Name: ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞からインスリン産生膵島クラスターへの分化プロトコル。静的浮遊培養法により細胞ストレスを低減し、分化効率を向上させます。初心者でも再現可能で、糖尿病治療研究に有用です。

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STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、Stem Cell Network、JDRF、Canadian Institutes of Health Researchからの支援に感謝します。Jia ZhaoとShenghui Liangは、Michael Smith Health Research BC Trainee Awardを受賞しました。Mitchell J.S. Braamは、Mitacs Accelerate Fellowshipの受賞者です。Diepiriye G. Iworimaは、Alexander Graham Bell Canada Graduate ScholarshipとCFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Awardを受賞しています。MCRIとモナシュ大学のEdouard G. Stanley博士には、Mel1 INS GFP/W ラインを共有し、アルバータ糖尿病研究所の膵島コアには、ヒト膵島を分離して配布してくださったことに心から感謝します。また、ブリティッシュコロンビア大学のライフサイエンスインスティテュートイメージングおよびフローサイトメトリー施設からの支援にも感謝しています。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

<ol><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li>
<li>Petersen, M. C., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+journey+of+islet+cell+transplantation+and+future+development%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The journey of islet cell transplantation and future development.</a> Islets. 10 (2), 80-94 (2018).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Jennings, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+pancreas+from+foregut+to+endocrine+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment.</a> Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).</li>
<li>Jorgensen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+review+of+early+pancreas+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">An illustrated review of early pancreas development in the mouse.</a> Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).</li>
<li>Jensen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+factors+in+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory factors in pancreatic development.</a> Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).</li>
<li>Hald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+Ptf1a+antiserum+and+localization+of+Ptf1a+in+relation+to+Nkx6.1+and+Pdx1+during+the+earliest+stages+of+mouse+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).</li>
<li>Rukstalis, J. M., Habener, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3%3A+a+master+regulator+of+pancreatic+islet+differentiation+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration.</a> Islets. 1 (3), 177-184 (2009).</li>
<li>Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Neurod1+contributes+to+the+lineage+potential+of+Neurogenin3%2B+endocrine+precursor+cells+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas.</a> PLoS Genetics. 9 (2), e1003278(2013).</li>
<li>Balboa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+metabolic+and+transcriptional+maturation+of+human+pancreatic+islets+derived+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem-cell-derived+islets+ameliorate+diabetes+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates.</a> Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).</li>
<li>Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+cytoskeleton+to+direct+pancreatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).</li>
<li>Yoshihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-evasive+human+islet-like+organoids+ameliorate+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes.</a> Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).</li>
<li>Mahaddalkar, P. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+beta+cells+from+CD177%28%2B%29+anterior+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+insulin-secreting+islet+clusters+in+a+multiwell-based+static+3D+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system.</a> Cell Reports Methods. 3, 10046(2023).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+beta-cell+function+reveals+glucose-mediated+heterogeneity+of+beta-cell+functional+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development.</a> Elife. 8, e41540(2019).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+calcium+activities+from+pancreatic+beta-cells+in+zebrafish+embryos+using+spinning-disc+confocal+and+two-photon+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy.</a> Bio-protocol. 11 (23), e4245(2021).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+enhances+calcium+transients+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta-cells+by+activating+phospholipase+C+signal+pathway+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+and+function+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+in+macroencapsulation+devices+following+transplant+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice.</a> Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+beta-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules.</a> Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).</li>
<li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).</li>
<li>Mamidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosignalling+via+integrins+directs+fate+decisions+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors.</a> Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
</ol>

Timothy J. Kiefferは、この原稿の作成中にViaCyteの従業員でした。他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言します。

この論文では、in vitroで培養してから40日以内に、グルコースチャレンジでインスリンを分泌できるhPS細胞膵島を作製できる7段階のハイブリッドプロトコルについて説明します。これらの複数のステップの中で、決定的な内胚葉の効率的な誘導は、最終的な分化の結果のための重要な出発点を設定すると考えられています18,27,28。メーカーのプロトコールでは、分化を開始するために2.6 × 105/cm 2の播種密度が推奨され、細胞をステージ1培地に2日間曝露します。1日目に細胞がほぼコンフルエント(90%-100%)に達するようにするには、最適な播種密度が異なる可能性があるため、新しいhPS細胞株で作業する際に播種密度をテストすることを強くお勧めします。例えば、3つのhPSC株すべてを手元に置いて試験したところ、2.60 × 105/cm 2ではなく、1.6-1.80 × 10...

