Name: ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株ZEM2SとZFLを用いた3Dスフェロイド培養法。軌道シェーカー上で5日間培養し、均一な球体を形成する簡便な技術です。魚類毒性試験や環境安全性評価に応用可能です。

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この作品の共著者であり、化粧品の分野で優れた研究者であり、ブラジルでの化粧品研究の促進に専念しているマルシオ・ロレンチーニ博士を記念して。著者らは、生理学部(UFPR)のマルチユーザーラボに、機器の入手可能性と、高等教育要員の改善のための調整(CAPES、ブラジル)(財務コード001)およびGrupo Boticárioの財政的支援に感謝しています。

丸底96ウェルプレートでZFLおよびZEM2S細胞株の3Dスフェロイドを生成するための重要なステップを 図1に示します。
注:このプロトコルで使用されるすべての材料に関連する詳細については、 材料の 表を、このプロトコルで使用される溶液と培地については 表1 を参照してください。
1. 細胞培養培地および単層培養
<ol><li>両方の細胞株(ZFL、ZEM2S)をCO2を含まない28°Cのインキュベーターで単層として増殖させ、~80%のコンフルエントに達したら継代培養比1:3で継代培養します。<ol><li>ゼブラフィッシュ細胞のT75フラスコを~80%のコンフルエントで開始し、上記のように培養する。</li>
		<li>完全な培地を除去し、ピペットを使用して培養フラスコに1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(0.01 M)を加えて細胞を洗浄します。</li>
		<li>ピペットを使用して、1 mLの1xトリプシン-0.5 mM EDTA(0.05% [v/v])を培養フラスコに加え、28°Cで3分間インキュベートしてフラスコから細胞を剥離します。</li>
		<li>フラスコを軽くたたいて細胞を放出し、3 mLの完全培養培地をフラスコに加えてトリプシン消化を停止します。</li>
		<li>ピペットを使用して、細胞懸濁液を15 mLのコニカル遠沈管に移し、100 × g で5分間遠心分離します。</li>
		<li>ペレット形成後、上清を注意深く除去し、使用中の各細胞株(ZFLまたはZEM2S)の完全培地を1 mL加え、マイクロピペットを使用して再懸濁します。細胞カウントのためにアリコートを取ります。</li>
	</ol></li>
</ol>2.トリパンブルー色素排除試験による細胞カウント
<ol><li>10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルー色素をマイクロチューブに加え、細胞をカウントし、生存率を評価します。ピペットを使用して細胞懸濁液と染料を混合します。</li>
	<li>次に、この混合物(細胞懸濁液+トリパンブルー)10 μLをノイバウアーチャンバーに移し、トリパンブルーを取り込まない細胞を生菌と見なして、チャンバーの角に配置された4つの大きな正方形(象限:Q)の細胞をカウントします。式 (1) を使用して生細胞数を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>細胞懸濁液中の最終細胞数を計算するには、式(1)を用いて求めた細胞数に2(トリパンブルーの使用による希釈倍率)を乗じる。 注:あるいは、自動細胞計数システムを使用することもできます。</li>
</ol>3. ULAプレートのセルプレーティング
<ol><li>細胞数を計算した後、以下に示すように、96ウェル丸底ULAプレートのウェルあたり200 μLのこの懸濁液を各細胞株に必要な細胞数でプレートするように細胞懸濁液を調整します。<ol><li>7,000個の生存可能な ZFL 細胞/ウェルをプレート化します。したがって、ULAプレート全体に対して、20 mLの完全な培地で700,000細胞を使用します。</li>
		<li>3,500個の生存可能な ZEM2S 細胞/ウェルをプレート化します。したがって、ULAプレート全体に対して、20 mLの完全培地で350,000細胞を使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>培地リザーバー内の細胞濃度を調整した細胞懸濁液を調製し、泡や泡を形成しないように注意しながら、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して混合します。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、調整した細胞懸濁液をULAプレートの各ウェルに200 μL加えます。 注:プレートは、96ウェルプレートからの培地の蒸発を防ぐために、パラフィルムまたは接着剤シーリングフォイルでシールする必要があります。</li>
</ol>4.回転楕円体形成
<ol><li>ULAプレートをオービタルシェーカーで70rpmで28°Cのインキュベーター内で5日間インキュベートします。スフェロイドを5日間の軌道振盪で形成し(図2)、直径~225 μm(ZFLスフェロイド)および直径~226 μm(ZEM2Sスフェロイド)の平均サイズに達します12。 注:5日間のインキュベーション(最大円形度)後、スフェロイドを使用する準備が整います。</li>
	<li>スフェロイドを培養中に5日以上維持するには、5日ごとに100 μLの使用済み培地を除去し、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して100 μLの新鮮な完全培養培地を追加します。 注意: このプロセス中は、回転楕円体を吸引しないように注意してください。</li>
</ol>5. 回転楕円体のサイズ(直径)と形状(円形度指数)の測定
<ol><li>画像を取得します。<ol><li>イメージングキャプチャシステムを備えた倒立光学顕微鏡の下で、定義されたスケールの画像を取得します。 注意: 顕微鏡ステージキャリブレーションスライドまたはノイバウアースライド(象限サイズがわかっている)を使用して、スケールを取得します。</li>
		<li>顕微鏡下で、スケールの画像を取得するために使用したのと同じ対物レンズを使用して、完全に形成されたスフェロイド(すなわち、5日齢のスフェロイド)の画像を取得します。 注:スフェロイドのサイズと形状を決定するには画像の解像度が重要であり、システムの種類によって異なる可能性があるため、すべての画像は同じイメージングキャプチャシステムを使用して撮影する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>縮尺を設定します。<ol><li>ImageJソフトウェアを使用して、定義したスケールの画像を開きます( [ファイル]、[開く]の順にクリックします)。</li>
		<li>ツールバーから 直線セレクター を選択し、マウスを使用して、画像内の定義された縮尺の延長を横切る線をドラッグします。</li>
		<li>[ 分析 |縮尺を設定し、[ 縮尺の設定] ウィンドウが開くのを待ちます。</li>
		<li>[ スケールの設定] ウィンドウで、[既知の距離]の空白に、直線に対応する 既知の距離 (μm)を入力します。長さの 単位 にμmの um を入力します 。 OK をクリックします。 メモ: ピクセル/μm単位のスケールは、ウィンドウの下部に表示されます。</li>
	</ol></li>
	<li>測定パラメータを設定します。<ol><li>ImageJ ソフトウェアで、[ 分析 |[測定値の設定 ] をクリックして、[ 測定値の設定 ] ウィンドウを開きます。</li>
		<li>[測定値 の設定 ]ウィンドウで、目的の測定値のボックス( つまり、面積 記述子と 形状 記述子)を選択します。 OK をクリックします。</li>
	</ol></li>
	<li>回転楕円体の直径と真円度を取得します。<ol><li>回転楕円体の画像を開く (ファイル |開く)。</li>
		<li>ツールバーで フリーハンド選択ツール を選択し、マウスを使用して回転楕円体の外側を選択します( 図3Aを参照)。 メモ: 画像をズームインまたはズームアウトするには、Ctrl キーを押しながらマウスを使用して上下にスクロールするか、 Ctrl キーを押しながらキーボードの上矢印キーまたは下矢印キーを使用します。</li>
		<li>[ 分析] を選択します。 |[測定] : [結果 ] ウィンドウが開き、測定値が表示されます。</li>
		<li>面積の値を使用して、式 (2) を使用して回転楕円体のサイズ (直径) を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
		<li>円形度指数は、結果ウィンドウに「円形」として与えられ、式 (3) を使用してソフトウェアによって自動的に計算されます。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) 注: 真円度指数 1.0 は完全な回転楕円体形状を表し、0.0 に近い値は細長い形状13 を示します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research.+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+representative+in+vitro+method+for+fish+ecotoxicology%3A+morphological+and+biochemical+characterisation+of+three-dimensional+spheroidal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes.</a> Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).</li>
<li>Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+hepatocyte+spheroids+-+A+powerful+%28though+underexplored%29+alternative+in+vitro+model+to+study+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).</li>
