Name: 赤血球タンパク質の動的変化の免疫染色ベースの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ赤血球タンパク質の動的変化を免疫染色で検出する方法。パラホルムアルデヒド固定と抗体染色により、赤血球のメカノシグナル伝達における一時的なタンパク質修飾を再現性高く解析できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LKは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金の支援を認めています。

<ol><li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+cell+life+span+heterogeneity+in+hematologically+normal+people+is+sufficient+to+alter+HbA1c%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c.</a> Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).</li>
<li>Mock, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+%28RBC%29+survival+determined+in+humans+using+RBCs+labeled+at+multiple+biotin+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities.</a> Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).</li>
<li>Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+red+blood+cells+die%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">How do red blood cells die?</a> Frontiers in Physiology. 12, 655393(2021).</li>
<li>Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+erythroblasts+to+mature+red+blood+cells%3A+organelle+clearance+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals.</a> Frontiers in Physiology. 8, 1076(2017).</li>
<li>Pretini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells%3A+chasing+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cells: chasing interactions.</a> Frontiers in Physiology. 10, 945(2019).</li>
<li>Cahalan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+links+mechanical+forces+to+red+blood+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume.</a> eLife. 4, e07370(2015).</li>
<li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+regulates+shear-dependent+nitric+oxide+production+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).</li>
<li>Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+modulation+of+human+erythrocyte+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Active modulation of human erythrocyte mechanics.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).</li>
<li>Strader, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification+as+a+response+to+cellular+stress+induced+by+hemoglobin+oxidation+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease.</a> Scientific Reports. 10 (1), 14218(2020).</li>
<li>Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+red+blood+cell+ghost+proteins+as+%26%2334%3Bsignatures%26%2334%3B+for+distinguishing+between+low-+and+high-risk+myelodysplastic+syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as &#34;signatures&#34; for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+activation+is+not+associated+with+improved+vascular+function+and+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia.</a> British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).</li>
<li>Sae-Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+organization+of+a+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The protein organization of a red blood cell.</a> Cell Reports. 40 (3), 111103(2022).</li>
<li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+exercise+promotes+human+RBC-NOS+activity%2C+NO+production+and+deformability+through+Akt+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway.</a> PLoS One. 7 (9), e45982(2012).</li>
<li>Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+ameliorates+superoxide+impairment+to+erythrocyte+deformability+with+concurrent+nitric+oxide+synthase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation.</a> Frontiers in Physiology. 10, 36(2019).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC-NOS-dependent+S-nitrosylation+of+cytoskeletal+proteins+improves+RBC+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability.</a> PLoS One. 8 (2), e56759(2013).</li>
<li>Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%2C+vasodilation+and+the+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell.</a> Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).</li>
<li>Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+red+blood+cell+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on red blood cell deformability.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).</li>
<li>Suhr, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+exercise+induces+changes+of+endothelial+nitric+oxide+synthase+pattern+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+red+blood+cell+deformability+is+independent+of+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).</li>
<li>Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-fractions+of+red+blood+cells+respond+differently+to+shear+exposure+following+superoxide+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment.</a> Biology. 10 (1), 47(2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC+NOS%3A+regulatory+mechanisms+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).</li>
<li>Kleinbongard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells+express+a+functional+endothelial+nitric+oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase.</a> Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).</li>
<li>McMahon, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+deformability%2C+vasoactive+mediators%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1417(2019).</li>
<li>Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+red+blood+cell-nitric+oxide+synthase+dependent+nitric+oxide+production+during+red+blood+cell+aging+in+health+and+disease%3A+a+study+on+age+dependent+changes+of+rheologic+and+enzymatic+properties+in+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells.</a> PLoS One. 10 (4), 0125206(2015).</li>
<li>Di Pietro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthetic+pathway+and+cGMP+levels+are+altered+in+red+blood+cells+from+end-stage+renal+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+patients+with+mild+COVID-19+symptoms+after+SARS-CoV-2+infection+show+prolonged+altered+red+blood+cell+morphology+and+rheological+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).</li>
<li>Mozar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+nitric+oxide+synthase+modulates+red+blood+cell+deformability+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+generated+by+red+blood+cells+following+exposure+to+shear+stress+dilates+isolated+small+mesenteric+arteries+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).</li>
<li>Nader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+therapy+modulates+sickle+cell+anemia+red+blood+cell+physiology%3A+Impact+on+RBC+deformability%2C+oxidative+stress%2C+nitrite+levels+and+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).</li>
<li>Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+circulation+activates+endothelial+nitric+oxide+synthase+in+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).</li>
<li>Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+and+RBC-NOS+Serine1177+Phosphorylation+in+humans%3A+a+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response.</a> Life. 11 (1), 36(2021).</li>
<li>Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+time+course+of+erythrocyte+deformability+following+exposure+to+shear+is+dependent+upon+conditioning+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress.</a> Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).</li>
<li>Grau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acute+exercise+on+RBC+deformability+and+RBC+nitric+oxide+synthase+signalling+pathway+in+young+sickle+cell+anaemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11813(2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Nitric+Oxide+Research%22">Methods in Nitric Oxide Research</a>. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).</li>
<li>Cortese-Krott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+red+blood+cells+at+work%3A+identification+and+visualization+of+erythrocytic+eNOS+activity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%3E%22%5BJournal%5D)">Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease.</a> Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).</li>
</ol>