膵臓のベータ細胞は、血糖値の上昇に反応してインスリンを分泌します。1型糖尿病(T1D)1におけるベータ細胞の自己免疫破壊、または2型糖尿病(T2D)2におけるベータ細胞機能障害により、十分なインスリン産生が欠如している患者は、通常、外因性インスリンの投与で治療される。この命を救う治療法にもかかわらず、正真正銘のベータ細胞からの動的なインスリン分泌によって達成される血糖値の絶妙なコントロールに正確に匹敵するものではありません。そのため、患者はしばしば生命を脅かす低血糖エピソードや慢性高血糖エクスカーションに起因する他の合併症の結果に苦しむ。ヒト死体膵島の移植は、T1D患者の厳密な血糖コントロールを正常に回復させますが、膵島ドナーの利用可能性と移植のための健康な膵島の浄化の難しさによって制限されます3,4。この課題は、原理的には、ヒトPS細胞を代替出発物質として使用することで解決できます。
in vitroでヒトPS細胞からインスリン分泌膵島を作製する現在の戦略は、in vivoでの膵臓胚発生の過程を模倣することを目的としていることが多い5,6。これには、発生中の胚性膵臓の重要な段階を模倣するために、責任あるシグナル伝達経路に関する知識と、対応する可溶性因子のタイムリーな追加が必要です。膵臓プログラムは、転写因子フォークヘッドボックスA2(FOXA2)と性決定領域Yボックス17(SOX17)7によって特徴付けられる決定的な内胚葉へのコミットメントから始まります。決定的な内胚葉の逐次分化には、原始的な腸管の形成、膵臓および十二指腸のホメオボックス1(PDX1)7,8,9を発現する後部前腸へのパターン形成、およびPDX1とNK6ホメオボックス1(NKX6.1)10,11を共発現する膵前駆細胞への上皮拡張が含まれます。
内分泌膵島細胞へのさらなる関与は、内分泌促進性マスターレギュレーターニューロゲニン-3(NGN3)12の一過性発現と、主要な転写因子であるニューロン分化1(NEUROD1)およびNK2ホメオボックス2(NKX2.2)13の安定的な誘導を伴います。その後、インスリン産生ベータ細胞、グルカゴン産生アルファ細胞、ソマトスタチン産生デルタ細胞、および膵臓ポリペプチド産生PPY細胞などの主要なホルモン発現細胞をプログラムする。この知識と、広範でハイスループットな薬物スクリーニング研究からの発見により、最近の進歩により、インスリン分泌が可能なベータ細胞に似た細胞を持つhPS細胞の作製が可能になりました14,15,16,17,18,19。
段階的なプロトコルはブドウ糖敏感なベータ細胞6,14,18,19を発生させるために報告されている。これらの研究に基づいて構築された、現在のプロトコルには、平面培養でPDX1 + / NKX6.1+膵臓前駆細胞を生成するための膵臓前駆細胞キットの使用が含まれ、続いてマイクロウェルプレートを均一なサイズのクラスターに凝集し、静的3D懸濁培養でRプロトコルを使用してインスリン分泌hPSC膵島をさらに分化します。フローサイトメトリー、免疫染色、機能評価などの品質管理分析は、分化細胞の厳密な特性評価のために実施されます。このホワイトペーパーでは、指向性分化の各ステップを詳細に説明し、in vitro 特性評価アプローチの概要を説明します。