<li>Baron, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+metabolism+in+fish%3A+using+a+3-D+hepatic+in+vitro+model+to+assess+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance.</a> PloS One. 12 (1), 0168837(2017).</li>
<li>Langan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+size+does+not+impact+metabolism+of+the+%CE%B2-blocker+propranolol+in+3D+intestinal+fish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).</li>
<li>Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+three-dimensional+%283D%29+spheroid+cultures+of+the+continuous+rainbow+trout+liver+cell+line+RTL-W1%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+CBZ-induced+catalysis+and+cytochrome+gene+expression+in+three+dimensional+zebrafish+liver+cellculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+and+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture.</a> Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).</li>
<li>Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hollow+sphere+soft+lithography+approach+for+long-term+hanging+drop+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>de Souza, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+cultures+of+zebrafish+liver+and+embryo+cell+lines%3A+a+comparison+of+different+spheroid+formation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods.</a> Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ%2FFiji%22%5BJournal%5D)">ImageJ user guide.</a> ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).</li>
<li>Guidony, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+proteins+activity+and+cytotoxicity+in+zebrafish+hepatocytes+exposed+to+triclosan%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan.</a> Environmental Pollution. 271, 116368(2021).</li>
<li>da Silva, N. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+goethite+in+the+effects+of+glyphosate+and+Roundup%C2%AE+on+ZFL+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line.</a> Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+is+a+key+factor+influencing+the+invasion+and+proliferation+of+Toxoplasma+gondii+in+fish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells.</a> Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).</li>
<li>Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+induced+by+glyphosate+and+glyphosate-based+herbicides+in+the+zebrafish+hepatocyte+cell+line+%28ZF-L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L).</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).</li>
<li>Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+water+soluble+fraction+of+gasoline+on+ZFL+cell+line%3A+Cytotoxicity%2C+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress.</a> Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).</li>
<li>Morozesk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+multiwalled+carbon+nanotubes+co-exposure+with+cadmium+on+zebrafish+cell+line%3A+Metal+uptake+and+accumulation%2C+oxidative+stress%2C+genotoxicity+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).</li>
<li>Dognani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrous+membranes+for+low-concentration+Cr+VI+adsorption%3A+kinetic%2C+thermodynamic+and+the+influence+on+ZFL+cells+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability.</a> Materials Research. , 24(2021).</li>
<li>ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/crl-2147">https://www.atcc.org/products/crl-2147</a> (2022).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Gajski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+potential+of+selected+cytostatic+drugs+in+human+and+zebrafish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research+International%22%5BJournal%5D)">Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells.</a> Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).</li>
<li>Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+octocrylene+on+zebrafish+larvae+and+liver+cell+line+%28ZFL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL).</a> Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+determination+of+oxygen+consumption+rates+and+diffusion+coefficients+in+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids.</a> Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).</li>
<li>Ho, R. K., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+of+cell+fate+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo.</a> Science. 261 (5117), 109-111 (1993).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-19+and+N-cadherin+interact+to+control+cell+movements+during+anterior+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).</li>
<li>Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptome+characterization+of+model+zebrafish+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines.</a> Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

