肺腺癌に対する トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギ の作用機序のネットワーク薬理予測と実験的検証

伝統的な漢方薬、ターゲットの多成分の特徴について話します。これは、ネットワークおよび生物学研究のための非常に基本的なボックスです。閾値を下げる技術のデモを行いました。

ネットワーク薬理学は体系的な分析技術であり、多因子の相互作用ネットワーク作業のツールを構築します。ネットワーク薬理学のデータはデータベースから来ていますが、伝統的な漢方薬の単一の経路を効果的に予測できますが、薬物、タンパク質との関係を予測することはできず、これはその後の実験によって検証する必要があります。HERBデータベースを開き、Gua LiuとZhebimuをキーワードとして使用して、2つの薬の成分を取得します。

2つの薬のリストと標準的なSMILES構造をダウンロードしてください。次に、経口バイオアベイラビリティと薬物様値を持つ成分をHERBグループデータベースに含めることにより、得られた成分が活性であるかどうかを判断します。成分に経口バイオアベイラビリティーと薬物様値がない場合は、その成分をSwiss ADMEデータベースに入力して、各成分に関する情報を入手してください。

GI吸収が高く、少なくとも2つのはい薬物様値を有する成分を活性成分として含む。アクティブなコンポーネントのターゲットを予測するには、HERBデータベースを開きます。アクティブなコンポーネントの正規の SMILES 構造を検索してコピーします。

次に、類似アンサンブルアプローチを開き、アクティブなコンポーネントの正規のSMILES構造を検索ボックスに貼り付けます。クリック TRY SEA'ターゲットキーターゲット名 P 値、および各アクティブコンポーネントの最大TCを取得します。データをスプレッドシートにコピーし、スプレッドシートファイルフィルタリング機能を使用して、ターゲットキーでアクティブなコンポーネントターゲットをフィルタリングします。

すべてのターゲットをスプレッドシートにコピーし、重複を削除してドラッグターゲットを取得します。次に、遺伝子カードデータベースとオンラインメンデル遺伝を開いて、病気の標的を予測します。肺腺癌の疾患標的を取得するためのキーワードとして肺腺癌を使用してください。

疾患ターゲットのスプレッドシートをダウンロードし、繰り返しターゲットを削除して、肺腺癌ターゲットを取得します。肺腺癌関連標的と創薬標的を新しいスプレッドシートの同じ列にコピーして、薬物成分疾患標的ネットワークを構築します。ツールバーの重複データ識別機能を使用して、肺腺癌関連ターゲットとトリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギア活性成分関連ターゲットの交差ターゲットを取得します。

サイトスケープ3.8.0を開きます。メニューバーでファイルをクリックし、インポートを選択します。続いてファイルからネットワークが続きます。

スプレッドシートファイルをインポートするには、左側のコントロールパネルのスタイルバーを使用してネットワークノードのサイズと色を最適化します。ネットワーク トポロジ解析には、ネットワークの解析機能を使用します。メニューバーのツールをクリックし、[ネットワークの分析]を選択します。

テーブルパネルで、タイトルバーの次数をクリックして、コンポーネントを度数ごとに降順に並べます。上位10のコンポーネントとターゲットを主要なアクティブコンポーネントとコアターゲットとします。PPIネットワークを構築し、コアタンパク質をスクリーニングする。

文字列データベースを開き、肺腺癌に対するトリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギアの潜在的なターゲットのテキスト形式リストを名前のリストのダイアログボックスに貼り付けます。次に、生物のホモサピエンスを選択します。[検索]をクリックして[続行]ボタンを選択し、結果が利用可能になったら、[設定]をクリックします そして、高い信頼度0.700にチェックマークを付けます 基本設定では、最低限必要なインタラクションスコアの下で、詳細設定でネットワーク内の切断されたノードにチェックマークを付けます。

次に、更新ボタンをクリックします。次に、タイトルバーのエクスポートをクリックし、PPI関係の短い表形式のテキストをTSV形式でダウンロードします。サイトスケープ3.8.0を開きます。

ファイルをクリックし、選択し、インポートし、ファイルからネットワークをクリックして、視覚的な分析のためにTSV形式のファイルをインポートします。ネットワークアナライザ機能を使用して、トポロジ解析を実行します。左側のコントロールパネルのスタイルバーを使用して、ネットワークノードのサイズと色を最適化します。

KEGGエンリッチメント分析を実行するには、Medscapeプラットフォームを開き、潜在的な治療標的のテキスト形式リストをダイアログボックスに貼り付けてから、送信ボタンをクリックします。種としての入力と種としての分析の両方でホモサピエンスにチェックマークを付け、カスタム分析ボタンをクリックします。[エンリッチメント] を選択します。