<table><tbody><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>甲状腺ホルモン</td></tr><tr><td>4% PFA 溶液</td><td>Santa Cruz バイオテクノロジー</td><td>sc-281692</td><td>ヒュームフード</td></tr><tr><td>96-Well, Ultralow Attachment, 平底</td><td>Corning Costar (VWR)</td><td>CLS3474</td><td>平底; 最後の 3 つの段階の静的懸濁液培養用</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>ステージ4細胞用解離試薬</td></tr><tr><td>Aggrewell400 プレート</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34415</td><td>400 &micro;m直径マイクロウェルプレート</td></tr><tr><td>Aggrewell800プレート</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>800 &micro;m径マイクロウェルプレート</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗ヒト FOXA2 (ヤギ IgG)</td><td>R&D Systems</td><td>IC2400G</td><td>1:100 in flow cytometry; ステージ 1 細胞のアッセイに使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control</td><td>R&D Systems</td><td>IC108G</td><td>1:100 in flow cytometry</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)</td><td>BD Sciences</td><td>566032</td><td>1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control</td><td>R&</td><td></td><td>フローサイトメトリーにおけるDシステムIC0041G 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647マウス抗ヒトC-ペプチド(マウスIgG1&κ;)</td><td>BD Pharmingen</td><td>565831</td><td>1:2,000 in flow cytometry; ステージ 7 細胞</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 マウス抗ヒト INS (マウス IgG1&kappa;)</td> のアッセイに使用<td>BD Sciences</td><td>565689</td><td>1:2,000 in flow cytometry</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (マウス IgG1&κ;)</td><td>BD Sciences</td><td>563338</td><td>1:33 in flow cytometry; Used for Assay of Stage 4 cells</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1&kappa;)</td><td>BD Sciences</td><td>562594</td><td>1:50 in flow cytometry; ステージ1細胞のアッセイに使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse IgG1&kappa;アイソタイプコントロール</td><td>BD Sciences</td><td>557714</td><td>1:50 in flow cytometry</td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Cayman Chemicals</td><td>14794</td><td>TGF-β signaling inhibitor</td></tr><tr><td>Anti-Adherence Rinsing Solution&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td>マイクロウェルリンス溶液</td></tr><tr><td>アッセイチャンバー</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-1-N</td><td>静的GSISおよび共焦点イメージング用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600-100</td><td>免疫染色手順用</td></tr><tr><td>CK19抗体</td><td>DAKO</td><td>M0888</td><td>1:50 in ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>ミディアムサプリメント</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542</td><td>核対比染色用</td></tr><tr><td>DMEM/F12、HEPES</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11330032</td><td>マトリックス希釈液</td></tr><tr><td>ロバ反ヤギ アレクサフロー555</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A21432</td><td>1:500 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>ロバアンチヤギ アレクサフロー647</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A21447</td><td>1:500 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>ロバ反マウス アレクサフロー555</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A31570</td><td>1:500 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>ロバアンチマウス アレクサフロー647</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A31571</td><td>1:500 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>ロバ反ウサギ アレクサフロー555</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A31572</td><td>1:500 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>ロバ反ウサギ アレクサフロー 647</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A31573</td><td>1:500 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>ロバアンチシープ アレクサフロー 647</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A21448</td><td>1:500 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>シグマ</td><td>D8537</td><td>Ca2+ および Mg2+/</td></tr><tr><td>ELISA、インスリン、ヒト</td><td>Alpco</td><td>80-INSHU-E01.1</td><td>ヒトインスリン測定用</td></tr><tr><td>脂肪酸フリーBSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>固定および透過化ソリューションキット</td><td>BD Sciences</td><td>554714</td><td>Fix/Permおよび10x Perm/Wash溶液付属</td></tr><tr><td>穏やかな細胞解離試薬</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td>維持培養中のhPSCの塊継代用</td></tr><tr><td>グルカゴン抗体</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td>1:400 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>GLUT1 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-37782</td><td>1:200 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-glutamine supplement</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>組織透明化およびマウント用</td></tr><tr><td>GSi XX</td><td>Sigma Millipore</td><td>565789</td><td>ノッチ阻害剤</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H3149</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>ITS-X (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51500056</td><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン; 培地サプリメント</td></tr><tr><td>LDN193189&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72147</td><td>BMP拮抗薬</td></tr><tr><td>MAFA抗体</td><td>Abcam</td><td>ab26405</td><td>1:200 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>Matrigel, hESC-qualified</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-774-552</td><td>血管表面コーティング用細胞外マトリックス</td></tr><tr><td>MCDB131 中</td><td>Life technologies</td><td>10372019</td><td>ベース培地</td></tr><tr><td>mTeSR1 コンプリートキット</td><td>STEMCELLテクノロジー</td><td>85850</td><td>幹細胞培地と 5x サプリメント</td></tr><tr><td>N-Cys (N-アセチル システイン)</td> <td>シグマ</td><td>A9165</td><td>抗酸化</td></tr><tr><td>剤 NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>NEUROD1 抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF2746</td><td>1:20 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>NKX6.1 antibody</td><td>DSHB</td><td>F55A12-c</td><td>1:50 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>Pancreatic polypeptide antibody</td><td>R&D Systems</td><td>AF6297</td><td>1:200 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>with Ca2+ and Mg2+</td></tr><tr><td>PDX1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>1:200 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1&kappa;)</td><td>BD Sciences</td><td>565860</td><td>1:2,000 in flow cytometry; used for assay of stage 7 cells</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)</td>BD <td>Sciences</td><td>563023</td><td>1:250 in flow cytometry</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD</td> <td>Sciences</td><td>562161</td><td>1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells</td></tr><tr><td>PE Mouse IgG1&kappa;アイソタイプコントロール</td><td>BD Sciences</td><td>554680</td><td>1:2,000 in flow cytometry</td></tr><tr><td>PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)</td><td>BD Sciences</td><td>564563</td><td>1:200 in flow cytometry</td></tr><tr><td>R428&nbsp;</td><td>ケイマンケミカルズ</td><td>21523</td><td>AXL チロシンキナーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>レチノイド酸、オールトランス</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>光感受性</td></tr><tr><td>RIPA 溶解バッファー、10x</td><td>シグマ</td><td>20-188</td><td>ホルモン抽出用</td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>シグマ</td><td>S4572</td><td>SHH 阻害剤</td></tr><tr><td>SLC18A1 抗体</td><td>Sigma</td><td>HPA063797</td><td>1:200 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>ソマトスタチン抗体</td><td>シグマ</td><td>HPA019472</td><td>1:100 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>STEMdiff 膵臓前駆逐キット</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05120</td><td>基礎培地とサプリメント</td></tr><tr><td>シナプトフィジン抗体</td><td>Novus</td><td>NB120-16659</td><td>1:25 ホールマウント免疫蛍光</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>透過化用</td></tr><tr><td>トロロックス&nbsp;</td><td>シグマミリポア</td><td>648471</td><td>ビタミンEアナログ</td></tr><tr><td>TrypLE酵素エクスプレス</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー12604-021</td>シングル<td>セル継代hPSCsトリ</td></tr><tr><td>プシン1/2/3抗体</td><td>R&D Systems</td><td>AF3586</td><td>1:25 in whole mount immunofluorescence</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Zinc sulfate</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td>Medium supplement</td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