これは、ゼブラフィッシュの肝臓および胚細胞株のスフェロイドを生成するための簡単、簡単、かつ迅速な方法です。この方法は、スフェロイド形成に関連する科学的研究で報告された問題、および3Dスフェロイドアッセイからのデータ精度の不確実性を克服するために、既存の3Dスフェロイド法の修正に基づいてこのグループによって開発されました。例えば、報告された問題は、取り扱いの難しさ、スフェロイドを生成するのに時間がかかる性質、アッセイを実行するために同様のサイズと形状のスフェロイドを選択する必要性、およびハンギングドロップ法でスフェロイドをドロップからマイクロプレートに移すプロセスの困難さにあります3,7,12。さらに、このプロトコルは、CO2フリー条件でのZFLおよびZEM2S細胞株の培養を推奨する。両方の細胞株についてこのプロトコルで提案されている培地組成およびCO2フリー環境は、文献において広く報告されている。ZFL細胞株...

スフェロイドは、細胞を3D培養で細胞間密接な接触で培養するときに形成される細胞の小さな球体です。インビボ組織環境を模倣するスフェロイドの能力は、様々な細胞株および初代細胞において既に研究されている1,2。しかし、スフェロイドは哺乳類毒性試験用に十分に開発されていますが、非哺乳類脊椎動物(魚類など)での毒性試験用のスフェロイドの開発はまだ進行中です3。魚類細胞株の場合、スフェロイドは、異なるタイプのウェルプレート3、4、5、6、7を用いた軌道振動(OS)や、磁性ナノ粒子8を用いた磁気浮上法など、さまざまな方法で開発されてきました。ただし、スフェロイドのこれらの培養方法のいくつかは、他の方法よりも不利な点がある可能性があります。
例えば、大型マイクロプレート(24ウェルプレート)での旋回法では、サイズと形状が異なる多数のスフェロイドが生成される可能性があります。実際、多重スフェロイド構造形成が実証されている7。これには、実験のために同じサイズと形状の回転楕円体を厳選するための多大な努力が必要です。ハンギングドロップ3D培養法は、哺乳類細胞株1,2,9,10,11のスフェロイドを生成するために一般的に使用され、それによって、ドロップあたり単一のスフェロイドを生成することができ、上記の問題を回避することができる。しかしながら、修正されたハンギングドロップ法(ハンギングドロップ+軌道振動)は、安価な方法を用いてZFLスフェロイドを生成することができるが、欠点がある12。形成された細胞凝集体は、滴内で長期間維持することはできません。したがって、それらはウェルプレートに移される必要があります。このプロセスは、マイクロピペット12を用いて滴下して行われるため、層流フード内での激しい取り扱いおよび長時間の作業を必要とする。また、この方法では、ZFLスフェロイドを完全に形成するのに10日(ハンギングドロップで5日+OSで5日)12を要します。これらの欠点は、特に化学物質の優先順位付けと製品の持続可能性のための潜在的なアプリケーションを考慮すると、毒性試験のための3D魚スフェロイドの適用を制限する可能性があります。
したがって、この記事では、96ウェルの超低接着プレート(ULAプレート)とオービタルシェーカー(回転直径22 mm)の併用に基づいて、ZFL(D.レリオ 正常肝細胞)およびZEM2S(D.レリオ 胞胚期胚)細胞株の単一スフェロイドを生成できる3D培養プロトコルについて説明します。適用された方法は簡単で再現性があり、短期間(5日間)で同様のサイズと形状のスフェロイドを大量に生成できます。この方法の利点は、産業界と学界の両方での水生毒性研究への魚の3Dモデルの適用、および生態毒性試験の代替方法の実装の進歩をサポートすることができます。

