ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法
2023年1月20日
ここでは、2つのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)細胞株、ZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)のスフェロイドを形成するための効果的で簡単かつ高速な3D培養プロトコルを紹介します。
このプロトコルは、魚の毒性試験におけるさまざまな潜在的なアプリケーションを持つ3Dインビトロモデルであるゼブラフィッシュスフェロイドを簡単に生成できます。これは、サイズと形状が非常に類似したゼブラフィッシュ細胞株の単一スフェロイドを生成するための簡単で高速な方法です。説明されているすべての手順を正しく実行すれば、問題は発生しないはずです。
ゼブラフィッシュスフェロイドは、魚に対する化学物質の影響のメカニズム、探索に大きく利益をもたらし、化粧品などの製品の環境安全性評価を改善するのに役立ちます。手順を実演するのは、私の研究室の遺伝学の医師であるイリスドリス・ロドリゲス・デ・ソウザです。まず、ゼブラフィッシュ細胞のT75フラスコを約80%のコンフルエントで取ります。
完全培地を除去し、ピペットで培養フラスコに0.01モルPBSを加えて細胞を洗浄する。フラスコを静かに振って培養フラスコをPBSで洗浄し、PBSを取り外します。培養フラスコに3ミリリットルのトリプシン0.5ミリモルEDTAを加え、摂氏28度で3分間インキュベートします。
フラスコから細胞を剥離するには、フラスコを軽くたたいて細胞を放出します。次に、3ミリリットルの完全培養培地をフラスコに加えて、トリプシン消化を停止します。ピペットを使用して、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形遠沈管に移し、100Gで5分間遠心分離します。
その後、上清を慎重に取り除きます。使用中の各細胞株用の完全培地を1ミリリットル加え、マイクロピペットを用いてペレットを再懸濁する。10マイクロリットルの細胞懸濁液と10マイクロリットルのトリパンブルー色素をマイクロチューブに加えて、細胞をカウントし、生存率を評価します。
ピペットを使用して細胞懸濁液と色素を混合し、この混合物10マイクロリットルをノイバウアーチャンバーに移します。チャンバーの隅に配置された4つの大きな正方形または象限の細胞を数え、トリパンブルーを摂取しない細胞を生存可能と見なします。次に、画面に表示されている式を使用して生細胞数を計算します。
この細胞数に2を掛けて、細胞懸濁液中の最終的な細胞数を計算します。細胞数を算出した後、各細胞株に必要な細胞数を有する96ウェル丸底ULAプレートのウェル当たりこの懸濁液を200マイクロリットルプレートに調整するように細胞懸濁液を調整した。培地リザーバー内の細胞濃度を調整して懸濁液を調製し、泡または気泡を形成することなくマルチチャンネルマイクロピペットを使用して混合する。
200マイクロリットルの調整した細胞懸濁液を丸底ULAプレートの各ウェルに加える。マルチチャンネルピペットを使用する。プレートは、96ウェルプレートからの培地の蒸発を防ぐために、パラフィルムまたは接着剤シーリングフォイルで密封する必要があります。
二酸化炭素を含まない摂氏28度のインキュベーターで5日間、70 RPMのオービタルシェーカーでプレートをインキュベートします。5日後、倒立光学顕微鏡でスフェロイドを観察し、生成されたスフェロイドを評価した。それらの形状とサイズを測定するには、回転楕円体の画像を取得し、ソフトウェアを使用して画像を処理および分析します。
既知のスケールに基づいて選択した領域を測定するようにソフトウェアを設定した後、回転楕円体の外側を選択して、その面積と円形度を決定します。回転楕円体の面積は、直径dを計算することによってそのサイズを決定するために使用され、ソフトウェアは、選択された面積と周長を使用する式によって回転楕円体の真円度を提供します。ZFL細胞凝集体は、軌道振盪の初日に形成される。
細胞凝集体は3日目に円形性を高め、5日目に適切な回転楕円体形状に達する。ULAプレート中の16日齢のZFLスフェロイドがここに示されています。ZEM2S細胞株は、眼窩振盪の初日からスフェロイドを形成します。
回転楕円体は3日目にその形状を維持し、サイズが大きくなり、5日目に最大円形度に達します。ULAプレート中の10日齢のZEM2Sスフェロイドがここに示されています。ZFLおよびZEM2S細胞株のスフェロイドの測定サイズおよびZFLおよびZEM2Sスフェロイドの測定された円形度指数をこの図に示す。
このグラフィック画像は、ZFLおよびZEM2Sスフェロイドの成長パターンを表しています。ここでは、100 RPMで5日間の軌道振動の後に形成されたZFLスフェロイドとZEM2Sスフェロイドを示します。70および100RPMの回転速度で形成されたスフェロイドの成長パターンおよび円形度指数をこの図に示す。
70 RPMは、この方法でZFLおよびZEM2Sスフェロイドを形成するのに最も適切な速度です。レクチンAlexa Fluor 594による細胞膜の染色とDAPIによる核の染色は、スフェロイドのコアにおける細胞の完全性を示しています。AlamarBlueの還元によって形成されたレゾルフィンの蛍光は、両方のスフェロイドのコアに生細胞を示します。
ZEM2SおよびZFL細胞株の3D培養および2D培養におけるMTT生存率アッセイがここに示され、有意差がないことが示されている。この手順を試みるときは、培地のpHが変化したり、ウェル内の蒸発が起こらないように、プレートを密封してください。スフェロイドは、魚の肝臓における毒性作用を評価するためのさまざまなin vitroアッセイや、胚ZEM2S細胞株を用いた発生研究に適用できます。
このプロトコルは、in vitro魚試験の開発を推進するのに役立ち、動物ベースの生態毒性試験の進歩に貢献します。
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概要
