Name: マウスにおける自己免疫性糖尿病の養子移植モデルにおける移植片生存の生物発光モニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶマウス自己免疫性糖尿病モデルにおける細胞移植と生物発光イメージング手法。NOD-SCIDマウスを用いてβ細胞置換療法の治療標的を探索する低侵襲的かつ低コストな実験法です。

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このプロトコルに記載されている方法を開発したエリカ・P・カイ博士と石川祐樹博士に感謝します(参考文献11を参照)。S.K.とP.Y.の研究室での研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01DK120445、P30DK036836)、JDRF、ハーバード幹細胞研究所、ビートソン財団からの助成金によってサポートされています。T.S.は国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)(T32 DK007260-45)のポスドクフェローシップによってサポートされ、K.B.はメアリーK.アイアコッカ財団からのフェローシップによって部分的にサポートされました。

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<li>Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: 
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<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+deletion+of+human+leukocyte+antigens+protects+stem+cell-derived+islets+from+immune+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection.</a> Cell Reports. 36 (7), 109538(2021).</li>
<li>Brehm, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+acute+xenogeneic+graft-versus-host+disease%2C+but+retention+of+T-cell+function+following+engraftment+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+NSG+mice+deficient+in+MHC+class+I+and+II+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression.</a> FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).</li>
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</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

T1Dは現在治療法が存在しない壊滅的な病気です。ベータ細胞補充療法は、この病気の患者に有望な治療法を提供しますが、この戦略に対する重大な障壁は、移植されたベータ細胞に対する再発性自己免疫攻撃の可能性です。免疫の可視性または感受性を低下させるためのSC-β細胞の遺伝子工学は、この問題に対する1つの潜在的な解決策です。本明細書に記載されるのは、マウスにおける自己免疫性糖尿病の養子導入モデルにおいてそれらの生存を測定するために移植されたベータ細胞を非侵襲的に画像化するためのプロトコルである。
この方法の主な利点は、プロトコルの適応性です。ここでは、変異細胞株と非標的対照を比較するためにこの方法が適用されますが(図3)、プロトコルはさまざまな実験的質問に対応できます。自己免疫攻撃に対する幅広い遺伝子組み換え、薬物、またはその他の治療法の保護効果を調査することができます。自己免疫に対する保護における薬物または他の治療の有効性を評価する場合、追加の遺伝子改変なしでルシフェラーゼを発現する細胞のみが必要です。本論文では、自己免疫防御を試...

