434</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>猫# A0797</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA), フラクション V&mdash;低エンドトキシン グレード</td><td>ジェミニ バイオ製品</td><td>Cat# 700-102P</td><td></td></tr><tr><td>シプロフロキサシン HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>Cat# C-861-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、グルタミンなし</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'Rsリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Corning</td><td>Cat#21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、二ナトリウム塩(EDTA-2Na)、二水和物、分子生物学グレード</td><td>Calbiochem</td><td>Cat#324503</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清-プレミアムセレクト</td><td>アトランタバイオロジカルキャ</td><td>ット#S11550</td><td></td></tr>ホ<tr><td>ロトランスフェリン、ウシ</td><td>シグマAldrich</td><td>キャット#T1283</td><td></td></tr><tr><td>インスリン溶液ヒト</td><td>シグマ</td><td>Cat# I-9278</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 12440-053</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM (100&times;) solution</td><td>HyClone, Gelifesciences</td><td>Cat# SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>NEOGEN</td><td>Cat #: 7290A</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth with agar (Miller)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# L-3147</td><td></td></tr><tr><td>Mouse抗マウスCD45.1(FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-124-211</td><td></td></tr>マウス<tr><td>インターロイキン-3(IL-3)</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>Cat#300-324P</td><td></td></tr><tr><td>マウスインターロイキン-6(IL-6)</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>Cat#300-327P</td><td></td></tr><tr><td>マウス幹細胞因子(SCF)</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>Cat#300-348P</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Corning</td><td>Cat# 30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Phenix-Eco (pECO) cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸カリウム (KHCO3), 粒状</td><td>JT. Baker</td><td>Cat# 2940-01</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD117 (c-kit) (APC)</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>ネコ # 105812</td><td></td></tr><tr><td>ラット 抗マウス Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)</td><td>BD ファーミンゲン</td><td>ネコ # 558162</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス FLT3-リガンド</td><td>ペプロテック</td><td>Cat# 250-31L</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin 組換えヒト フィブロネクチン フラグメント</td><td>TaKaRa</td><td>Cat# T100A</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293 試薬</td><td>MirusBio</td><td>Cat# MIR 2705</td><td></td></tr><tr><td>TRI 試薬</td><td>Σ Aldrich</td><td>Cat# T9424</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー 溶液、0.4%</td><td>Gibco</td><td>Cat # 15250061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノール レッド</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# M3148</td><td></td></tr><tr><td>Commercial Assays&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySepマウス造血前駆細胞単離キット&nbsp;</td><td>StemCell technologies</td><td>Cat# 19856A</td><td></td></tr><tr><td>大容量 cDNA 逆転写キット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>Cat# 4368813</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa qPCR SuperMix</td><td>Quanta Bio</td><td>Cat# 95051-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>Cat#:12163</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ai14TdTomato mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Strain # 007914</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1 C57BL6/J マウス&nbsp;</td><td>ジャクソン研究所</td><td>#002014</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2 C57BL6/Jマウス&nbsp;</td><td>ジャクソン研究所</td><td>株#000664</td><td></td></tr><tr><td>機器とソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobeイラストレーター&nbsp;</td><td>バージョン25.2.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD accuri C6フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.0</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneSysソフトウェアプログラム&nbsp;</td><td>バージョン1.5.7.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prismバージョン6&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemavet 950FS&nbsp;</td><td>Drew Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7300 リアルタイム PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syngene G:BOX Chemi XR5 化学発光 蛍光イメージング</td><td>G:Box Chemi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける急性骨髄性白血病発症のための腹腔内移植

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

急性骨髄性白血病(AML)および持続性白血病幹細胞(LSC)を含む関連する再発を治療するための新しい治療法の満たされていないニーズがあります。レシピエントマウスへの眼窩後注射によるこれらの細胞の移植の成功に基づく治療法をテストするための実験的なAMLげっ歯類モデルは、課題に満ちています。この研究の目的は、腹腔内経路を使用してAMLの堅牢なマウスモデルを生成するための簡単で信頼性が高く、一貫した方法を開発することでした。本プロトコールでは、骨髄細胞を、ヒトMLL−AF9融合癌タンパク質を発現するレトロウイルスで形質導入した。原発性AMLの発症におけるドナーLSCとしての系統陰性(Lin-)およびLin-Sca-1+c-Kit+(LSK)集団の効率が検証され、AMLを生成する新しい方法として腹腔内注射が採用されました。腹腔内注射と眼窩後注射の比較は、2つの方法を比較対照するために連続移植で行われました。ヒトMLL-AF9ウイルスで形質導入されたLin細胞とLSK細胞の両方が、レシピエントの骨髄と脾臓によく生着し、本格的なAMLを引き起こしました。ドナー細胞の腹腔内注射は、連続移植時にレシピエントにAMLを確立し、AML細胞の浸潤は、フローサイトメトリー、qPCR、および組織学的分析によってレシピエントの血液、骨髄、脾臓、および肝臓で検出されました。したがって、腹腔内注射は、ドナー白血病細胞の連続移植を用いたAML誘導の効率的な方法です。