本記事では、ZEM2SおよびZFLの2つの細胞株を用いてゼブラフィッシュの3Dスフェロイドを作製するための、簡便かつ効率的なプロトコルを紹介します。本手法は、操作の容易さと迅速な実行を目的として設計されており、魚類毒性試験におけるさまざまなアプリケーションに適しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 毒性学
背景
- ゼブラフィッシュは、胚が透明であることと発生が速いことから、生物学的研究に広く利用されています。
- スフェロイドは、in vivoの条件を密接に模倣した3D in vitroモデルとして機能します。
- 魚類に対する化学物質の影響を理解することは、環境安全性評価において極めて重要です。
- 本プロトコルは、研究目的のスフェロイド形成プロセスを効率化することを目的としています。
研究目的
- ゼブラフィッシュのスフェロイドを迅速かつ効果的に作製する方法を開発すること。
- 化学物質が魚に及ぼす影響に関する研究を促進すること。
- 魚類毒性試験における手法を改善すること。
使用方法
- 細胞培養へのT75フラスコの利用。
- 細胞を約80%のコンフルエンスで維持すること。
- スフェロイド形成のためのステップバイステップのプロトコルの遵守。
- 明確さを確保するための遺伝学専門家による実演。
主な結果
- このプロトコルにより、ゼブラフィッシュ細胞株から均一なスフェロイドを安定して作製できます。
- スフェロイドは一貫したサイズと形状を示し、実験に使用するのに適しています。
- 水圏環境における化学物質の毒性評価への応用の可能性があります。
- 効率化されたプロセスにより、スフェロイド形成時のトラブルが最小限に抑えられます。
結論
- この3D培養プロトコルは、ゼブラフィッシュのスフェロイド作製に有効です。
- 本手法は、魚類を用いた毒性試験方法の向上に寄与することが期待されます。
- 今後の研究において、このモデルを環境安全性評価に活用することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
ゼブラフィッシュの3Dスフェロイド培養は、メカニズムに基づいた生態毒性および化合物の安全性評価のための、スケールアップ可能で再現性の高いin vitroプラットフォームを提供します。本手法は、組織のような細胞組織化と機能的な生存期間を可能にすることで2D培養の限界を解消し、初期スクリーニングにおける予測の信頼性を向上させます。また、ハイスループットへの適合性を備えているため、環境および医薬品の研究開発におけるポートフォリオの選別や、リスクを考慮した開発の推進において貴重な資産となります。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 組織に関連した3Dコンテキストにおいて、化合物の影響をメカニズム的に解析することが可能になります。
- in vivoに類似した細胞機能を再現することで、生物学的なリスク低減をサポートします。
- ターゲットエンゲージメントおよびパスウェイ解析に対する予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ハイスループットな化合物スクリーニングに適した、標準化され再現性のあるスフェロイドを提供します。
- アッセイの読み取り値として、スフェロイドのサイズ、円形度、生存率などの定量的な出力を提供します。
- ウェルあたりに均一な単一スフェロイドを生成することで、手作業による介入を削減します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナル毒性学において、疾患関連および発生生物学モデルと整合します。
- 水圏および環境コンテキストにおける初期探索から前臨床安全性評価までの継続性を可能にします。
- 堅牢で拡張可能なin vitroデータを提供することで、リスクを調整した意思決定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この3Dスフェロイド法は、初期のメカニズム研究とハイスループットスクリーニングを橋渡しし、環境化合物および医薬品化合物の評価における、創薬から前臨床に至る連続的なプロセスに統合されます。
- 探索生物学：生理学的に適切な系における仮説検証およびパスウェイの解明を促進します。
- スクリーニング：化合物評価ワークフローに向けた、アッセイの準備完了状態と再現性を確保します。
- 分析学：比較分析のための、スフェロイドの形態および生存率の定量測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：毒性学において、in vitroでの知見をin vivoのエンドポイントと整合させるためのプラットフォームを提供します。
- 組織的再利用：複数の化合物クラスや研究チームに適用可能な、標準化され拡張性の高いプロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：毒性評価における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：ハイスループットワークフロー向けに、標準化され、再現性があり、スケールアップ可能な3D培養を提供する。
- 戦略的価値：後期段階における生物学的リスクを軽減することで、go/no-go決定の質と資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：生物学的関連性が向上した化合物の、リスク調整後の優先順位付けと開発推進を支援する。
実施上の検討事項
- 細胞培養および3Dスフェロイドの取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 超低接着プレート、オービタルシェーカー、およびイメージング解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- 多施設共同研究における再現性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、異なるゼブラフィッシュ細胞株や、潜在的に他の種にも適応可能です。
- 制限事項として、蒸発およびpH変動を防ぐための慎重なプレート封印が必要です。
