赤血球タンパク質の動的変化の免疫染色ベースの検出
March 17th, 2023
除核された赤血球のタンパク質活性化の動的変化を捉えることは、後の評価のために急性刺激に対する動的変化を保存するなど、方法論的な課題をもたらします。提示されたプロトコルは、関連するタンパク質変化の保存と分析、およびその後の検出を可能にするサンプル調製および染色技術について説明しています。
私たちの方法は、メカノバイオロジーの急速な分野で、一時的なタンパク質修飾を所定の位置に固定し、それらを特異的抗体で検出することにより、機構的な細胞内研究を可能にします。この方法は技術的に簡単に適用できます。結果は非常に有効で再現性があります。
また、他の技術と比較して、私たちの方法は、一時的なタンパク質修飾、特に赤血球メカノシグナル伝達に依存する翻訳後赤血球シグナル伝達の新しい分野で実際に効果的に使用できます。赤血球タンパク質固定を行うには、全血を4%パラホルムアルデヒド溶液で1対2の割合で室温で20分間希釈します。132gの血液溶液を室温で3分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。
RBCペレットを2容量の0.1モルPBSに再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。再度、サンプルを遠心分離し、RBCペレットを1容量の0.1モルPBSに再懸濁する前に上清を除去した。顕微鏡スライドに、サンプルIDとアルコール耐性ペンを使用して適用された抗体をラベル付けします。
調製したRBC溶液を10マイクロリットル加える。2番目のスライドをサンプル上に45度の角度で置き、サンプルをスライドに沿って均等に分散させます。サンプルをブンゼンバーナーの上に5〜7秒間一定の動きでホバリングすることにより、スライドを熱固定します。
免疫組織化学染色の場合は、グリースペンシルを使用して、スライドの2/3の領域をテストとしてマークし、1/3の領域をコントロールとしてマークします。次に、TBSを30秒間塗布してサンプル領域を2回洗浄します。2回目の洗浄後、0.1%トリプシンを添加し、蓋付きの専用のインキュベーションチャンバーを使用してスライドを覆います。
サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。ビーカーに水道水を入れ、ビーカーからスライドに水道水を加えて酵素反応を停止します。溶液を注ぎ、TBSで両方の領域を3回洗浄します。
最終洗浄後、ペルオキシダーゼ遮断溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を注ぎ、両方の領域をTBSで3回洗浄します。次に、3%スキムミルク溶液を加え、30分間インキュベートします。
インキュベーション後、溶液を注ぎ、一次抗体溶液を試験領域に加えます。コントロールエリアに抗体コントロール溶液を追加します。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、抗体溶液を注ぎ、TBSで両方の領域を3回洗浄します。次に、非特異的結合を防ぐために3%正常ヤギ血清溶液を加え、30分間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を加え、30分間インキュベートします。
抗体溶液を注ぎ、TBSで3回洗浄してから染色の展開に進みます。次に、アビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を行うために、希釈アビジンペルオキシダーゼ溶液を添加し、30分間インキュベートする。スライドを200倍の倍率で顕微鏡下に置き、調製したばかりのDAB溶液を両方の領域に加えます。
赤血球の染色を継続的に監視し、背景が着色し始める前に使い捨てピペットでDAB溶液を除去して染色を停止します。サンプルの脱水を行うには、スライドをガラスラックに入れ、エタノール濃度を上げ、最後にキシロールにそれぞれ5秒間浸します。脱水後、スライドをティッシュペーパーの上に置き、RBCを上部にして余分な液体を吸収します。
カバースリップに2滴または3滴の封入剤を追加し、カバースリップを使用してスライドを覆います。視覚化とイメージングのために、カメラと結合された透過光顕微鏡にスライドを置きます。光源とカメラの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。
明視野モードで、粗いフォーカス調整ノブと細かいフォーカス調整ノブを回してRBCに焦点を合わせます。同様に、蛍光モードでRBCに焦点を合わせます。赤血球グレー値を分析するには、ImageJソフトウェア内の楕円選択ツールを使用して各赤血球のエッジをマークします。
[測定]コマンドを使用して、テストの50個のRBCとコントロールの10個のRBCのグレー値を測定します。RBCタンパク質の免疫蛍光染色では、サンプルを二次蛍光標識抗体とともに室温で30分間インキュベートし、光から保護します。インキュベーション後、抗体溶液を注ぎ、スライドをTBSで3回洗浄します。
最終洗浄後、TBSをサンプルに残します。サンプルを脱水し、示されているように顕微鏡評価用のカバースリップでスライドを準備します。顕微鏡と蛍光灯をオンにし、明視野モードで赤血球に焦点を合わせます。
ランダムに選択されたスライドのテスト領域の少なくとも3つの異なる領域で明視野および蛍光画像をキャプチャします。蛍光画像の露光時間を1秒に設定し、画像をキャプチャします。次に、明視野モードに切り替え、露出時間を自動に設定して、対応する明視野画像をキャプチャします。
画像をTIFF形式で保存します。スライドの制御領域の少なくとも2つの異なる無作為に選択された領域で蛍光および明視野画像をキャプチャします。画像をTIFF形式で保存して、ピクセルの元のグレー値を保持し、圧縮を防ぎ、取得のメタデータを保持します。
キャプチャされた赤血球のグレー値を測定するには、ImageJ を開きます。楕円選択ツールで各セルをマークし、[計測] コマンドを使用して解析します。RBCのない3〜5つの領域を強調表示し、グレー値を決定してバックグラウンド信号を測定します。
キャプチャされた画像の代替データ分析を実行するには、フィジー リリースの ImageJ を使用してマクロ コマンドを作成し、特定の画像の自動選択、背景補正、およびグレー値分析を行います。フィジーで分析するために TIFF 形式の画像を開きます。次に、RBC蛍光を開きます。
ijm マクロをクリックし、「実行」をクリックします。RBC一酸化窒素合成酵素(NOS)を標的とする抗体のシグナルは、安静時および機械的な力のばく露に応答してセリン1177残基でリン酸化され、免疫組織化学と免疫蛍光の両方を使用して評価されました。免疫組織化学的または免疫蛍光法のいずれかで評価した場合、それぞれの剪断されていない細胞と比較して、セリン1177残基でリン酸化されたRBC-NOSに対する抗体のシグナルの3倍の増加が、それぞれの剪断されていない細胞と比較して検出されました。
ユーザーは、抗体がテスト領域にのみ適用されていることを確認する必要があります。そうしないと、コントロールがないためにサンプルを分析できません。多種多様な抗体が利用できることを考えると、この方法を使用して、多くの異なるタンパク質およびシグナル伝達プロセスを標的とすることが可能です。
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概要
この記事では、核除去された赤血球におけるタンパク質活性化の動的変化を捉える方法を提示し、これらの変化を分析のために保存する際の課題に対処しています。このプロトコルにより、一時的なタンパク質修飾の効果的な固定と検出を通じて、赤血球のメカノシグナリングにおけるメカニズム的調査が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- メカノバイオロジー
- 赤血球シグナリング
- タンパク質修飾
背景
- 赤血球におけるタンパク質活性の調査は、メカノシグナリングを理解する上で重要です。
- 一時的なタンパク質修飾は細胞応答において重要な役割を果たします。
- 既存の方法は分析中に動的変化を保存する上で課題に直面しています。
- この研究は、タンパク質固定と検出のための信頼性の高いプロトコルを導入します。
研究の目的
- 赤血球における一時的なタンパク質修飾を固定する手法を開発すること。
- 刺激に対するタンパク質活性の再現可能な分析を可能にすること。