r.o.とi.p.移植経路を用いたマウスAML細胞の移植効率の比較 これまで、MLL-AF9形質導入LSK細胞を眼窩後移植したレシピエントマウスで1°AMLの樹立が報告され、連続移植によって1°AML細胞の移植能が実証されました30。本研究は、骨髄リン細胞 を使用して移植を行う可能性を評価した最初の研究です。異常な白血球増加症の存在(図2A)と骨髄と脾臓における白血病細胞(CD45.1+)の浸潤の増加(図2B)は、骨髄リン細胞 を使用して1°AMLを生成する可能性を支持しています。疾患誘導期間を比較するために、レシピエント当たり2匹のドナーマウスを安楽死させ、LSKまたはLin− 細胞のいずれかを単離した。結果から、LSKまたはLin- 細胞を移植した1°レシピエントに有意差は観察されませんでした(<strong class...

ここでは、白血病細胞の腹腔内注射を利用して、マウスの急性骨髄性白血病(AML)を確立し、増殖させます。この新しい方法は、AML細胞の連続移植に効果的であり、マウスへの静脈内注射で困難や矛盾を経験する可能性のある人の代替手段として役立ちます。

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

同じドナーマウスから単離されたlin陰性細胞およびSK細胞は、MLL-AF9誘導性AMLの生成に明らかな差がなかったため、このプロトコルは重要である。また、白血病細胞のIP注射は、AMLのマウスモデルの開発に成功することができます。従来の移植方法と比較して、この技術はより便利で安価である。まず、8〜10週齢のCD45.1雌C57BL / 6Jマウスを70%エタノールで滅菌します。発泡スチロールボード上の滅菌外科用パッドにマウスを置き、マウスの足パッドを通して脚を固定します。正中線で腹腔の上の皮膚を切り、鋭い端の滅菌ハサミで後肢に向かって皮下空間を広げます。腹部正中線から足首まで切開を伸ばし、鋭いハサミの刃で後ろ足の下の皮下空間を広げます。鋭いハサミでアキレス腱を切ります。歯付きの鉗子を使用して腱を保持し、大腿骨に取り付けられたもう一方の端を切断して腓腹筋を取り除きます。膝に付着している大腿四頭筋腱を鋭い端のハサミで切ります。腱を持ち、大腿骨に付着している筋肉の頭を切って腓腹筋を取り除きます。脛骨に取り付けられた端で大腿骨を囲む他の筋肉を切断します。次に、鋭いハサミで足首を切り、脛骨が無傷のままであることを確認します。大腿骨の遠位端を持ち、鋭いハサミで股関節を切断し、大腿骨頭が無傷のままであることを確認します。脛骨と大腿骨を15ミリリットルのチューブのフローバッファーに移します。脛骨と大腿骨を手で膝を折って分離します。膝蓋骨、軟骨、大腿骨顆を取り除き、脛骨プラトーと遠位大腿骨を露出させます。滅菌ガーゼを使用して筋肉を取り除き、骨をフローバッファーに浸します。大腿骨頸部を切断し、23ゲージの針を備えた10ミリリットルの注射器を使用して、大腿骨の両端からフローバッファーで骨髄細胞を洗い流します。次に、脛骨くるぶしを切断し、脛骨の両端からフローバッファーで骨髄細胞を洗い流します。18ゲージの針を備えた10ミリリットルの注射器を使用して上下にピペッティングすることにより、細胞を分散させます。単一細胞懸濁液を摂氏4度、400 Gで3分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を5ミリリットルの赤血球(RBC)溶解バッファーに再懸濁して、赤血球を3分間溶解します。5ミリリットルのフローバッファーを加えて溶解を停止します。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを5ミリリットルのフローバッファーに再懸濁します。70ミクロンのセルストレーナーを50ミリリットルのチューブに置き、懸濁液をストレーナーに通して細胞を収集します。フローバッファーで細胞濃度を丸底ポリプロピレンチューブで1ミリリットルあたり10〜8倍に調整する。製造元の指示に従って、マウス造血細胞分離キットを使用して系統陰性細胞を選択します。完了したら、選別された造血幹細胞と未選別の系統陰性細胞を遠心分離し、3ミリリットルの2Xサイトカイン、IMDM培地、および3ミリリットルのウイルス上清をレトロ還元剤コーティングディッシュに再懸濁します。