<table><tbody><tr><td>96 ウェル クリア丸底超低アタッチメントマイクロプレート、個別包装、蓋付き、滅菌</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、粉末、高グルコース、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>ハムの F-12 栄養ミックス、粉末</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Java での画像処理と分析 (ImageJ) 1.52pソフトウェア</td><td>&nbsp;National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>入手可能な場所: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, powder</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>回転直径 22 mm</td></tr><tr><td>ダルベッコ PBS (10x) とカルシウムおよびマグネシウム</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS - ウシ胎児血清、認定、USDA 承認地域</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>重曹、粉末、&nbsp; 分子生物学用バイオ試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン (0.4%)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.5%)、フェノールレッドなし</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S 細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>この細胞株は、Michael J. Carvan 教授 (ウィスコンシン大学、Milwaukee, USA)</td></tr><tr><td>ZFL細胞株</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3d培養法

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

魚細胞株は、生態毒性評価のための 有望なin vitro モデルです。しかしながら、従来の単層培養系(2D培養)には周知の制限(例えば、培養寿命およびいくつかの in vivo 細胞機能の維持)がある。したがって、スフェロイドなどの3D培養物が提案されており、これらのモデルは組織様構造を再現できるため、 in vivo 条件をよりよく再キャプチャできます。この記事では、2つのゼブラフィッシュ(Danio rerio)細胞株であるZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)を使用してスフェロイドを形成するための効果的、簡単、高速の3D培養プロトコルについて説明します。このプロトコルは、丸底の超低アタッチメント96ウェルプレートに細胞をプレーティングすることで構成されています。軌道振盪(70rpm)下で5日後、ウェル当たり単一のスフェロイドが形成される。形成されたスフェロイドは安定したサイズと形状を示し、この方法はウェル内で複数のスフェロイドが形成されるのを回避します。したがって、同様のサイズのスフェロイドを手で選ぶ必要はありません。このスフェロイド法の容易さ、速度、再現性により、ハイスループット のin vitro 試験に役立ちます。

安定したサイズおよび形状を有するウェル当たり単一のスフェロイドがこの方法によって形成される。図2は、軌道振とう(70rpm)下でのULAプレートのウェルにおけるZFLおよびZEM2S細胞の単一スフェロイドの形成過程を示す。ZFL細胞株とZEM2S細胞株は、3D培養において異なる挙動を示します。ZEM2S細胞株は、眼窩振盪の初日からスフェロイド形状を容易に形成する能力を付与する特徴を示しますが(図2E)、ZFL細胞株は望ましいスフェロイド形状に到達するまでに5日かかります(図2A-C)。この方法で生成されたスフェロイドは、図2D(16日齢のZFLスフェロイド)および図2H(10日齢のZF2Sスフェロイド)に示すように、より長い培養期間(期間&gt;5日)でも形状の点で安定性を示...

ここでは、2つのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)細胞株、ZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)のスフェロイドを形成するための効果的で簡単かつ高速な3D培養プロトコルを紹介します。

ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法

Fish cell lines are promising in vitro models for ecotoxicity assessment; however, conventional monolayer culture systems (2D culture) have well-known ...