1型糖尿病(T1D)は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされます。ベータ細胞塊の損失は、インスリン欠乏症および高血糖をもたらす。T1D患者は、外因性インスリンの毎日の複数回の注射に依存しており、生涯を通じて重度の高血糖および低血糖のエピソードを経験します。これらのエピソードに関連する合併症には、糖尿病性網膜症、腎機能の低下、および神経障害が含まれます1。
インスリン注射は治療法ですが、T1Dの治療法ではありません。しかし、失われたベータ細胞塊を置き換えることは、患者が自分のインスリンを産生できるようにすることで、病気を逆転させる可能性があります。ただし、死体ドナー島の供給は限られています2。幹細胞由来膵島(SC膵島)は、移植用のベータ細胞の事実上無制限の供給を提供し得る。いくつかのグループは、ヒト胚性幹細胞(ESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)を分化させて機能的なベータ様細胞を生成できることを実証している3,4,5。有望な初期の臨床試験データは、これらの細胞が移植後も機能を維持し、患者がインスリン非依存性になることを可能にする可能性があることを示しています6。ただし、慢性免疫抑制が必要であり、癌や感染症に対する感受性が高まります。さらに、免疫抑制剤は、長期的に移植片に対して細胞毒性があり得る7。免疫抑制の必要性を排除するために、SC膵島を遺伝子組み換えして、移植後の再発性自己免疫および同種免疫から保護することができます。
幹細胞研究は、コストと労力が非常に厳しいものです。マウス細胞株と動物モデルは、移植細胞を自己免疫から保護するための戦略の初期同定と実験的検証に有用なツールです。NODマウスは、ヒトT1D8と多くの類似点を有する自然発生性自己免疫性糖尿病を発症し、NIT-1インスリノーマ細胞株はこのマウス系統9と遺伝的背景を共有している。糖尿病は、複製実験マウス10における糖尿病の発症を時間的に同期させるために、NODマウスからの糖尿病性脾細胞の注射を介して関連する免疫不全NOD-scidマウス系統に養子縁組に移され得る。このモデルは、SC島でのさらなる検証のために、遺伝的標的を比較的迅速かつ安価に特定するために使用できます。最近、この方法は、in vivoでの自己免疫から初代ヒト膵島を保護することが判明した標的であるRNLSおよびin vitroでのベータ細胞ストレスからのiPS細胞由来膵島を同定および検証するために適用されました11。ここでは、遺伝子操作されたNIT-1細胞を移植し、マウスの自己免疫性糖尿病の養子導入モデルでそれらの生存を非侵襲的に監視するための簡単なプロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン、0.53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>SV40 large T antigen</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol</td><td>Amazon/Ever Ready First Aid</td><td>B08NWF31DX</td><td></td></tr><tr><td>BD 5ml シリンジ Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL TB シリンジ スリップチップ</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S HCl</td><td>Corning</td><td>&nbsp;30-100-RB</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナープレミアムSureStrain、70&マイクロ;m、滅菌</td><td>済みサザンラボウェア</td><td>C4070</td>または、<td>孔径40-70umの同様の滅菌ストレーナーを使用してください</td></tr><tr><td>CellDrop自動セルカウンター</td><td>Denovix</td><td>CellDrop BF-PAYG</td><td>または同様のセルカウンターデバイスを使用してください</td></tr><tr><td>コーニング100mLペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て吸引ピペット、ポリスチレン、滅菌、容量= 2 mL</td><td>VWR</td><td>414004-265</td><td>または、同様の吸引ピペット</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン、カリウム塩、分子生物学グレード、粉末、>99%</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸、グルタミンなし</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>Falcon BDチューブ、50mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>を使用してください組織用鉗子プレミアム、1 x 2歯5インチ、ドイツ鋼</td><td>製フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-820-074</td><td></td></tr>グル<tr><td>コース尿テストストリップ</td><td>カリフォルニアペット薬局</td><td>u-tsg100</td><td>または、尿/血中のグルコース測定に同様のテストストリップを使用してください</td></tr><tr><td>GlutaMAX&ndash;1 (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>赤外線加熱ランプ</td><td>コール・パーマー</td><td>03057-00</td><td>または同様の赤外線ランプを使用&nbsp;</td></tr><tr><td>インスリン注射器 0.5 mL、U-100 29 G 0.5 in</td><td>Becton Dickinson</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care</td><td>6679401725</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum in vivo イメージングシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>移植細胞の生物発光画像を非侵襲的に収集するための機器</td></tr><tr><td>生体画像解析ソフトウェア</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td>生物発光シグナルを収集し定量するためのソフトウェア</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ シールライト、1.5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>または、同様の滅菌マイクロ遠心チューブを使用</td></tr><tr><td>NIT-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2055</td><td>NOD/LtマウスNOD由来の膵臓ベータセルライン</td></tr><tr><td>。Cg-Prkdcscid/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>001303</td><td>重度の複合免疫不全自然突然変異に対するマウスのホモ接合性&nbsp;Prkdcscid、一般に&nbspと呼ばれる。scidは、機能的なT細胞とB細胞の欠如、リンパ球減少症、低ガンマグロブリン血症、および正常な造血微小環境によって特徴付けられます。</td></tr><tr><td>NOD/ShiLtJ</td><td>ジャクソン研究所</td><td>001976</td><td>マウスのNOD/ShiLtJ系統(一般にNODと呼ばれる)は、自己免疫性1型糖尿病</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td>の多遺伝子モデルです <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010031</td><td>カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-luciferase-blast</td><td>ご要望</td><td></td><td>に応じて社内で入手可能なプラスミドです補足ファイル1</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、線形、MW 25,000、トランスフェクショングレード(PEI 25K)</td><td>を参照してくださいFisher Scientific</td><td>NC1014320</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>Restrainer for rodents, broome-style round 1 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-288-32A</td><td></td></tr><tr><td>はさみ、鋭利なフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>08-940</td><td>または、外科グレードのステンレス鋼で作られた他のはさみを使用してください</td></tr><tr><td>組織培養処理された培養皿</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS430167-20EA</td><td>または、他の滅菌細胞培養処理されたペトリ皿を使用</td></tr><tr><td>ピンセット/鉗子、精密中先端</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-000-157</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける自己免疫性糖尿病の養子移植モデルにおける移植片生存の生物発光モニタリング

