Name: 2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶ心収縮性調節療法の評価法。ヒトiPS細胞由来心筋細胞を用いた非侵襲的アプローチで、柔軟性基質とビデオ顕微鏡を活用し、心臓電気生理学デバイスの再現性ある評価を可能にします。

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この作業は、米国エネルギー省と米国食品医薬品局の間の省庁間協定を通じて、オークリッジ科学教育研究所が管理する機器および放射線衛生センターの研究参加プログラムへの任命によって部分的にサポートされました。著者らは、リチャード・グレイ、トレント・ロバートソン、アンナ・アビラの提案と技術支援に感謝します。この研究は、米国食品医薬品局の科学工学研究所を通じて資金提供されました。

1.プレートとメディアの準備
注:典型的な細胞外マトリックス(ECM)ベースのヒドロゲルアリコートは、-20°Cで保存された滅菌1.5 mLチューブ中で~200 μLです。
<ol><li>滅菌組織培養フード内で、2mLの0.1%ゼラチン(材料表)を各ウェルに移して滅菌6ウェルプレートを作製する。蓋を6ウェルプレートに置き、コーティングプレートを37°Cで最低1時間インキュベートします。</li>
	<li>柔軟なヒドロゲル基材にhiPSC-CMを播種する1日前に、氷上で冷蔵庫でヒドロゲル(材料表)アリコートを解凍します。</li>
	<li>500 mLのRPMI 1640、10 mLの50x B-27サプリメント、および5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン9を混合して、心筋細胞培地(材料の表)を準備します。</li>
</ol>2. 凍結保存したヒPSC-CMの播種
<ol><li>柔軟なヒドロゲル基材にhiPSC-CMを播種する2日前に、0.1%ゼラチンコーティングされた滅菌6ウェルプレートにhiPSC-CMをプレプレートします。標準の解凍プロトコル9,25を使用してhiPSC-CMを解凍します。</li>
	<li>次いで、1ウェルあたり合計1,500,000個のhiPSC-CM(材料表)を製造元の指示に従ってプレート化します(図1A)26。</li>
	<li>hiPSC-CMを標準的な心筋細胞培地で2〜4日間培養し、37°Cおよび5%CO2での凍結保存からhiPSC-CMを回復させます。使用済みの培地を48時間ごとに100%心筋細胞培地でリフレッシュします。</li>
</ol>3. プレプレーティングされたhiPSC-CMの解離とカウント
<ol><li>解離する前にhiPSC-CMの状態を確認してください。hiPSC-CMの健康状態を評価し、生存率と安定した拍動を確保します。 注:hiPSC-CM集団の純度は重要です(例:>90%心筋トロポニンT)7。心筋細胞選択法(例えば、代謝選択または選別)は、非心筋細胞25、26によるヒドロゲル基質の破壊を減少させるために推奨される。</li>
	<li>CaCl2 またはMgCl 2を含まないD-PBSのウェルあたり4 mLでhiPSC-CMを2 回洗浄します(材料の表)。D-PBSを吸引し、各ウェルに室温解離試薬1 mLを加え、37°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>10 mLの心筋細胞培地を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに加えます。</li>
	<li>1,000 μLピペットで6ウェルプレートからhiPSC-CMを解離します(図1B)。細胞懸濁液を15mLコニカルチューブ26に加える。</li>
	<li>1 mLの新鮮な心筋細胞培地でウェルをすすぎ、残っているhiPSC-CMを収集し、15 mLのコニカルチューブに追加します。円錐管の最終容量を15mLにします。</li>
	<li>5分間遠心分離する(200 × g)。1mLマークまで上清を除去します。細胞を心筋細胞培地に最終容量5 mLまで再懸濁します。</li>
	<li>手動または自動のセルカウンターでhiPSC-CMをカウントします。</li>
	<li>柔軟なヒドロゲル基質を調製している間、室温でhiPSC-CM懸濁液をインキュベートします(最大30分)。</li>
</ol>4.柔軟なヒドロゲル基質の調製
<ol><li>1 μLにセットされた20 μLピペット、20 μLのピペットチップ(20 μLなど)、および滅菌済みの48ウェルガラス底板を準備します。ヒドロゲル基質を作る前に、ストップウォッチ/タイマーの準備ができていることを確認してください。</li>
	<li>滅菌組織培養フード内で、チューブを軽くたたいてECMベースのヒドロゲル基質を混合し、すぐに氷上に戻します。</li>
	<li>次に、最初のヒドロゲル基板がメッキされる直前にストップウォッチ/タイマーを開始します-これは時間ゼロです。</li>
	<li>ヒドロゲル基質1 μLを上下~3倍にピペットし、ピペットチップを冷却します。~1 μLの未希釈のヒドロゲル基質を48ウェルプレートの各ウェルの底に水平に塗布し(図1C、図2A、および図3A)、ピペットを45°の角度で保持します。各ウェル中の全てのヒドロゲル基質を同じ向きでプレートし(図2および図3)、40倍の倍率7、9、17、27で実験を行う際に基質を同定するのを助ける。 注:各~1 μLラインは1つのヒドロゲル基質です(図3)。通常、48ウェルを準備するのに~5分かかります。水平に傾斜したマイクロプレートスタンド(例えば、30°)を使用すると、ウェルの底部とヒドロゲル基質をよりよく見ることができます。必ず井戸の全長(つまり、左から右)に行ってください。短いヒドロゲル基質は厚すぎる可能性があり、したがって基質安定性を低下させる。ヒドロゲル基質をピペットチップで乾燥させないでください。これが発生した場合は、すぐに新しいヒントに切り替えて、すぐに続行してください。あるいは、チルドピペットチップを使用することもできます。ECMベースのヒドロゲル基質は、氷上にない場合に急速に重合する可能性があります。一度に複数のウェル(例えば、10個)の調製が推奨される。さらに、模擬48ウェルプレートでの練習をお勧めします。</li>