すべての著者は、利益相反がないことを明らかにしています。

最近の文献は、RBC-NOSタンパク質がRBC変形能の調節にとって決定的に重要であることを強く示唆しており15,22,23、その結果、狭い毛細血管を通過することが促進されます24。タンパク質活性は、翻訳後タンパク質修飾、特に特定の残基のリン酸化に大きく依存します18。関心の焦点は、RBC−NOSタンパク質23の活性化に関するリン酸化部位1177にある。このタンパク質の変化は、さまざまな疾患で示されています25,26,27,28,29したがって、これらの変化の調査は、特定の疾患の理解だけでなく、特定の治療法の開発と指導にも貴重な知識を提供する可能性があります<sup clas...

赤血球(RBC)は心血管系を70〜140日間横断し、平均赤血球年齢は約115日です1,2。老化または損傷した赤血球は、マクロファージ3によって駆動される効率的な透明化プロセスである赤血球貪食によって循環から除去されます。これらの細胞の所定の寿命は、分化および成熟中に核、ミトコンドリア、およびリボソームを含む細胞小器官を放棄することの1つの結果である4。したがって、循環する赤血球は翻訳機構を欠いており、新しいタンパク質の合成を妨げています3。したがって、既存のタンパク質に対する動的な翻訳後修飾は、赤血球に作用する細胞外および細胞内ストレッサーに応答する急性の生化学的調節の唯一の実行可能なメカニズムを表しています5。
機械的な力は、赤血球内の生化学的経路の活性化または調節を引き起こす主要な細胞外手がかりであるように思われます。赤血球膜6における機械感受性タンパク質Piezo1の発見は、これらの細胞における機械的に活性化されたシグナル伝達を調査するいくつかの研究ラインに影響を与えました7。例えば、最近の進歩により、赤血球の物理的特性は、翻訳後リン酸化やユビキチン化を含むタンパク質8の急性かつ動的な変化によって活発に制御されていることが示されています9。これらの正常な修飾は特定の疾患で異なるため9,10,11、特にメカノバイオロアプロセスに関連して、RBCタンパク質の活性化状態を決定することは科学的および臨床的に興味深いようです。
赤血球タンパク質活性化状態の急激な変化の決定は、いくつかの方法論的課題をもたらします。例えば、後の分析のために赤血球サンプルを保存するには、翻訳後修飾は耐久性がないため、修飾された赤血球タンパク質を保存する必要があります。さらに、従来のタンパク質検出法(ウェスタンブロッティングなど)は、これらの細胞のタンパク質含有量の~98%を占めるヘモグロビンに比べてタンパク質の存在量が少ないため、赤血球で標準化することが難しいことで有名です12。したがって、化学的に保存された赤血球の抗体ベースの染色は、一酸化窒素合成酵素の赤血球特異的アイソフォーム(RBC-NOS)などの重要な赤血球タンパク質の急性修飾を調べる際に選択される方法となっています13,14。RBC-NOSは一酸化窒素(NO)を酵素的に生成することが示されており、これはRBC変形能を含む必須のRBC特性に不可欠であると思われる15,16,17。RBC-NOSの翻訳後修飾は触媒酵素活性を調節し、セリン1177残基のリン酸化は酵素活性を増加させると記載されているが、セリン114またはスレオニン495残基のリン酸化はRBC-NOS活性の低下と関連している18,19。
全体として、RBCタンパク質の一時的な修飾は重要な細胞機能に寄与し、これらの修飾タンパク質の検出を可能にする標準化されたプロトコルは高い価値があります。ここでは、RBC-NOSタンパク質活性化の検出を容易にするために特異的抗体を利用する2つの異なるプロトコルを提示し、データ分析と解釈のための推奨事項について説明します。
記載されたプロトコルの性能は、ヒト血管系内で起こるものを反映する機械的力(5Pa)に応答して、セリン1177残基におけるRBC−NOSのリン酸化のよく報告された増加を測定することによって評価した。

