Name: 結晶性シリカダストの反復吸入による珪肺症マウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶマウス珪肺症モデルの作成法。結晶性シリカダストを鼻内投与し、人間の珪肺症を再現する実験動物モデルを確立します。時間とコストを節約し、呼吸器への機械的損傷も与えない効率的な手法です。

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本研究は、安徽省大学シナジーイノベーションプログラム(GXXT-2021-077)および安徽科技大学大学院イノベーション基金(2021CX2120)の支援を受けて行われました。

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(NIH Publication No. 8023、1978年改訂)のガイドラインに従い、安徽科技大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. マウスの管理と給餌
<ol><li>20匹の健康なC57BL/6雄マウスを実験群またはビヒクル群に1:1の比率で割り当てます。マウスを新しい環境に1週間順応させます。</li>
	<li>1日あたり12時間の一定の光時間を提供します。正確なタイミングのために時間制御スイッチを使用してください。</li>
</ol>2. CSD懸濁液の準備
<ol><li>点鼻剤が垂れる少なくとも1日前に、瑪瑙乳鉢でシリカを0.5時間粉砕します。</li>
	<li>結晶粒子の大きさと形を観察します。走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して代表的な写真を撮影します。<ol><li>導電性テープを使用して粒子を結合し、SEM用のサンプルを準備します。 ヘアドライヤーを使用して、しっかりと接着されていないシリコン粒子をそっと吹き飛ばします。</li>
		<li>サンプルチャンバーを排気し、高圧をオンにして、画像をキャプチャします。 注:レンズとサンプル間の作動距離(WD)は5.9mm、加速電圧は2.0kV、倍率(Mag)は100,000倍です。粒子は不規則な結晶化で分散しており、約80%の直径は1〜5μmです(図1A)。</li>
	</ol></li>
	<li>20 mg/mLの滅菌CSD懸濁液を作製します。CSDを滅菌生理食塩水で希釈し、超音波振とう機(40kHz、80W)で室温(RT)で30分間混合します。</li>
	<li>点鼻薬を投与する前に、CSD懸 ?? 液をボルテックスミキサーで10秒間完全に攪拌および混合します。.</li>
</ol>3. マウスへの点鼻薬の投与
<ol><li>麻酔器で2%イソフルランを3.6 mL/hの用量でマウスに迅速に麻酔します(図1B、左パネル)。 注意: 麻酔は、技術者による麻酔薬の吸入を避けるために、ドラフト内で行う必要があります。.マウスの急速で不規則な呼吸からゆっくりとした定常状態への変化を観察して、麻酔の深さが適切であることを確認します。</li>
	<li>4〜8秒以内に50μLのCSDを鼻腔に滴下します(図1B、右)。<ol><li>点鼻薬は、人差し指の先でマウスの頭を研究者の中手指節関節に当てます。</li>
		<li>マウスをうつ伏せにしたまま、4本の指を少し曲げ、親指の先をマウスの下唇に軽く触れて気道をまっすぐにします。咽頭に触れて咽頭反射を誘発しないようにします。</li>
		<li>200 μlのピペットを使用して50 μlの液体を吸引します。マウスの呼吸数に応じて、3〜4回に分けて液体をマウスの鼻腔に滴下します。.各点滴は、15〜20μlの液体で構成する必要があります。.点滴は3日に1回、12日以内に5回投与します。コントロールマウスを等量の生理食塩水で処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスの心臓部分を5x〜10x5秒間優しくマッサージします。<ol><li>手のひらでネズミの体を持ち、親指と人差し指で首の後ろの皮膚をつまみ、他の指でネズミの後肢を固定します。次に、もう一方の手の人差し指でマウスの心臓の鼓動領域を5秒間に5〜10回そっと押します。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスの呼吸が安定したら、温熱パッド付きの回復ケージに入れ、麻酔から回復するまで観察してから、マウスをホームケージに戻します。31日でマウスを犠牲にします。</li>