このプロトコルは、魚の毒性試験におけるさまざまな潜在的なアプリケーションを持つ3Dインビトロモデルであるゼブラフィッシュスフェロイドを簡単に生成できます。これは、サイズと形状が非常に類似したゼブラフィッシュ細胞株の単一スフェロイドを生成するための簡単で高速な方法です。説明されているすべての手順を正しく実行すれば、問題は発生しないはずです。ゼブラフィッシュスフェロイドは、魚に対する化学物質の影響のメカニズム、探索に大きく利益をもたらし、化粧品などの製品の環境安全性評価を改善するのに役立ちます。手順を実演するのは、私の研究室の遺伝学の医師であるイリスドリス・ロドリゲス・デ・ソウザです。まず、ゼブラフィッシュ細胞のT75フラスコを約80%のコンフルエントで取ります。完全培地を除去し、ピペットで培養フラスコに0.01モルPBSを加えて細胞を洗浄する。フラスコを静かに振って培養フラスコをPBSで洗浄し、PBSを取り外します。培養フラスコに3ミリリットルのトリプシン0.5ミリモルEDTAを加え、摂氏28度で3分間インキュベートします。フラスコから細胞を剥離するには、フラスコを軽くたたいて細胞を放出します。次に、3ミリリットルの完全培養培地をフラスコに加えて、トリプシン消化を停止します。ピペットを使用して、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形遠沈管に移し、100Gで5分間遠心分離します。その後、上清を慎重に取り除きます。使用中の各細胞株用の完全培地を1ミリリットル加え、マイクロピペットを用いてペレットを再懸濁する。10マイクロリットルの細胞懸濁液と10マイクロリットルのトリパンブルー色素をマイクロチューブに加えて、細胞をカウントし、生存率を評価します。ピペットを使用して細胞懸濁液と色素を混合し、この混合物10マイクロリットルをノイバウアーチャンバーに移します。チャンバーの隅に配置された4つの大きな正方形または象限の細胞を数え、トリパンブルーを摂取しない細胞を生存可能と見なします。次に、画面に表示されている式を使用して生細胞数を計算します。この細胞数に2を掛けて、細胞懸濁液中の最終的な細胞数を計算します。細胞数を算出した後、各細胞株に必要な細胞数を有する96ウェル丸底ULAプレートのウェル当たりこの懸濁液を200マイクロリットルプレートに調整するように細胞懸濁液を調整した。培地リザーバー内の細胞濃度を調整して懸濁液を調製し、泡または気泡を形成することなくマルチチャンネルマイクロピペットを使用して混合する。200マイクロリットルの調整した細胞懸濁液を丸底ULAプレートの各ウェルに加える。マルチチャンネルピペットを使用する。プレートは、96ウェルプレートからの培地の蒸発を防ぐために、パラフィルムまたは接着剤シーリングフォイルで密封する必要があります。二酸化炭素を含まない摂氏28

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3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

スフェロイドは、2D細胞培養単層モデルと比較して、細胞の環境をより正確に表現するために使用される3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコル例では、科学者が結腸直腸がん細胞株からスフェロイドを作製し、生細胞イメージングを適用してスフェロイドの成長を追跡します。...

細胞株からのスフェロイド作製:三次元(3D)細胞培養法

体節形成には、その空間的なパターン脊椎動物の胚の体軸リズミカルな発達過程である。以前、我々はこのプロセスを駆動する巡回遺伝子を観察する蛍光レポーターを使用したトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を開発しました。ここでは、in vitroでの時間をかけて、これらの線とイメージ、その振動からの培養分散した細胞。...

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

幼虫ゼブラフィッシュにおける脳血管の開発の撮像が記載されている。 3Dイメージングを容易にし、化学的処理を用いて脳血管発達を改変するための技術も提供される。...

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。...

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。...

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

トランスフェクション ライブセル...

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

ここでは、ゼブラフィッシュ後部体軸の3次元組織培養に関するプロトコルを提示し、脊椎動物のセグメンテーションの実生研究を可能にする。この外植モデルは、軸伸長、モルフォゲン源の変化、および細胞内分解能組織レベルのライブイメージングを制御します。...

ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3D尾翼植物培養

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。...

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

オルガノイドは、臓器開発、創薬、疾患研究のための個別化組織モデリングに革命をもたらします。オルガノイド工学は、複雑な合成組織の作成へと進歩しています。その目的は、形態形成、アッサンブロイド技術、およびバイオマトリックスを統合して、組織工学を進歩させることです。このプロトコルは、肝臓の器官形成をモデル化し、合成組織構築のガイドラインを確立するのに役立ちます。...

ヒト細胞株を用いた肝臓器官形成のモデリング、アッサンブロイドの構築、合成組織の設計のためのin vitro培養技術

学ぶゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株ZEM2SとZFLを用いた3Dスフェロイド培養法。軌道シェーカー上で5日間培養し、均一な球体を形成する簡便な技術です。魚類毒性試験や環境安全性評価に応用可能です。

ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法

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