KEGG 経路のみにチェックマークを付け、エンリッチメント分析をクリックします。進行状況バーが 100% に達したら、分析レポート ページのオレンジ色のボタンをクリックして、エンリッチメント結果を表示します。1つのzipファイルですべてをクリックします'エンリッチメントの結果をダウンロードし、Enrichment_GO'フォルダー内の_FINAL_GO csvファイルを開いて結果を取得します。

R-ソフトウェアを開き、タイプインストールパッケージGGプロット2'とライブラリGGプロット2'in RGGプロット2Rパッケージのインストール用。Enter キーを押して、KEGG ビジュアライゼーション プログラムを実行します。細胞の生存率を検出するには、対数増殖期A 549細胞を1ミリリットルの0.25%トリプシンで摂氏37度で1分間消化します。

1ミリリットルのDMEM完全培地を加えてトリプシンを中和し、穏やかに吹き飛ばして細胞の脱落を促進します。次いで、混合物を遠心分離して細胞ペレットを得、得られた細胞を再懸濁し、DMEM完全培地を用いた。細胞懸濁液を血球計算盤に加え、自動セルカウンターを使用してカウントし、DMEM完全培地を使用して、ミリリットルあたり10〜4番目の細胞に5倍に希釈します。 次に、1グラムのトリコサンテスフリティラリアツンベルギア水抽出物を10ミリリットルのPBSに溶解し、0.22マイクロメートルのフィルターでフィルター滅菌します。

PBSを使用して混合物を異なる濃度に希釈する。100マイクロリットルの希釈細胞を96ウェルプレートの各ウェルにプレートする。細胞接着後、異なる濃度のトリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギア水抽出物を1マイクロリットル加えて、各ウェルの濃度を調整します。

24時間の培養後に元の培地を廃棄し、100マイクロリットルのDMEMを追加します。摂氏37度と5%二酸化炭素で2時間さらにインキュベートするための基本培地。インキュベーションの最後に、20マイクロリットルのMTS溶液を加え、さらに1時間細胞をインキュベートします。

インキュベートした混合物を別のプレートに移します。マイクロプレートリーダーを使用して、490ナノメートルの波長で吸光度を測定し、細胞生存率を計算します。対数増殖期A 549細胞を1ミリリットル当たり10〜5細胞に5倍に希釈する。

2ミリリットルの細胞懸濁液を6ウェルプレートに加え、12時間増殖させる。前に示したように、トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギア水抽出物の異なるPBS希釈液を取得した後、20マイクロリットルのPBS溶液をブランクコントロールグループに追加し、トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギア水抽出物のさまざまな希釈液を20マイクロリットルを異なる濃度グループに追加します。24時間の介入後、上清を廃棄し、PBSで細胞を3回洗浄します。

250マイクロリットルのRIPAバッファーを各ウェルに加え、細胞を30分間溶解します。遠心分離用のライセートを回収し、上清を得る。肺腺癌に対するトリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギアの薬剤成分疾患標的相互作用ネットワークが示されている。

相互作用ネットワークでは、得られた上位10の活性成分は、肺腺癌の治療におけるトリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギアの作用の重要な活性成分である。PPIネットワークには、122の機能性タンパク質と210の相互作用関係が含まれていました。上位10のコアタンパク質は、主に新血管新生、細胞増殖、アポトーシス、細胞膜輸送に関与しています。

KEGGがランク付けした上位20の経路のうち、PI3K-AKTシグナル伝達経路、Rap1シグナル伝達経路、ホスホリパーゼ-Dシグナル伝達経路、およびMAPK1シグナル伝達経路は肺がんと密接に関連しており、その中でPI3K-AKT経路が第1位にランクされました。トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギア抽出物は、ミリリットルあたり400マイクログラムを超える濃度で細胞増殖を阻害することができ、ミリリットルあたり800マイクログラムまでの濃度でのA-549細胞に対する阻害効果は、阻害濃度の半分に近かった。トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギア抽出物の介入は、各グループでAKTタンパク質発現に有意な変化を引き起こしませんでした。.

しかし、p-AKTセリン-473発現は抑制され、用量依存的な効果を示した。トリコサンテス・フリティラリア・ツンベルギアの重要な成分はPI3K AKT経路の主要タンパク質と分子ドッキングしており、結果は、ディオスメチンとケンペロールのAKT1との結合エネルギーがマイナス7未満であり、強い結合活性を示すことを示唆しました。最も重要なことは、伝統的な中国医学の目標で有効成分を達成したことです。

そのターゲットがネットワーク薬理学の中核であるだけでなく。