</ol>4.肺組織を採取し、パラフィン切片を作製する
<ol><li>0.18 mLの10%抱水クロラールを腹腔内に注入し、マウスがつま先または尾の刺激に反応しないようにします(歯付き鉗子を使用して実施)。次に、次の手順に進みます。</li>
	<li>マウスの手足を発泡スチロールテストボードに固定し、75%アルコールをスプレーして毛皮を湿らせます。鎖骨の正中線にある胸部肋骨の大部分を取り除き、マウスの胸腔を開いて心臓と肺を露出させます。</li>
	<li>すぐに眼科手術用ハサミで右心房を切り開き、左心房拍動時に心臓先端から20 mLのリン酸緩衝液(PBS)を最大振幅でゆっくりと注入し、全血を流します。次に、右肺の下葉を切除し、-80°Cで保存してウェスタンブロッティング分析を行います。</li>
	<li>PBS注入後、同じ部位に10 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を灌流し続けます。残りの肺を採取し、病理学的分析のためにサンプルを 30 mL の 4% PFA に保存します。</li>
	<li>72時間固定後、標本をパラフィンに包埋します。<ol><li>脱イオン水(60%、70%、80%、90%、100%)に段階的に希釈した一連のエタノール(EtOH)で組織を室温でそれぞれ1時間脱水し、キシレンを2回ずつ洗浄してサンプルを1時間ずつ除去します。</li>
		<li>溶融したパラフィンワックスを50°Cで2時間加熱してサンプルに浸透させます。このプロセスを別のシリンダーで繰り返します。ワックス型をティッシュで1時間冷やして固めます。</li>
		<li>ワックスが硬化し、組織が包埋されたら、パラフィン切片化機を使用して組織を5μmでスライスします。正確な切片作成およびスライド取り付け手順については、以前に説明した11。 注:十分な組織灌流は、10 mLの4%PFAを受け取った後、筋肉のけいれんと尾のねじれを「S」字型または屈曲に発達させることによって示されます。.</li>
	</ol></li>
</ol>5. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色の実施
<ol><li>パラフィン包埋組織をホットプレート(60°C)で4時間以上加熱し、スライドへの接着と脱パラフィンの改善を可能にします。</li>
	<li>パラフィン切片を脱ワックスして水和させます。スライドにサンプルをキシレンに2回、毎回30分間浸します。次に、それらを無水エタノールに浸し、次に95%、85%、75%アルコール、および脱イオン水にそれぞれ5分間浸します。</li>
	<li>ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行います。ヘマトキシリン染色バケツで組織を10分間染色します。やさしく流水で5分間洗い流します。次に、スライドをエオシン染色バケツに10秒間浸します。</li>
	<li>サンプルを75%、85%、95%、および無水エタノールでそれぞれ5分間脱水します。組織切片をキシレンに5分間浸してきれいにします。約60μLの中性レジン滴で切片を密封します。カバースライドをセクションの上に置き、気泡を避けるために慎重に下げます。</li>
</ol>6. マッソン染色の実施
<ol><li>ステップ5.2で説明したように、パラフィンサンプルを脱ワックスして水和します。次に、細胞核を50%ワイゲルトヘマトキシリンで10分間染色します。組織を酸性エタノール液化に10秒間浸し、流水で組織スライドを静かにすすぎ、核の青化を行います。 注:使用直前にWeigertのヘマトキシリン染色液を調製してください。</li>
	<li>サンプルをLichun red染色液(各組織スライドに40 μL)の滴で7分間染色し、弱酸性作業溶液(30%塩酸)で1分間洗浄して、結合していないLichun赤色色素を除去します。</li>
	<li>それらを95%アルコールに20秒間浸し、無水エタノールでそれぞれ1〜3秒間2回脱水します。その後、手順5.4で説明したように、組織をキシレンで除去し、60 μLの中性樹脂滴で密封します。</li>