<table><tbody><tr><td>3,3&prime;-ジアミノベンジジン-四塩酸塩水和物</td><td>Sigma / Merck</td><td>D5637</td><td>DAB</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム&nbsp;</td><td>メルク/ミリポア</td><td>101145</td><td>NH4Cl</td></tr><tr><td>遠心分離機 5427 R&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5409000010</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップVWR</td><td></td><td>631-0147&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム水素二水和物&nbsp;</td><td>メルク /ミリポア</td><td>106580</td><td>Na2HPO4. 2 H2O</td></tr><tr><td>ディスポーザブルトランスファーピペット</td><td>VWR</td><td>612-6803</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck /Millipore</td><td>107961</td><td>顕微鏡用迅速封入剤</td></tr><tr><td>1 % メチルエチルケトン (MEK) ホ</td><td>フマン</td><td>642</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼを使用して変性したエタノール</td><td>シグマ/メルク</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>グリースペンシル&nbsp;</td><td>Dako</td><td>S 2002</td><td></td></tr><tr><td>西洋わさびペルオキシダーゼ/ExtrAvidin&minus;ペルオキシダーゼ</td><td>Sigma/Merck</td><td>E-2886</td><td>HRP</td></tr><tr><td>塩酸&nbsp;</td><td>メルク /ミリポア</td><td>109057</td><td>HCl</td></tr><tr><td>過酸化水素, 30%</td><td>メルク /ミリポア</td><td>107203</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>フリーウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー支援光学回転細胞分析装置 (LORCA)</td><td>RR メカトロニクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール メタ</td>サイトメーター <td>メルク/ミリポア</td><td></td><td></td>106009</tr><tr><td>顕微鏡スライドVWR</td><td></td><td>630-1985</td><td></td></tr>ニッケル<tr><td>(II)-硫酸塩六水和物&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>N4882</td><td>NiSO4.6H2O</td></tr><tr><td>Normal Goat serum</td><td>Agilent/DAKO</td><td>X0907</td><td>NGS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck /Millipore</td><td>818715</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Pipettes Eppendorf Reference 2</td><td>VWR</td><td>613-5836/ 613-5839</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177)</td><td>Merck/Millipore</td><td>07-428-I</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>反応チューブ、2ml</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体ヤギ抗ウサギ</td><td>Agilent/DAKO</td><td>E0432</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>メルク/ミリポア</td><td>106404</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム 一水和物</td><td>メルク /ミリポア</td><td>106346</td><td>NaH2PO4.H2O</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム, 1 M</td><td>メルク /ミリポア</td><td>150706</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン</td><td>メルク /ミリポア</td><td>108382</td><td>トリ</td></tr><tr><td>ス トリプシン</td><td>Sigma/メルク</td><td>T7409</td><td></td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>メルク/Millipore</td><td>822184</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Glasマイクロファイバーフィルター、品質GF / F</td><td>メルク/Millipore</td><td>WHA1825047</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWRケミカルズ</td><td>2,89,73,465</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-D-グルコース一水和物</td><td>メルク/Millipore</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr></tbody></table>