	<li>蓋を48ウェルプレートに置き、細胞を添加する前に、ヒドロゲル基質を滅菌組織培養フード内で室温で8〜10分間インキュベートします(図2B)。 注:推奨されるインキュベーション時間を守ることが重要です。10分を超えるインキュベーション時間は、ヒドロゲル基質が硬くなり、目に見える収縮がなくなります。インキュベーション時間が8分未満の場合、基質が崩壊する可能性があります。</li>
	<li>1,000 μLのピペットを使用して、1ウェルあたり~30,000個の生存可能なhiPSC-CMを~200 μLの低培地培地に、ヒドロゲル基質に直接滴下します(図2Bおよび図3B)。 注:このプロセスは、ヒドロゲル基質の重合を停止し、hiPSC-CMが基質7、9、17、27上にあることを確認します。</li>
	<li>プレートに蓋を置き、hiPSC-CMを滅菌組織培養フード内で室温で10〜15分間邪魔されずにインキュベートし(図2C)、hiPSC-CMがヒドロゲル基質に接着できるようにします。</li>
	<li>~100 μLの新鮮な心筋細胞培地を各ウェルに穏やかに加えます(最終容量:ウェルあたり~300 μL)。プレート上に蓋を置き、37°C、5%CO2 のインキュベーターに2〜4日間移す。収縮実験を行う前に、24時間ごとに100%培地をリフレッシュしてください。 注意: hiPSC-CMが正しい形態であるかどうかを目視検査します。めっき直後は、hiPSC-CMは丸く見えるはずです(図3B)。播種後2日目までに、コンフルエントな2D hiPSC-CM単層シンシチウムが観察され(図3C)(補足ビデオS1)、強力な目に見える収縮(補足ビデオS2)が観察されます。</li>
</ol>5.収縮の記録と分析
<ol><li>CaCl2 0.5、NaCl 134、KCl 5.4、MgCl2 1、グルコース10、およびHEPES 10を含むタイロード溶液であるCCMアッセイ培地を調製し、NaOHでpHを7.4に調整し、水浴中で37°Cに平衡化します。 注:最大以下の細胞外カルシウム(0.5 mM)は、CCMアッセイウィンドウを強化するために使用されます。</li>
	<li>顕微鏡と環境制御チャンバーの電源を入れて、37°Cと5%CO2に平衡化します。</li>
	<li>心筋細胞培地を48ウェルプレートから取り出し、600 μLのCCMアッセイ培地で各ウェルを2回穏やかにすすぎます。</li>
	<li>ウェルあたり300 μLのCCMアッセイ培地を加え、48ウェルプレートを環境制御チャンバー内の顕微鏡上に置きます。電極を挿入し、セルを5分間平衡化します。</li>
	<li>ビデオベースの顕微鏡を使用して、収縮ビデオを記録します。ビデオ録画ソフトウェアを開き、フレーム レート を 100フレーム/秒に設定します。hiPSC-CM単層の中心付近の関心領域(ROI)を選択します。 注意: hiPSC-CM単分子膜の端近くでROIを選択すると、収縮記録では不安定になる可能性があるため、選択しないでください。</li>
	<li>次に、市販のパルス発生器(材料表)で細胞を電界刺激し、2D hiPSC-CM単層を電気的にペースアップします。ベースラインパルスパラメータを使用して、1Hzで1.5倍のしきい値でhiPSC-CMのペースを調整します(例:2ミリ秒の刺激パルス持続時間が~14 V/cmの単相矩形波ペーシングパルス)17。</li>
	<li>ベースラインを記録し、ペーシングのみ(すなわち、CCMの前)(図1D)収縮ビデオを最低5ビート17、28分間記録する。</li>
	<li>次に、実験的な電気信号でhiPSC-CM単層を刺激します(図1D)。このプロトコルに従うには、標準のCCM刺激パラメータを使用します:5.14ミリ秒の位相持続時間(合計持続時間20.56ミリ秒)、~28 V / cm(位相振幅)、ゼロ位相間間隔、および30ミリ秒の遅延(つまり、ペーシングパルスの終了からCCMパルスの開始までの時間)の2つの対称的な二相性パルス(図1D)29,30 、CCM誘発収縮ビデオを最低5拍記録します。</li>
	<li>CCM信号をオフにし、ベースラインペーシングパルスで刺激し、回復期間(つまり、CCM後)の収縮ビデオを最低5拍記録します。</li>
	<li>標準の収縮ソフトウェアを使用して、収縮ビデオを自動的に分析し、主要な収縮特性(収縮振幅、収縮勾配、緩和勾配、ピークまでの時間、ベースラインまでの時間90%、収縮持続時間50%など)を定量化します7、17、31、32。</li>
	<li>フレキシブルヒドロゲル基板上の2D hiPSC-CMを使用して、基板にめっきしてから2〜14日目までの収縮実験を行います。</li>
</ol>

この記事は著者の見解を反映しており、米国食品医薬品局の見解や方針を表すと解釈されるべきではありません。商業製品、その出所、またはここで報告された資料に関連するそれらの使用についての言及は、保健社会福祉省によるそのような製品の実際のまたは黙示の承認として解釈されるべきではありません。著者は、この作品に対する競合する利益を宣言しません。