</ol>7. シリウスレッド染色を行う
<ol><li>ステップ5.2で説明したように、パラフィンセクションを脱ワックスして水和させます。</li>
	<li>切片にシリウスレッド染色液を1時間浸潤させます。</li>
	<li>サンプルの細胞核をMayerヘマトキシリン染色溶液で8〜10分間染色します。流水で10分間やさしくすすいでください。次に、脱水してティッシュスライドを取り除きます。ステップ5.4で説明したようにそれらを密封します。</li>
</ol>8. 免疫組織化学の実施
<ol><li>ステップ5.2の説明に従ってパラフィンサンプルを脱ワックスし、水和させます。</li>
	<li>約30 mLの3 mg/mLのEDTA抗原賦活化溶液で検体を浸潤させます。20〜30分間沸騰させます。組織を脱イオン水で洗浄し、0.5% Tween-20(PBST)を含むリン酸緩衝液中で5分間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを0.3%過酸化水素溶液に15分間浸し、検体中の内因性ペルオキシダーゼを不活性化します。毎回PBSTで5分間3回洗います。 注意: 0.3%過酸化水素溶液は、遮光環境で新鮮にする必要があります。</li>
	<li>0.3% Triton-100溶液で15分間、試料のメンブレンを透過処理します。次に、30〜40μLの5%ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロックします。</li>
	<li>ブロッキング溶液を取り除きます。希釈した一次抗体NF-κB(希釈率1:200)およびCD68(希釈率1:1,000)を添加し、顕微鏡スライドIHCウェットボックス内で2〜8°Cで一晩インキュベートして、蒸発と光を防ぎます。</li>
	<li>翌日、RTに1時間移します。次に、PBSTで3回、それぞれ5分間洗浄します。</li>
	<li>サンプルをウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(希釈比1:500)中で1時間、室温でインキュベートし、PBSTで3回ずつ5分間洗浄します。 注:一次抗体と二次抗体の両方を5%BSAで希釈しました。</li>
	<li>酵素標識抗体に対応する3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)基質とサンプルを5〜20分間インキュベートします。最適な染色強度に達したら、脱イオン水との反応を停止します。 注意: DAB溶液は新たに調製し、光から保護する必要があります。発色反応を顕微鏡でリアルタイムに観察し、染色を止めるタイミングを決定する必要があります。陽性の標本は強い染色を示しますが、陰性の標本は発色しません。</li>
	<li>サンプルをワイゲルトヘマトキシリンで30秒間対比染色します。次に、流水で組織を1分間すすぎます。次に、ステップ5.4で述べたように、組織スライドを脱水し、透明化し、密封します。</li>
</ol>9. ウェスタンブロッティング分析の実施
<ol><li>肺組織を溶解してタンパク質を抽出します。200 μL の RIPA ワーキング溶液を 20 mg の肺組織に加えます。</li>
	<li>ハンドヘルド電動グラインダーを使用して氷上で組織を5分間均質化し、穏やかに振とうしながら氷上で1時間インキュベートします。その後、ホモジネートを 4 °C で 15 分間、14,800 x g で遠心分離します。</li>
	<li>上清を採取し、BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を測定します。RIPAで6 μg/μLのタンパク質保存溶液を作製します。80 μLのプロテインライセートに20 μLの5xローディングバッファーを加えます。タンパク質含有微量遠心チューブを金属浴(100°C)で20分間加熱することにより、二次タンパク質構造を破壊します。</li>