加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで皿を摂氏37度で6時間または24時間インキュベートします。形質導入後、遠心分離により細胞を回収する。必要に応じて、トリプシンを使用して皿の底に付着した細胞を収集します。上清を廃棄し、ペレットを予め温めたPBSに再懸濁する。27ゲージのハーフニードルで、一次レシピエントマウスに眼窩後または腹腔内に細胞を注入します。マウスを毎日監視します。1か月後、眼窩後出血によって毎週採血し、HEMAVETで全血球数を評価することにより白血球増加症を監視します。親指と人差し指で目を突き刺し、次に内眼窩を通して滅菌ヘマトクリット毛細血管で静脈副鼻腔神経叢を貫通します。EDTA採血管に20〜25マイクロリットルの血液を採取し、まぶたを閉じて出血を止めます。硫酸ゲンタマイシン点眼液を1滴目に塗ります。白血球が1マイクロリットルあたり4倍の10〜4細胞に達したら、フローバッファーで大腿骨と脛骨を洗い流して骨髄細胞を単離し、続いて前述のように赤血球溶解を行います。次に、脾細胞を採取するには、発泡スチロールボード上の滅菌外科用パッドの上にマウスを置き、マウスの足パッドを通して脚を固定します。マウスを70%エタノールで滅菌します。正中線で皮膚と筋肉を切り、鋭い端の滅菌ハサミで腹腔を露出させます。脾臓を単離し、15ミリリットルチューブのフローバッファーに入れます。3ミリリットルのフローバッファーを備えた6センチメートルの皿に70ミクロンのストレーナーを通して脾臓をメッシュします。細胞をディッシュから15ミリリットルのチューブに移し、単一細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、ペレットを5ミリリットルのRBC溶解バッファーに3分間再懸濁します。5ミリリットルのフローバッファーを加えて溶解を停止し、細胞懸濁液を遠心分離します。ペレットを5ミリリットルのフローバッファーに再懸濁し、混合して70ミクロンのセルストレーナーを通過させ、細胞を50ミリリットルのチューブに回収します。FITC結合抗マウスCD45.1抗体で脾細胞と骨髄細胞を染色し、フローサイトメーターで検出することにより、原発性急性骨髄性白血病(AML)細胞を特定します。細胞は、最初にFSC-A FSC-Hおよびfsc-a ssc-Aにゲーティングされ、シングレットを獲得します。CD45.1陽性集団は、染色されていない細胞と比較することにより、FL1プロット上でゲートされます。二次移植の場合は、一次眼窩後レシピエントからのCD45.1 AML脾臓細胞をPBSに再懸濁し、CD45.2雄マウスに眼窩後方に注入します。異常な白血球増加症の存在と骨髄と脾臓の白血病細胞の浸潤の増加は、骨髄系譜陰性細胞を使用して原発性AMLを生成する可能性を支持しています。LSKまたは系統陰性細胞で翻訳された一次レシピエントに有意差は観察されなかった。AML細胞は、混合系統白血病またはMLL-AF9形質導入系統陰性細胞によって一次レシピエントの腹腔内に広がる。これらの結果はまた、MLL-AF9形質導入骨髄系譜陰性細胞の腹腔内注射による白血球増加症の形での原発性AMLの確立、およびレシピエントマウスの骨髄および脾臓におけるAML細胞の存在を確認しました。しかし、腹腔内注射による一次移植は、ドナー細胞の数が同じであるにもかかわらず、眼窩後注射によるよりもAMLの発症に時間がかかりました。二次レシピエントは、移植後1か月未満で白血球増加症と有意な肝脾腫を示しました。AML細胞は、末梢血、骨髄、脾臓、および腹腔でも検出されました。5つのAML細胞に10の8倍の腹腔内注射は、5つのAMLに10の8倍の眼窩後注射と同等の生着を達成した。三次レシピエントマウスは、白血球増加症および肝脾腫を含むAML徴候を急性に示し、血液、骨髄、および脾臓中の白血病細胞の存在、大腿骨および脾臓の組織学的観察は、白血病細胞の浸潤をさらに示した。二次移植および三次移植と比較して、三次移植は二次移植よりもはるかに速く進行しました。現在のモデルでは、LSKセルのソートは不要です。リン陰性細胞は、AMLウイルスで6時間または24時間形質導入することができます。モデル確立の効率には影響しません。

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