本明細書で概説するプロトコルは、市販の試薬7、17を用いて柔軟な細胞外マトリックス(ECM)ベースのヒドロゲル基質上に頑健に収縮する2D hiPSC−CM単層を生成する方法を記載している。柔軟なヒドロゲル基質に播種されたhiPSC-CMは生存性を維持し、収縮特性を強化しています7。この技術は、標準的な実験装置と機能に依存しています7。プロトコルには、ECMベースのヒドロゲル基質での作業など、細部に細心の注意を払う必要があるいくつかの重要なステップがあります。潜在的な問題の1つは、培地中の血清の存在です。これにより、hiPSC-CMがコンフルエントな単層シートの代わりにネットワーク(内皮/血管ネットワークなど)を形成する可能性があります。したがって、柔軟なヒドロゲルhiPSC-CM単分子膜の確立中(すなわち、0日目から4日目)には無血清培地が推奨されます。同様に、一度に多くのヒドロゲル基質を準備すると、オペレーターの疲労により基質が貧弱または不均一になる可能性があります。迅速に作業することは重要ですが、各ヒドロゲル基質の完全性は重要です。同様に、hiPSC-CMを慎重に播種し、培地を交換する必要があります。これは強制的に行われるべきではありません。培地を交換するときは、ヒドロゲル基質または細胞を破壊しないように、ウェルの上端から穏やかに添加する必要があります。標準的な2D hiPSC-CM培養(従来の組織培養プラスチックまたはガラス)と同様に、低密度でめっきすると、不完全な単層形成が生じます。hiPSC-CMを目視検査してハイドロゲル基板上にあることを確認し、タイマーを使用して正確なタイミングを確保することが重要です。さらに、ヒドロゲル基材上で2D hiPSC-CM単分子膜を14日以上培養すると、ECM特性および基材の製造元からの指示に基づいて、単層破壊が生じる可能性があります。
現在の方法には、考慮しなければならないいくつかの制限があります。まず、このプロトコルで使用された細胞は市販のhiPSC-CMプロバイダーからのものであり、それらの細胞は電気的に結合された細胞の合胞体を形成します。合胞体には、3つの心臓サブタイプ(心室、心房、結節)すべてからのhiPSC-CMの混合物が含まれています17。研究は、サブタイプのみのhiPSC-CM集団(すなわち、100%心室または100%心房)から利益を得る可能性があります。第二に、この方法はhiPSC-CMのみを使用しましたが、心臓線維芽細胞、内皮細胞、ニューロンなどの非筋細胞はhiPSC-CM機能を増強する可能性があります22,36。第三に、2D hiPSC-CMは、自発拍動、非晶質形態、変力応答の欠如など、比較的未成熟な心筋細胞のいくつかの特徴を示します8,37。第四に、このプロトコルは頑健に収縮する2D hiPSC-CM単層を生成しますが、操作された心臓組織(ECT)などの機能的に強化された3D hiPSC-CMモデルは、生理学的カルシウム濃度8,38の下でCCM誘発収縮応答の増強をもたらす可能性があります。最後に、ここで説明するプロトコルは、48ウェルフォーマット用に設計されています。ただし、最適化と自動化を含めることで、これをハイスループット形式(96ウェルまたは384ウェルプレートなど)に拡張できます。
hiPSC-CM研究の現在のゴールドスタンダードは、従来の硬質2D培養条件(組織培養プラスチックまたはガラス)です。電気生理学3およびカルシウム取り扱い39の研究には有用であるが、従来の方法論は最小限の収縮特性をもたらす5、6、7。その結果、従来の硬質2D培養条件は、CCM収縮効果の評価には適していません8。機能的に強化された3D hiPSC-CM ECTメソッド38は、技術的に困難で時間がかかり、すべてのラボですぐに利用できるわけではない高度な機器を必要とします。このプロトコルでは、3D ECT法または長期の従来の2D法よりも短い時間枠で堅牢に収縮する2D hiPSC-CM単分子膜を生成する簡単な方法論について説明します7,40,41。さらに、ここで使用される試薬は、ヒドロゲル基質およびhiPSC-CMを含む市販されており、どちらもロット間の一貫性がかなりあります。取り外し可能な白金線電極(電極間距離:2.0 mm、幅:1.0 mm)を使用しましたが、さまざまな電極材料と構成がin vitroでのCCM収縮性評価に適しています8,15,17,18,22。同様に、収縮ビデオの分析を可能にする複数の自動ソフトウェアが利用可能です7,31,32。
心臓医療機器の収縮性を評価する非臨床的方法の大部分は、費用のかかる in vivo 動物モデル(イヌやブタなど)と技術的に困難な乳頭筋ストリップ(ウサギなど)に大きく依存しています18。この論文は、収縮性に対する心臓電気生理学医療機器信号の影響を評価するためのヒト in vitro モデルについて説明しました。このツールは、動物実験への依存を減らし、心臓電気生理学デバイスの収縮特性の in vitro 評価に役立つ可能性があります。

米国の人口が高齢化するにつれて、心不全患者の数は、直接的な医療費とともに増加し続けています1,2。心不全を治療するための新しい治療法と、そのような治療法をテストするための革新的な非臨床方法論を開発することが非常に重要です。ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、治療薬開発プロセスを支援するためのin vitroツールとして提案されており、規制当局への提出で使用されています3,4。しかし、標準的な硬質2D培養条件(従来の組織培養プラスチックやガラス)でプレーティングした場合の堅牢な収縮特性がないため、収縮性研究への普及は限られていました5,6,7,8。我々は以前、単離された単一のhiPSC-CMを柔軟なヒドロゲル基板上にめっきして、堅牢な可視収縮特性を生成することの有用性を実証しました9。単離されたhiPSC-CMは、新たに単離された成体ウサギ心室心筋細胞と同等の収縮特性を有することを示した。さらに、薬理学的薬剤に対する収縮応答を評価するためのこの方法の有用性を実証した7。さらに、他の研究では、この技術を基礎科学および疾患モデリングの機構評価に適用しています10,11,12。ここでは、この方法論を2D hiPSC-CM単層に拡張し、生理学的に関連する心収縮性調節(CCM)医療機器の電気信号をin vitroで評価する際のその有用性が実証されています。