ヒト多能性幹細胞(hPS細胞)からインスリン分泌型ベータ細胞への分化は、ベータ細胞の機能や糖尿病治療の研究材料となります。しかし、天然のヒトベータ細胞を適切に模倣した幹細胞由来のベータ細胞を得るには課題が残っています。これまでの研究に基づいて、hPS細胞由来の膵島細胞を作製し、分化の結果と一貫性を改善したプロトコールを作成しました。ここで説明するプロトコルは、ステージ1〜4で膵臓前駆細胞キットを使用し、その後、ステージ5〜7で2014年に以前に発表された論文(以下「Rプロトコル」と呼ぶ)から変更されたプロトコルを使用します。膵臓前駆細胞キットと直径400 μmのマイクロウェルプレートを使用して膵臓前駆細胞クラスターを作製するための詳細な手順、96ウェル静的懸濁液フォーマットでの内分泌分化のためのRプロトコル、およびhPS細胞由来膵島の in vitro 特性評価と機能評価が含まれています。完全なプロトコルでは、最初のhPS細胞増殖に1週間かかり、その後、インスリン産生hPS細胞膵島を得るのに~5週間かかります。基本的な幹細胞培養技術と生物学的アッセイのトレーニングを受けた担当者は、このプロトコルを再現できます。

幹細胞をインスリン分泌性hPS細胞膵島に7つのステップで分化させるハイブリッド戦略を開発し、平面培養の最初の4段階では膵臓前駆細胞キットを使用し、最後の3段階では静的浮遊培養で以前に報告された方法6に基づいて構築された修正プロトコルを使用します(図1).このプロトコルでは、細胞播種後24時間(ステージ0)でほぼコンフルエント(90%-100%)の培養を確保することは、ほとんどのhPSC株の効率的な分化を開始するために重要です(図2A)。特定の細胞株に最適な条件を決定するために、さまざまな播種密度をテストすることを強くお勧めします。ステージ1の培養では、この段階でよく見られる死細胞の浮遊により、培地が曇って見える可能性があります。これは、付着した細胞が血管表面を完全に覆っている限り、キットの分化効率を損なうことはありません。ステージ2〜4では、細胞が増殖し、細胞死が減少するにつれて、単層はより圧縮され、使用済み培地はステージ1ほど曇らなくなります(<strong class...