赤血球タンパク質の動的変化の免疫染色ベースの検出

Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins

赤血球(RBC)タンパク質の抗体標識は、全体的なタンパク質含有量の変化やタンパク質活性化状態の急激な変化を検出するために一般的に使用される半定量的な方法です。これにより、赤血球治療の評価、特定の病状の違いの特性評価、および細胞コヒーレンシーの説明が容易になります。急性に変化したタンパク質活性化(メカノトランスダクションなど)の検出には、一時的なタンパク質修飾を保存するための適切なサンプル調製が必要です。基本原理は、特異的一次抗体の初期結合を可能にするために、所望のRBCタンパク質の標的結合部位を固定化することを含む。サンプルは、二次抗体が対応する一次抗体に結合するための最適条件を保証するためにさらに処理されます。非蛍光二次抗体の選択には、ビオチン-アビジンカップリングや染色を開発するための3,3-ジアミノベンジジン-四塩酸塩(DAB)の適用など、追加の処理が必要であり、酸化を停止し、染色強度を時間通りに停止させるために顕微鏡下でリアルタイムで制御する必要があります。染色強度検出のために、画像は標準的な光学顕微鏡を用いて撮影される。このプロトコルの改変では、フルオレセイン標識二次抗体を代わりに適用することができ、これはさらなる開発ステップを必要としないという利点を有する。ただし、この手順では、染色検出のために顕微鏡に取り付けられた蛍光対物レンズが必要です。これらのメソッドの半定量的な性質を考えると、非特異的抗体反応とバックグラウンドシグナルを説明するために、いくつかのコントロール染色剤を提供することが不可欠です。ここでは、染色プロトコルと対応する分析プロセスの両方を提示し、さまざまな染色技術のそれぞれの結果と利点を比較および説明します。

RBCタンパク質の急性変化の検出を容易にする方法を記載した提示されたプロトコルを、周知の機械的に敏感なタンパク質変化、すなわちセリン1177残基におけるRBC-NOSのリン酸化について試験した。全血は健康なボランティアから得られ、その後2つの別々のアリコートに分割されました。所与の血液試料を生理的大きさ(5Pa)の機械的剪断応力に300秒間曝露し、これはセリン117714でRBC-NOSリン酸化を誘発することが以前に示された。機械的せん断暴露の停止直後に、血液サンプルをパラホルムアルデヒドで固定した。対照として、血液サンプルを露出させ、せん断装置に装填し、パラホルムアルデヒドに固定する前に300秒間静置した。安静時および機械的な力のばく露に応答してセリン1177残基でリン酸化されたRBC-NOSを標的とする抗体のシグナルを、免疫組織化学(図3A、B)および免疫蛍光(図3C、D)の両方を用いて評価した。せん...

除核された赤血球のタンパク質活性化の動的変化を捉えることは、後の評価のために急性刺激に対する動的変化を保存するなど、方法論的な課題をもたらします。提示されたプロトコルは、関連するタンパク質変化の保存と分析、およびその後の検出を可能にするサンプル調製および染色技術について説明しています。

Antibody labeling of red blood cell (RBC) proteins is a commonly used, semi-quantitative method to detect changes in overall protein content or acute ...