CCMは、心周期の絶対不応期に非興奮性電気生理学的信号が心筋に送達される心内心不全療法である13,14。ヒト心臓細胞モデルにおけるCCMを評価するための再現性のある方法は不足しています。これまでの研究では、CCM収縮応答を評価するために様々な心臓細胞モデルが用いられてきた。我々は、新たに単離されたウサギの心室心筋細胞が、カルシウムの一時的な増加および収縮振幅15によってCCM刺激に応答することをin vitroで実証した。単離された犬の心室心筋細胞における別の研究は、細胞内カルシウム一過性振幅16のCCM誘発性の増強を示した。ただし、CCM研究の大部分は、エクスビボおよびインビボの動物製剤を使用しています。これらの研究は、さまざまなCCMパルスパラメータと種を適用するため、互いに相関させることは困難です17。単離されたウサギ乳頭モデルにおける1つの研究は、CCM誘発収縮性の増加を明らかにしました8,18、そして一連の心臓全体の研究は、CCM誘発性の収縮機能の増強を示しました19,20,21。これらの研究は、重要な機構的洞察を提供してきました。しかし、CCMを含むin vitro心臓EP収縮研究のための再現可能なヒトモデルが不足している。そのために、我々はいくつかの2Dおよび3D hiPSCモデルを開発し、CCMによる収縮特性の増強をパラメータ依存的に実証しました。さらに、CCM誘発変力効果は、ニューロン入力およびβアドレナリン作動性シグナル伝達によって部分的に媒介されることが見出されている8、17、22。それでも、CCM療法のメカニズムについてより多くのことを知る必要があり、収縮するヒト心筋細胞を利用することで、この結果を達成するのに役立ちます。そのため、新しいCCMデバイスおよびシグナルを評価し、規制プロセスを迅速化し、動物モデルの負担を軽減し、デバイス開発者の意思決定を支援するためのヒト非臨床ツールを開発することが非常に重要です8,17,23,24。コストを削減するために、あらゆるラボに転送でき、標準機器と低セル要件を使用する、簡単で日曜大工のプロトコルを開発することが重要です。この方法は、ヒト心筋細胞機能に対するCCM刺激の効果を解明し、CCMの安全性または有効性に関する重要な洞察を提供します17。ここでは、柔軟なヒドロゲル基板上に2D hiPSC-CM単層を生成し、健康と疾患における急性心臓電気生理学医療機器(すなわちCCM)収縮反応を定量化するための標準化された非臨床ツールを製造する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>0.1%ゼラチン</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>プレプレーティング培養基材</td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>MatTek&nbsp;</td><td>P48G-1.5-6-F</td><td>ハイドロゲル基質 hiPSC-CM 培養、ガラス</td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>140675</td><td>hiPSC-CM 培養、プラスチック</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント、インスリン配合</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>心筋細胞培地</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>c70-500</td><td>Tyrode'</td></tr><tr><td>CellOPTIQプラットフォームとソフトウェア&nbsp;</td><td>クライドバイオサイエンス収縮</td><td></td><td>記録および分析</td></tr><tr><td>コニカルチューブ15mL</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>352099</td><td>hiPSC-CM 解離</td></tr><tr><td>デジタルCMOSカメラ</td><td>浜松</td><td>C11440-42U30</td><td>収縮動画収録</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>14190-144</td><td>セルウォッシュ</td></tr><tr><td>環境制御室</td><td>OKOLAB INC</td><td>H201-K-FRAME</td><td>環境調節</td></tr><tr><td>グルコース&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G8270-1kg</td><td>タイロード's solution</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-107</td><td>hiPSC-CM Counting</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode'溶液</td></tr><tr><td>iCell 心筋細胞 めっき培地</td><td>富士フイルムセルラーダイナミック社&nbsp;</td><td>M1001</td><td>hiPSC-CM めっき培地</td></tr><tr><td>iCell 心筋細胞2, 01434</td><td>富士フイルム セルラーダイナミック社&nbsp;</td><td>R1017</td><td>hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>インキュベーター(37°C;C、5%CO2)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>50116047</td><td>hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>を維持する 倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX73</td>イメージング <td>hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl2)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>m33-500</td><td>タイロードs溶液</td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子還元基底膜マトリックス</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>356230</td><td>フレキシブルヒドロゲル基質</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td>ヒ<td>ドロゲル基質アリコート</td></tr><tr><td>モデル4100分離高出力刺激装置</td><td>AM-Systems</td><td>モデル4100&nbsp;</td><td>パルス発生器</td></tr><tr><td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td><td>富士フイルムセルラーダイナミック社&nbsp;</td><td>R1153</td><td>DCM hiPSC-CMs</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>心筋細胞培地</td></tr><tr><td>ピペット L-20</td><td>レイニン</td><td>17014392</td><td>プレーティング ハイドロゲル基質</td></tr><tr><td>ピペット P1000</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、1000 ul</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-707-509</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、20 ul</td><td>レイニン</td><td>GPS-L10S</td> 塩化カリウム(KCl)<td>製ヒドロゲル基材&</td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P330-500</td><td>タイロード溶液</td></tr><tr><td>RPMI 1640、グルコース&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>心筋細胞培</td></tr>地 <tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>s641-212</td><td>Tyrode'水</td></tr><tr><td>酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Tyrode's solution</td></tr><tr><td>Stimulation Electrodes</td><td></td><td></td><td>Pacing and CCM Stimulation</td></tr><tr><td>Stopwatch/Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-261-840</td><td>Plating Hydrogel Substrate</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>hiPSC-CM Counting</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>12605-010</td><td>hiPSC-CM解離</td></tr></tbody></table>

2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は現在、複数の in vitro アプリケーションのために検討されており、規制当局への提出に使用されています。ここでは、心臓医療機器の安全性または性能評価にその使用を拡張します。我々は、柔軟な細胞外マトリックス(ECM)ベースのヒドロゲル基材上にめっきされた堅牢に収縮する2D hiPSC-CM単層において、心臓医療機器の収縮特性を評価するための新しい方法を開発しました。このツールは、標準的な実験装置を使用して、心臓電気生理学デバイスの信号が人間の心機能(収縮特性など)に及ぼす影響を定量化することができます。2D hiPSC-CM単層を、48ウェルフォーマットの柔軟なヒドロゲル基板上で2〜4日間培養しました。
hiPSC-CMは、標準的な心収縮性調節(CCM)医療機器の電気信号にばく露され、対照(すなわち、ペーシングのみ)のhiPSC-CMと比較されました。2D hiPSC-CMのベースライン収縮特性は、ピクセル変位に基づくビデオベースの検出分析によって定量化されました。柔軟なヒドロゲル基質上に播種されたCCM刺激2D hiPSC-CMは、ベースラインと比較して(すなわち、CCM刺激前)、ピーク収縮振幅の増加および収縮および弛緩速度論の加速を含む、有意に増強された収縮特性を示した。さらに、柔軟なヒドロゲル基質を利用することで、健康および疾患のhiPSC-CMにおけるビデオベースの心臓励起収縮結合読み出し(すなわち、電気生理学、カルシウム処理、および収縮)の多重化が可能になります。ヒトの心臓収縮に対する心臓電気生理学的信号の影響を正確に検出および定量化することは、心臓医療機器の開発、最適化、およびリスク低減に不可欠です。この方法により、心臓合胞体の収縮特性の堅牢な視覚化と定量が可能になり、非臨床心臓医療機器の安全性または有効性試験に価値があるはずです。本稿では、2D hiPSC-CMヒドロゲル基板単層を生成する方法論について詳細に説明する。