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

このプロトコルは膵臓の祖先を膵島の集りに区別するために静的な懸濁液文化作戦を使用し、細胞が文化を振とうの間に経験する圧力を減らし、微分の成功を非常に改善する。ハードウェアプロトコルは初心者にやさしく、最初の4つのステージを最適化するための時間を節約できます。基本的な幹細胞培養技術を持つ担当者は、機能的な膵島様のクラスターを生成する可能性が十分にあるこのプロトコルを再現できます。まず、氷冷DMEM/F12で希釈したhES修飾マトリゲルで培養ウェルをプレコートし、プレートを加湿した摂氏37度5%二酸化炭素インキュベーターに30分間入れます。使用済みの培地をhPS細胞培養液から吸引し、DPBSで一度すすぎます。hPS細胞培養液を細胞解離酵素を用いて、37°Cで3〜5分間、単一細胞に解離します。解離後、温かいDMEM/F12培地を加えて細胞をすすぎ、15ミリリットルまたは50ミリリットルのコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を300 Gで5分間遠心分離し、10マイクロモルY-27632を含む幹細胞完全培地にペレットを再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して生細胞カウントを行います。希釈したマトリゲルを計数した後、マトリゲルでコーティングされたウェルに10倍の密度の1.6〜1.8倍で生細胞を5平方センチメートルの密度で直ちに播種します。加湿したインキュベーターで細胞を24時間インキュベートします。次に、ステージ1の1日目に、ステージ1A培地を準備します。使用済みの培地をステージ1Aの培地と交換し、24時間インキュベートします。翌日、ウェルからの使用済み培地を、新たに調製したステージ1B培地と交換します。ステージ2の1日目に、ステージ2A培地を調製し、ウェルからの培地をステージ2A培地と交換します。24時間インキュベートしてから、ステージ2B培地をウェルに添加します。ステージ3の1日目は、使用済みの培地をウェルから吸引し、次に新たに調製したステージ3の培地を加え、加湿したインキュベーターでインキュベートします。ステージ4の1日目に、使用済みの培地を新しく調製したステージ4の培地と交換し、加湿したインキュベーターでインキュベートします。ステージ 4 の 5 日目に、ウェルあたり 500 マイクロリットルの付着防止リンス溶液でマイクロウェルを前処理します。マイクロウェルプレートを 1, 300 G で 5 分間遠心分離し、顕微鏡で観察して、マイクロウェルに気泡が閉じ込められていないことを確認します。次に、ウェルからリンス液を吸引し、1ミリリットルのDPBSで1回すすぎます。次に、各ウェルに1ミリリットルの凝集培地を添加します。使用済み培地を膵前駆細胞培養物から除去した後、培養液をDPBSで一度洗浄した後、解離試薬で10〜12分間、解離試薬で単一細胞に解離します。細胞を温かいDMEM/F12で洗浄し、チューブに移して300 Gで5分間遠心分離します。ペレットを凝集培地に再懸濁し、生細胞計数を行います。ウェルあたり240万〜360万個の細胞を播種し、各ウェルに凝集培地を添加して、ウェルあたり2ミリリットルの最終容量を達成します。P-1000ピペットチップを使用して、細胞を上下に静かにピペットで固定し、均等に分配します。細胞懸濁液を300 Gで5分間遠心分離してマイクロウェル内の細胞を捕捉し、加湿したインキュベーターで24時間インキュベートして凝集を開始します。凝集後、凝集体を数回静かにピペットで上下させて、凝集していない細胞を浮かせます。凝集体が落ち着いたら、凝集体を吸引せずに浮遊していない凝集細胞を含む使用済み培地を慎重に除去します。新しいステージ5培地をマイクロウェルプレートの表面に分注して、マイクロウェルから凝集体を除去し、超低付着の6ウェルプレートに移します。すべての凝集体を超低付着性の6ウェルに集めた後、ステージ5培地に再懸濁して、密度を100マイクロリットルあたり20クラスターに調整します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルのステージ5培地を超低アタッチメントULA平底96ウェルプレートの各ウェルに分注します。コーナーウェルとエッジウェルに200マイクロリットルのDPBSを充填します。分注する前に、毎回クラスター再懸濁液を穏やかに混合してください。次に、100マイクロリットルのクラスター再懸濁液をULA平底96ウェルプレートの各ウェルに加えます。培養プレートを加湿したインキュベーターの平らな面に24時間置きます。翌日またはステージ5、2日目に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから90マイクロリットルの使用済み培地を静かに取り出し、ステージ5培地の100マイクロリットルでリフレッシュします。ステージ 6 の 1 日目に、ウェルあたり 90 マイクロリットルの使用済み培地をステージ 6 培地 100 マイクロリットルと交換します。ステージ7の1日目に、使用済みの培地を取り除き、ウェルあたり100マイクロリットルのステージ7培地を追加します。本研究では、マイクロウェルプレートを用いて、均一な大きさと形態を有する数千個の膵臓前駆細胞クラスターを一度に作製し、平均凝集効率が約74%であったことは、これらのクラスターにおいて、凝集後のPDX1およびNKX6.1の発現が高レベルで維持されたことである。インスリン発現細胞は、時間の経過とともに生きた培養物におけるインスリンGFPシグナルの増加によって示されるように、内分泌クラスター内で徐々に誘導されました。クラスターのサイズは、ステージ 5 と 7 の間で平均直径 150 ミクロンから 220 ミクロンに増加します。細胞組成の特性評価から、ハイブリッドプロトコルによって作製されたステージ7のhPS細胞は、主に内分泌であり、4つの主要な膵島細胞タイプから構成されていることが示されました。このハイブリッドプロトコルは、主に単ホルモン性膵島細胞と少数のバイホルモン細胞を生成しました。分化したベータ細胞は、NKX6.1、MAFA、NEUROD1、PDX1、およびGLUT1を発現します。さらに、ステージ7の培養では、60%のインスリンとPDX1の二重陽性細胞と50%のC-ペプチドとNKX6.1の二重陽性細胞が誘導されました。In vitroでは、静的グルコース刺激インスリン分泌アッセイにより、ステージ7のhPS細胞膵島が高グルコースと直接的な脱分極に応答して高レベルのインスリンを分泌することが実証されました。ヒトPS細胞膵島の総インスリン含量は、死体膵島の約半分です。幹細胞由来の膵島を作製するためのマルチウェルベースの静的培養システムは、さまざまなin situアッセイを容易にし、プロトコル開発や小規模スクリーニング研究に適したプラットフォームとして役立ちます。96ウェルプレートでの静的培養中のクラスター融合を最小限に抑えるため、培地交換を行う際にプレートを傾けないでください。プレートは常に平らな面で水平に保ちます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。...