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

1型糖尿病は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊によって特徴付けられる。この病気の有望な治療法は、幹細胞由来のベータ細胞の移植です。しかし、移植された細胞を持続的な自己免疫から保護するために、遺伝子組み換えが必要な場合があります。糖尿病マウスモデルは、移植細胞を自己免疫攻撃から保護するための戦略の予備評価に有用なツールです。ここで説明するのは、マウスにおける糖尿病の養子移植モデルにおける細胞移植片を移植および画像化するための低侵襲的方法である。このプロトコルでは、ホタルルシフェラーゼ導入遺伝子 luc2 を発現するマウス膵臓ベータ細胞株NIT-1からの細胞を、免疫不全非肥満糖尿病(NOD)重症複合免疫不全(scid)マウスに皮下移植します。これらのマウスに、自己免疫を移すために自然糖尿病NODマウス由来の脾細胞を同時に静脈内注射する。移植片は、細胞の生存を監視するために、非侵襲的な生物発光イメージング を介して 一定の間隔でイメージングされます。変異細胞の生存率は、同じマウスに移植された対照細胞の生存率と比較されます。

プロトコルの概要を 図 1 に示します。変異体および非標的対照などの2つの細胞株の生存率を比較してもよいし、または1つの細胞株の生存を、薬物処理マウス対ビヒクル処理対照などの複数のマウス群で測定してもよい。 図3A は、非標的対照(左)および変異(右)細胞株を移植した3匹の8週齢の雌NOD-scidマウスを示す。マウスはまた、糖尿病を移すために自己反応性脾細胞を静脈内注射した。
マウスを注射後0日目、5日目、10日目、14日目、および18日目に画像化した。3匹のマウスのうち2匹では、生物発光シグナルの喪失によって証明されるように、対照移植片は18日目までに破壊されましたが、変異体移植片は保護されていました。1匹のマウスでは、対照移植片ではなく変異体移植片が破壊され、動物間の生物学的変異が浮き彫りになった。生物発光シグナルを 、図3Bに記載されるように定量化した。移植片の生存率は、最初の時点と比較した残留生...

このプロトコルは、非肥満糖尿病(NOD)重症複合免疫不全マウスにNIT-1細胞を移植およびイメージングするための簡単で低侵襲な方法を説明しています。

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

このプロトコルは、自己免疫攻撃に対する防御のメカニズムを理解し、1型糖尿病におけるベータ細胞置換の治療標的を特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、比較的低コストで、細胞培養、移植、およびイメージング方法の単純さ、ならびにマウス技術の侵襲性が低いことです。これまで尾静脈注射を行ったことがない人は、針を静脈に挿入するのに苦労する可能性があります。最初の注射の前に専門家によるデモンストレーションを依頼してください。まず、麻酔をかけたマウスを取り、ガード付きの電気シェーバーを使用して背側から髪を取り除き、約1インチ×2インチの皮膚を露出させます。剃ったマウスをノックダウンチャンバーに戻します。移植の前に、一度に1匹のマウスをチャンバーからイソフルランノーズコーンを備えたきれいな表面に移し、マウスの頭をノーズコーンにそっと導きます。剃った部分をイソプロピルアルコール準備パッドで拭いて、抜け毛を取り除き、皮膚を消毒します。次に、300マイクロリットルを超える細胞懸濁液を、26ゲージの針を取り付けた1ミリリットルの滅菌シリンジに引き込みます。シリンジから気泡を取り除き、余分なものを押し出しながら300マイクロリットルの細胞懸濁液を保持します。利き手ではない手に持った一対の湾曲した鉗子を使用して、マウスの背中の片側の皮膚をそっと持ち上げて、皮下スペースへのアクセスを容易にします。次に、利き手を使用して、シリンジをマウスの体の冠状および矢状平原と平行に配置します。針をマウスの頭に向け、後肢近くの皮膚に挿入し、針全体が皮膚の下に残り、突き出ないようにしながら皮下空間に導きます。鉗子を調整して、針の付け根の周りに皮膚を保持します。50マイクロリットル未満の細胞懸濁液をゆっくりと分注し、注射部位の皮膚の下に小さな膨らみが形成されることを確認します。最大200マイクロリットルの細胞懸濁液を皮下注射し続ける。次に、鉗子を所定の位置に保持し、針をマウスの体と平行に保ち、針を引き抜きます。針を外したら、細胞が穿刺創から漏れないように、鉗子で皮膚を数秒間閉じたままにします。移植後、各マウスを新しいケージに移し、動物が麻酔から完全に回復してから、ケージにマウスを追加します。安楽死させたマウスを背中に置き、外科用ハサミを使用して、皮膚に約2インチの長さの垂直切開を行います。マウスの右側を切り開き、真っ赤な脾臓を見つけます。ピンク色の膵臓から脾臓をそっと切り取り、5ミリリットルの滅菌PBSを含む滅菌10センチメートルのペトリ皿に移します。滅菌注射器プランジャーの平らな上部で脾臓をマッシュします。40または70ミクロンのストレーナーを50ミリリットルの円錐形のチューブに置き、5ミリリットルのPBSでプライミングします。脾臓懸濁液をストレーナーに移し、穏やかにマッシュします。10ミリリットルの