このプロトコルに記載されているのは、柔軟なヒドロゲル基板上に目に見えて収縮する2D hiPSC-CM単層を生成するためのシンプルで堅牢なツールです。収縮特性の測定は、収縮性分析ソフトウェアと組み合わせたビデオベースの記録によって達成される。これにより、収縮振幅、収縮勾配、弛緩勾配、ピークまでの時間、ベースラインまでの時間90%、収縮持続時間50%など、心筋細胞の収縮性の主要なパラメータを定量化できます。このモデルは、さまざまな「健康な」ドナーからのhiPSC-CMのベースライン収縮特性(図4)を特徴付けるために使用され、心臓電気生理学医療機器信号(すなわちCCM)の評価に拡張することができます。標準的なCCM刺激パラメータ(図1D)29,30の適用は、in vitroで収縮特性の増強をもたらした(図5および表1)17。
さらに、この方法を使用して、CCM刺激の有無にかかわらず、細胞外カルシウム濃度の調節がヒトの収縮特性に及ぼす影響を評価できることを実証しました(図6)17。収縮の予想されるベースラインカルシウム依存性は、心筋細胞単層のレベルでのカルシウム感受性のCCM誘発性の増加と同様に観察された7,17。さらに、β-アドレナリン作動性シグナル伝達経路の薬理学的調査(図7)は、CCM誘発変力効果がβ-アドレナリン作動性シグナル伝達によって部分的に媒介されることを明らかにした17。さらに、このツールは、拡張型心筋症(DCM)33,34,35(図8)を含む患者固有の疾患心筋細胞に拡張して、病状の文脈におけるCCMの効果を理解することができます。実際、ここでテストしたCCM「用量」では、収縮振幅の増強と収縮および弛緩の速度論の加速が観察されました(図8)。私たちの研究室にはCCM模倣装置がありますが、ここで使用されている方法論はそのシステムに固有ではなく、他の心臓電気生理学装置にも適用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> 図1:2D hiPSC-CM in vitro CCMモデルの概略図。 (A)hiPSC-CMは、ゼラチン(0.1%)コーティングされた6ウェルプレートに単層フォーマットでプレプレーティングされています。(B)培養2日後、hiPSC-CMを解離し、柔軟なヒドロゲル基板上にプレーティングするための調製を行います。(C)単離されたhiPSC-CMを48ウェルフォーマットで配列したヒドロゲル基質上に高密度で播種し(左)、細胞外カルシウムチロード溶液(0.5 mM)でアッセイします(右)。(D)市販のパルス発生器および標準的な臨床CCMパルスパラメータ29,30(右)を使用して、hiPSC-CMを刺激する。心機能はビデオベースの分析によって評価されます(左)。(E)CCM前(ベースライン:5 V)、CCM中(CCM:10 V)、およびCCM後(回復:5 V)の代表的な収縮記録。この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> 図2:フレキシブルヒドロゲル基板のプレーティングおよびシードの概略図 。 (A)完全に解凍した希釈されていないECMベースのヒドロゲル基質を滅菌48ウェルプレート(左パネル)に塗布し、ウェルあたり1μLのヒドロゲル基質(右パネル)を使用します。(B)ヒドロゲル基質を室温で8〜10分間インキュベートし(右パネル)、続いて高密度hiPSC-CMを低媒体容量(~200μL)でプレーティングします(左パネル)。(C)10〜15分のインキュベーション後、培地を各ウェルに添加し(左パネル)、プレートを標準的な組織培養インキュベーター(右パネル)に移します。略語:ECM =細胞外マトリックス、hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;RT =室温。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> 図3:細胞外マトリックスベースのヒドロゲル基質 。 (a)代表的なヒドロゲル基質(細胞なし)を48穴ガラス底板の1ウェルに基板を塗布した直後。(b)hiPSC-CMが播種された後の時間0。(c)hiPSC-CMを播種してから24時間の時間。このパネルは、Feaster et al.17から転載されました。白い矢印は、ヒドロゲル基質の端部を示し、4倍の倍率を示す。スケールバー= 1 mm。略称:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> 図4:2D hiPSC-CM単層収縮特性の特性評価。 (A)1Hz(5V)でペーシングした2D hiPSC-CMの代表的な収縮記録。(B)1つの収縮サイクルを表す代表的な収縮痕跡。(C)要約棒グラフ。データはSEM±平均値である。 n = 18。略称:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> 図5:2D hiPSC-CM収縮特性に対するCCMの急性効果。 (A)CCM前(5 V)、CCM中(10 V)、およびCCM後(5 V)の代表的な収縮記録。(B)即時効果の代表的な収縮痕跡(すなわち、最後のCCM前拍動、最初のCCM拍動、および最初の後CCM拍動、+で示される)。(C)即時効果の要約棒グラフ。変化率、データはSEM±平均値である。 n = 23。*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ****p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001.この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> 図6:CCM応答に対する細胞外カルシウム調節の影響。 (A)CCM前(5 V)、CCM(10 V)、およびCCM(5 V)後の各グループの即時効果の代表的な収縮痕跡。hiPSC-CMは、0.25〜2 mMの細胞外カルシウム(Cao)濃度の増加にばく露されました。