- 翻訳後修飾とメカノシグナリングの研究を進展させること。
使用された方法
- 固定のための4%パラホルムアルデヒドでの全血の希釈。
- 細胞成分の分離のための遠心分離。
- 特定のタンパク質検出のための染色技術。
- 分析のための特定抗体の適用。
主な結果
- この方法は適用が容易で、妥当で再現可能な結果を生み出します。
- 赤血球における一時的なタンパク質修飾の捕捉に効果的です。
- 赤血球メカノシグナリングの新しい分野での調査を促進します。
- 動的変化を保存する上で既存の技術に対する利点を示します。
結論
- 提示されたプロトコルは、赤血球におけるタンパク質ダイナミクスの研究を大幅に向上させます。
- メカノバイオロジーと細胞シグナリングの研究に新しい道を開きます。
- 将来の研究は、この方法を活用して赤血球機能についてのより深い洞察を得ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Immunostaining-based detection of dynamic red blood cell (RBC) protein alterations enables mechanistic interrogation of transient protein modifications critical for mechanobiology and post-translational signaling research. This capability supports early-stage target validation and de-risking in discovery pipelines where acute protein activation states inform therapeutic hypotheses. The method's reproducibility and semi-quantitative outputs facilitate robust portfolio triage and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detection of acute protein activation states relevant to mechanotransduction and signaling pathways.
- Supports functional target validation by capturing transient post-translational modifications in RBCs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific protein responses to experimental stimuli.
- Provides semi-quantitative data for hypothesis-driven portfolio advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RBC samples for downstream screening of protein activation or inhibition.
- Standardizes antibody-based detection workflows for reproducible and comparable results.
- Enables quantitative image-based readouts suitable for assay development and optimization.
- Supports scalability through protocol adaptability to different antibody targets and detection modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by enabling detection of protein changes in response to physiological or pathological stimuli.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker identification in RBCs.
- Reduces translational risk by ensuring that observed protein modifications are robust and reproducible across conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This immunostaining protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic studies, assay development, and translational biomarker exploration in RBC systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting specific protein activation events.
- Screening: Delivers reproducible, semi-quantitative outputs for compound or condition evaluation.
- Analytics: Provides image-based gray value measurements and background correction for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by capturing disease- or treatment-relevant protein modifications.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to diverse antibody targets and mechanistic questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies by preserving transient protein states.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and detection for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by providing robust, semi-quantitative data on protein activation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying biological mechanisms and reducing late-stage uncertainty.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, sample preparation, and microscopy-based imaging.
- Needs access to light and fluorescence microscopy, as well as image analysis software such as ImageJ or Fiji.
- Demands rigorous control staining to account for non-specific antibody binding and background signals.
- Adaptable to various RBC protein targets and signaling pathways with appropriate antibody validation.
- Limited to semi-quantitative analysis; absolute quantification may require complementary methods.