私たちの方法は、メカノバイオロジーの急速な分野で、一時的なタンパク質修飾を所定の位置に固定し、それらを特異的抗体で検出することにより、機構的な細胞内研究を可能にします。この方法は技術的に簡単に適用できます。結果は非常に有効で再現性があります。また、他の技術と比較して、私たちの方法は、一時的なタンパク質修飾、特に赤血球メカノシグナル伝達に依存する翻訳後赤血球シグナル伝達の新しい分野で実際に効果的に使用できます。赤血球タンパク質固定を行うには、全血を4%パラホルムアルデヒド溶液で1対2の割合で室温で20分間希釈します。132gの血液溶液を室温で3分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。RBCペレットを2容量の0.1モルPBSに再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。再度、サンプルを遠心分離し、RBCペレットを1容量の0.1モルPBSに再懸濁する前に上清を除去した。顕微鏡スライドに、サンプルIDとアルコール耐性ペンを使用して適用された抗体をラベル付けします。調製したRBC溶液を10マイクロリットル加える。2番目のスライドをサンプル上に45度の角度で置き、サンプルをスライドに沿って均等に分散させます。サンプルをブンゼンバーナーの上に5〜7秒間一定の動きでホバリングすることにより、スライドを熱固定します。免疫組織化学染色の場合は、グリースペンシルを使用して、スライドの2/3の領域をテストとしてマークし、1/3の領域をコントロールとしてマークします。次に、TBSを30秒間塗布してサンプル領域を2回洗浄します。2回目の洗浄後、0.1%トリプシンを添加し、蓋付きの専用のインキュベーションチャンバーを使用してスライドを覆います。サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。ビーカーに水道水を入れ、ビーカーからスライドに水道水を加えて酵素反応を停止します。溶液を注ぎ、TBSで両方の領域を3回洗浄します。最終洗浄後、ペルオキシダーゼ遮断溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を注ぎ、両方の領域をTBSで3回洗浄します。次に、3%スキムミルク溶液を加え、30分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を注ぎ、一次抗体溶液を試験領域に加えます。コントロールエリアに抗体コントロール溶液を追加します。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、抗体溶液を注ぎ、TBSで両方の領域を3回洗浄します。次に、非特異的結合を防ぐために3%正常ヤギ血清溶液を加え、30分間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を加え、30分間インキュベートします。抗体溶液を注ぎ、TBSで3回洗浄してから染色の展開に進みます。次に、アビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を行うために、希釈アビジンペルオキシダーゼ溶液を添加し、30分間インキュベートする。スライドを200倍の倍率で顕微鏡下に置き、調製したばかりのDAB溶液を両方の領域に加えます。赤血球の染色を継続的に監視し、背景が着色し始める前に使い捨てピペットでDAB溶液を除去して染色を停止します。サンプルの脱水を行うには、スライドをガラスラックに入れ、エタノール濃度を上げ、最後にキシロールにそれぞれ5秒間浸します。脱水後、スライドをティッシュペーパーの上に置き、RBCを上部にして余分な液体を吸収します。カバースリップに2滴または3滴の封入剤を追加し、カバースリップを使用してスライドを覆います。視覚化とイメージングのために、カメラと結合された透過光顕微鏡にスライドを置きます。光源とカメラの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。明視野モードで、粗いフォーカス調整ノブと細かいフォーカス調整ノブを回してRBCに焦点を合わせます。同様に、蛍光モードでRBCに焦点を合わせます。赤血球グレー値を分析するには、ImageJソフトウェア内の楕円選択ツールを使用して各赤血球のエッジをマークします。[測定]コマンドを使用して、テストの50個のRBCとコントロールの10個のRBCのグレー値を測定します。RBCタンパク質の免疫蛍光染色では、サンプルを二次蛍光標識抗体とともに室温で30分間インキュベートし、光から保護します。インキュベーション後、抗体溶液を注ぎ、スライドをTBSで3回洗浄します。最終洗浄後、TBSをサンプルに残します。サンプルを脱水し、示されているように顕微鏡評価用のカバースリップでスライドを準備します。顕微鏡と蛍光灯をオンにし、明視野モードで赤血球に焦点を合わせます。ランダムに選択されたスライドのテスト領域の少なくとも3つの異なる領域で明視野および蛍光画像をキャプチャします。蛍光画像の露光時間を1秒に設定し、画像をキャプチャします。次に、明視野モードに切り替え、露出時間を自動に設定して、対応する明視野画像をキャプチャします。画像をTIFF形式で保存します。スライドの制御領域の少なくとも2つの異なる無作為に選択された領域で蛍光および明視野画像をキャプチャします。画像をTIFF形式で保存して、ピクセルの元のグレー値を保持し、圧縮を防ぎ、取得のメタデータを保持します。キャプチャされた赤血球のグレー値を測定するには、ImageJ を開きます。楕円選択ツールで各セルをマークし、[計測] コマンドを使用して解析します。RBCのない3〜5つの領域を強調表示し、グレー値を決定してバックグラウンド信号を測定します。キャプチャされた画像の代替データ分析を実行するには、フィジー リリースの ImageJ を使用してマクロ コマンドを作成し、特定の画像の自動選択、背景補正、およびグレー値分析を行います。フィジーで分析するために TIFF 形式の画像を開きます。次に、RBC蛍光を開きます。ijm マクロをクリックし、「実行」をクリックします。RBC一酸化窒素合成酵素(NOS)を標的とする抗体のシグナルは、安静時および機械的な力のばく露に応答してセリン1177残基でリン酸化され、免疫組織化学と免疫蛍光の両方を使用して評価されました。免疫組織化学的または免疫蛍光法のいずれかで評価した場合、それぞれの剪断されていない細胞と比較して、セリン1177残基でリン酸化されたRBC-NOSに対する抗体のシグナルの3倍の増加が、それぞれの剪断されていない細胞と比較して検出されました。ユーザーは、抗体がテスト領域にのみ適用されていることを確認する必要があります。そうしないと、コントロールがないためにサンプルを分析できません。多種多様な抗体が利用できることを考えると、この方法を使用して、多くの異なるタンパク質およびシグナル伝達プロセスを標的とすることが可能です。