(B-D)収縮特性(すなわち、振幅および動態)のカルシウム感受性に対するCCMの効果を実証する眼を導くための変換データ(シグモイド)(丘の傾き= 1.0)。n = グループあたり6〜8。この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> 図7:薬理学的課題。CCM前(5 V)、CCM(10 V)、およびCCM(5V)後の各グループの代表的な収縮トレース。hiPSC-CMを(A)ビヒクルまたは(B)メトプロロール(2μM)で前処理した。(C,D)各条件のサマリー棒グラフ。変化率、データはSEM±平均値である。 n=1群あたり10。*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001.この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> 図8:罹患した2D hiPSC-CMの収縮特性に対するCCMの急性効果。 (A)DCM L35P、対照ベースライン(6 V以前)、およびDCM L35PとCCM(10 V)の代表的な収縮トレース。(B)要約棒グラフ。変化率、データはSEM±平均値である。 n = 3。*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01.略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心臓収縮性調節;DCM =拡張型心筋症。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオS1:細胞外マトリックスベースのヒドロゲル上のhiPSC-CMのタイムラプス。 柔軟なヒドロゲル基材にめっきされた2次元hiPSC-CM。時間:0-90時間;48ウェルガラス底板の1ウェル;4倍の倍率。hiPSC-CMは水平単層シンシチウム(左から右)を形成します。スケールバー= 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ビデオS2:細胞外マトリックスベースのヒドロゲル上のhiPSC-CM。 柔軟なヒドロゲル基材にめっきされた2次元hiPSC-CM。時間: ~24時間;48ウェルガラス底板の1ウェル;4倍の倍率。hiPSC-CMは単層形態を形成し、めっき後~24時間で強固な収縮を示します。スケールバー= 1 mm。このビデオはFeasterら17からのものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>パラメーター</td>
			<td>ティッカー</td>
			<td>後</td>
		</tr><tr><td>振幅</td>
			<td>16 ± 4%**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>ピークまでの時間 50%</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>ピークまでの時間 90%</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>ベースラインまでの時間 50%</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>ベースラインまでの時間 90%</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>収縮期間10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>収縮持続時間 50%</td>
			<td>-6 ± 5%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>収縮持続時間 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>表1:収縮特性。CCM前(5 V)に対する変化率。データは、CCM(10 V)中およびCCM(5 V)後の各グループのすべての拍についてSEM±平均です。n = 23。*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ****p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001.この表は、Feaster et al.17から転載されています。

本研究では、2次元ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)単層をフレキシブル基板上にめっきし、ビデオベースの顕微鏡と組み合わせて、非侵襲的心臓医療機器の収縮性評価方法を実証する。このツールは、心臓電気生理学デバイスの収縮特性の in vitro 評価に役立ちます。

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

FDAの科学工学研究所は、医療機器開発者とFDAレビュー担当者を支援するための規制科学ツールを開発しています。私たちの究極の目標は、利用可能な最高の科学を通じて、革新的で安全かつ効果的な医療機器への患者のアクセスを加速することです。このプロトコルでは、生命を脅かす心臓病の治療に使用される医療機器の評価に最先端の人工多能性幹細胞技術を適用します。このシンプルなツールは、標準的な実験装置を使用して、皿内の心臓電気生理学デバイスの再現性のある評価を可能にします。また、さまざまな心臓病のドナーに由来する患者固有の細胞にも使用できます。まず、融解したヒトiPS細胞由来心筋細胞を、柔軟なヒドロゲル基材上に心筋細胞を播種する少なくとも2日前に、0.1%ゼラチンコーティングされた滅菌6ウェルプレートにプレートします。ヒトiPS細胞由来心筋細胞を標準的な心筋細胞培地中で摂氏37度、二酸化炭素5%で2〜4日間培養し、凍結保存から回復させます。