bioluminescent-monitoring-graft-survival-an-adoptive-transfer-model

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

確実に免疫不全マウスの坐骨神経にルシフェラーゼタグ付きヒト悪性末梢神経鞘腫瘍細胞を移植する方法が説明されています。研究グループに動物のランダムな分離のための腫瘍移植と基準の適切な設置を実証するために生物発光イメージングの使用についても説明します。...

のために人間のルシフェラーゼ-タグ付き悪性末梢神経鞘腫瘍細胞の同所Xenografting in vivoで</em候補治療薬の>テスト

このビデオはの使用方法を示しています...

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング

マウス骨髄移植は、ヒトにおいて、移植片対宿主病を支配する免疫のメカニズムを研究するために広く使われているテクニックです。...

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

このビデオは、局所的な細胞送達のためのマトリゲルと腫瘍進行の非侵襲的モニタリングのためのin...

生物発光性同所性膵臓癌モデルマウス:マウスの癌進行をモニターするための非侵襲的技術

このビデオは、非肥満の糖尿病性免疫不全マウスに移植されたルシフェラーゼ発現ベータ細胞を視覚化するイメージングベースの方法を示しています。糖尿病マウスからの脾細胞の導入は、進行性のベータ細胞の破壊をもたらし、基質導入後の発光の低下によって視覚的に確認されます。...

糖尿病性脾細胞を惹起した免疫不全マウスにおけるトランスジェニックβ細胞のイメージング

出典: Clark, AJ, et al. 神経膠芽腫に対する免疫担当動物モデルの生物ルミネセンスイメージングJ. Vis.

神経膠芽腫に対する免疫担当マウスモデルの生物発光イメージング

膵臓癌生物学の理解の向上は非常に重要膵臓癌を治療するための良好な治療選択肢の開発を可能にするために必要とされる。このニーズに対応するために、我々は使用して癌の進行の非侵襲的なモニタリングを可能に膵臓癌の同所性モデルを示す...

膵臓癌の進行の生物発光同所性モデル

GL261神経膠腫細胞は、神経膠芽腫の有用な免疫適格動物モデルを提供します。このプロトコルの目標は、in vivo 生物発光イメージングを使用して頭蓋内腫瘍の成長を監視するための適切な技術を実証し、腫瘍免疫学および神経膠芽腫を治療するための免疫療法アプローチを研究するためのルシフェラーゼ修飾 GL261...

神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

ここで生物発光を用いて、x 線、および陽電子放出断層撮影/コンピューター断層撮影の画像どのように阻止 mTOR の活性を研究する異種移植モデルにおける骨髄にしみ込んで骨髄腫腫瘍に影響を与えます。骨髄にしみ込んで骨髄腫腫瘍生体内ターゲット療法の抗骨髄腫効果の生理学的、非侵襲的関連性とマルチ...

NOG マウスの多発性骨髄腫, 骨髄異種のマルチ モーダルな発光とポジトロニック放出断層レントゲン写真撮影/計算断層イメージング

移植片対宿主病は、同種骨髄移植後の主要な合併症である。樹状細胞は、移植片対宿主病の病因において重要な役割を果たす。現在の記事では、移植片対宿主病の発症における樹状細胞の役割と移植片対白血病効果を調査するための新しい骨髄移植プラットフォームについて説明しています。...

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。...

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

学ぶマウス自己免疫性糖尿病モデルにおける細胞移植と生物発光イメージング手法。NOD-SCIDマウスを用いてβ細胞置換療法の治療標的を探索する低侵襲的かつ低コストな実験法です。

マウスにおける自己免疫性糖尿病の養子移植モデルにおける移植片生存の生物発光モニタリング

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