immunostaining-based-detection-dynamic-alterations-red-blood-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋ラット中枢神経系(CNS)および末梢リンパ節(LN)組織切片における二重免疫染色のための最適化された詳細なプロトコールを紹介します。...

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

ここでは、赤血球に対する抗体により誘導される補体活性化を測定するための2つのアッセイを記載する。現在のアッセイ以上の主要な利点は、それらの定量的かつ簡単に解釈する性質である。...

赤血球上の抗体誘導性補体活性化の定量的検出のための方法

主要組織適合性複合体クラスII dextramersとの直接染色により脳及び心臓における自己反応性CD4 T細胞を検出するためのプロトコルは、このレポートに記載されている。総合的な分析のために、 その場での抗原特異的CD4 + T細胞の頻度を列挙するための信頼できる方法も考案されている。...

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。...

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

単球は自然免疫の主要な調節因子であり、末梢の単核食作用系の更新や炎症の場合に重要な役割を果たします。この原稿では、単球の動員メカニズムを研究するためのマウスのカルバリア骨髄のリアルタイムイメージングの手順について説明します。...

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

機能的および表現型分析のために、抗原反応性B細胞を検出し、豊かに磁性ナノ粒子を使用するシンプルで効果的な方法が記載されています。...

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

眼循環中の標識された血液細胞の生細胞イメージングは​​、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における炎症および虚血に関する情報を提供し得る。血球を標識し、網膜循環中の標識細胞を画像化するプロトコルが記載されている。...

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。...

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

フリーフローティング技術により、研究者は固定組織切片で免疫組織化学を含む組織学的ベースの染色を行い、生物学的構造、細胞タイプ、タンパク質の発現と局在を視覚化できます。これは効率的で信頼性の高い組織化学的手法であり、脳、心臓、肝臓などの多数の組織の調査に役立ちます。...

自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色

学ぶ赤血球タンパク質の動的変化を免疫染色で検出する方法。パラホルムアルデヒド固定と抗体染色により、赤血球のメカノシグナル伝達における一時的なタンパク質修飾を再現性高く解析できます。

赤血球タンパク質の動的変化の免疫染色ベースの検出

さらに動画を探す