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

単離するためのプロトコルは、ヒト胎児膵臓細胞由来培養し、画像膵島細胞クラスター（ICCは）が記載されている。方法は、組織、文化単層として、または凝集体懸濁液中、および増殖のマーカーと膵臓細胞運命決定のための画像からのICCを生成するために必要な手順を詳しく説明します。...

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。...

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。...

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は差別化した別個の組織パターンに自己組織化するための固有の能力を持っています。これは、空間的な環境勾配の提示を必要とするが。我々はHPSC分化パターンを制御するための生化学的および機械的な勾配を生成するためのシンプルかつ堅牢な方法としてステンシル微細を提示します。...

分化運命の空間組織を探るためのヒト多能性幹細胞のステンシルマイクロパターニング

ここでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)のための堅牢で高速かつスケーラブルな心筋細胞分化プロトコルを紹介します。この大規模な方法を使用して得られた心筋細胞は、ヒト心血管疾患のモデリング、ハイスループット薬物スクリーニング、および潜在的に臨床応用において効果的に使用するのに十分な細胞数を提供できます。...

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

学ぶヒト多能性幹細胞からインスリン産生膵島クラスターへの分化プロトコル。静的浮遊培養法により細胞ストレスを低減し、分化効率を向上させます。初心者でも再現可能で、糖尿病治療研究に有用です。

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

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