使用済みの培地を48時間ごとに100%心筋細胞培地でリフレッシュします。解離前のヒトiPS細胞由来心筋細胞の状態を、細胞の健康状態を評価して確認し、生存率と安定した拍動を確保します。塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含まないDPBSのウェルあたり4ミリリットルで心筋細胞を洗浄します。1ミリリットルの室温解離試薬を各ウェルに加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、10ミリリットルの心筋細胞培地を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に加える。1, 000マイクロリットルのピペットで6ウェルプレートから心筋細胞を解離し、細胞懸濁液を円錐管に加える。ウェルを1ミリリットルの新鮮な心筋細胞培地ですすぎ、残留心筋細胞を収集して円錐管に加えます。次に、円錐管の最終容量を培地で15ミリリットルにします。チューブを200 Gで5分間遠心分離し、上清を1ミリリットルマークまで除去します。心筋細胞培地中の細胞を最終容量5ミリリットルまで再懸濁し、手動または自動セルカウンターで心筋細胞をカウントします。次に、心筋細胞懸濁液を室温で約30分間インキュベートし、柔軟なヒドロゲル基質を調製する。1マイクロリットルにセットされた20マイクロリットルのピペット、ピペットチップ、滅菌48ウェルガラス底板、および組織培養フード内のストップウォッチタイマーを用意します。細胞外マトリックスまたはECMベースのヒドロゲル基質をチューブを軽くたたき、すぐに氷上に戻して混合します。最初のヒドロゲル基板をめっきする直前にストップウォッチタイマーを開始し、これを時間ゼロとしてマークします。1マイクロリットルのヒドロゲル基質を約3回上下にピペットし、ピペットチップを冷却する。次に、約1マイクロリットルの未希釈のヒドロゲル基質を48ウェルプレートの各ウェルの底に水平に塗布し、ピペットを45度の角度で保持します。すべてのヒドロゲル基質を各ウェルに同じ向きでプレートして、40倍の倍率で実験を行うときに基質を識別できるようにします。蓋を48ウェルプレートに置き、ヒドロゲル基質を組織培養フード内で室温で8〜10分間インキュベートしてから、細胞を追加します。インキュベーション後、直ちに、約200マイクロリットルの心筋細胞培地の低容量培地中に、ウェル当たり約30,000個の生存可能な心筋細胞を有するヒドロゲル基質上に心筋細胞を直接播種する。蓋を閉めた後、心筋細胞をフード内で室温で10〜15分間邪魔されずにインキュベートし、細胞がヒドロゲル基質に接着できるようにします。100マイクロリットルの新鮮な心筋細胞培地を各ウェルに穏やかに加えます。蓋を閉じたプレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜4日間インキュベーターに置きます。顕微鏡と環境制御チャンバーの電源を入れて、摂氏37度と5%二酸化炭素に平衡化します。心筋細胞培地を48ウェルプレートから取り出し、600マイクロリットルの心収縮性調節またはCCMアッセイ培地で各ウェルを2回静かにすすぎます。次に、ウェルあたり300マイクロリットルのCCMアッセイ培地を追加し、48ウェルプレートを環境制御チャンバー内の顕微鏡上に置きます。電極を挿入し、セルを5分間平衡化します。ビデオベースの顕微鏡を使用して収縮ビデオを録画するには、ビデオ録画ソフトウェアを開き、フレームレートを毎秒100フレームに設定します。次に、hiPSC-CM単層の中心付近の関心領域またはROIを選択します。次に、市販のパルス発生器で細胞を電界刺激し、2D心筋細胞単層を電気的にペースアップします。心筋細胞をベースラインパルスパラメータで1ヘルツの1.5倍の閾値に配置します。例えば、5ボルトの2ミリ秒の刺激パルス持続時間を有する単相矩形波ペーシングパルス。CCMの前にベースラインペーシングのみの収縮ビデオを最低5ビート録画します。次に、30ミリ秒の遅延の実験的電気信号、5.14ミリ秒の位相持続時間の2つの対称的な二相性パルス、20.56ミリ秒の合計持続時間、10ボルトの位相振幅、およびゼロの位相間間隔で心筋細胞単層を刺激します。CCM誘発収縮ビデオを最低5拍記録します。CCM信号をオフにし、ベースラインペーシングパルスで刺激し、CCM後の回復期間の収縮ビデオを最低5拍記録します。標準の収縮ソフトウェアを使用して収縮ビデオを自動的に分析し、収縮振幅、収縮勾配、緩和勾配、ピークまでの時間、ベースラインまでの時間90%、収縮時間50%などの主要な収縮特性を定量化2DヒトiPS細胞由来の心筋細胞単層契約特性を特徴付け、心筋細胞収縮性の主要なパラメーターを定量化しました。標準的なCCM刺激パラメータの適用は、in vitroで強化された収縮特性をもたらした。CCM刺激の有無にかかわらず、細胞外カルシウム濃度調節がヒトの収縮特性に及ぼす影響を評価した。予想されるベースラインの収縮カルシウム依存性、ならびに心筋細胞単層レベルでのカルシウム感受性のCCM誘発性の増加が観察された。さらに、ベータアンドロゲンシグナル伝達経路の薬理学的調査により、CCM誘発変力効果はベータアドレナリン作動性シグナル伝達によって部分的に媒介されることが明らかになりました。さらに、このツールは、拡張型心筋症を含む患者固有の疾患心筋細胞に拡張して、病状の文脈におけるCCMの効果を理解することができます。ここでは、主に人間の収縮特性の評価に焦点を当てています。ただし、このツールを使用すると、活動電位やカルシウム処理など、他の心臓興奮収縮カップリングの読み出しを評価することもできます。これは、人工多能性幹細胞を技術によって心臓デバイスの評価と組み合わせた最初の規制科学ツールです。この代替方法は、医療機器を皿で評価する道を開き、動物およびヒトを対象とした検査の必要性を減らす可能性があります。

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