	<li>冷却後、タンパク質保存溶液100 μLを各チューブに分注し、サンプルを-80°Cの冷蔵庫で保存します。電気泳動の前に、タンパク質濃度を1倍ローディングバッファーで2–3 μg/μLに希釈します。 注:タンパク質抽出プロセスは氷上で実行する必要があります。RIPAワーキング溶液の場合、100 mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)1 μLを99 μLのRIPAに添加して、リン酸化タンパク質の分解を阻害します。 5倍のローディングバッファーをRIPAで1:4の比率で希釈して、1xローディングバッファーを調製します。</li>
	<li>各ウェルに 20 μg のサンプルを添加し、ゲルを泳動します。5%濃縮ゲルの場合、80 Vで20分間使用して、同じ開始点からタンパク質を電気泳動します。10%単離ゲルの場合、100 Vで1時間泳動して、分子量の異なるタンパク質を可能な限り分離します。</li>
	<li>PVDFメンブレンをメタノールで20秒間予備活性化します。400mAの電流で1〜2時間湿式転写法を使用して、タンパク質をPVDFメンブレンに転写します。 注:電気泳動タンクと電解転写タンクが水平であることを確認してください。メンブレン転写プロセスは多くの熱を発生するため、タンク全体を氷で冷却します。</li>
	<li>メンブレンをTBST溶液で毎回5分間、5回洗浄します。次に、5%BSAまたは5%スキムミルクで1時間ブロックします。一次抗体NF-κB(1:1,000)およびβ-アクチン(1:1,000)を5%BSAで希釈します。ストリップを抗体溶液に浸し、2〜8°Cで一晩静かに振とうします。</li>
	<li>ストリップをPBSTで洗浄します。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:10,000)を希釈し、希釈した二次抗体中で室温で1時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。</li>
	<li>増強化学発光(ECL)現像液を調製し、ストリップ上に滴下し、3分間インキュベートします。</li>
	<li>ストリップをゲルイメージャーに20秒間さらします。ストリップのグレー値を測定して、システムソフトウェアでタンパク質レベルを評価します。β-アクチンを内部統制として使用する。</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反がないことを宣言します。

珪肺症マウスモデルは、珪肺症の病因と治療を研究するために重要です。このプロトコルは繰り返された鼻の露出によってマウスの珪肺症のモデルを準備するための方法を記述する。この方法は、異なる曝露時間によって誘発される珪肺症の病理学的特徴の研究を可能にする。マウスに人工呼吸器を装着し、呼吸数をモニターした。最初の短くて速い呼吸数は、時間の経過とともに徐々に遅くなったり深くなったりしました。麻酔によりマウスの筋肉が弛緩し、深呼吸が始まり、ゆっくりと深呼吸する時間帯にCSDを吸入できるようになりました。このプロセスの間、オペレーターはマウスの下顎骨を親指で持ち、首をまっすぐにして液体が消化管に入るのを防ぎます。この方法は、粉塵曝露を研究するために繰り返し実施する個々のニーズを満たすことができます。2017年にKatoらは、口腔咽頭点滴 による 単回高用量(125 mg/mL、40 μL)を使用して肺線維症をモデル化し、この濃度を参照して、鼻腔を通る複数の少量投与によって誘発される肺の変化を調べようとしています14。
麻酔後の点鼻薬...

労働者は必然的に不規則な結晶性シリカ粉塵(CSD)にさらされ、吸入する可能性があり、鉱業、陶器、ガラス、石英加工、コンクリート1,2など、多くの職業状況でより有毒です。珪肺症として知られる慢性的な粉塵吸入状態は、進行性の肺線維症を引き起こします3。疫学データによると、珪肺症の発生率は過去数十年にわたって世界的に減少していますが、近年、増加しており、若年層に影響を与えています4,5,6。珪肺症の根本的なメカニズムは、その潜行性の発症と長期の潜伏期間のために、科学研究にとって重要な課題を提示します。珪肺症がどのように発症するかはまだ不明です。さらに、現在の薬では、珪肺症の進行を止めたり、肺線維症を逆転させたりすることはできません。
現在の珪肺症のマウスモデルでは、CSDの混合懸濁液を気管から摂取します。例えば、麻酔後に頸部気管外傷を採用してCSDを肺に投与することは、染料粉塵へのヒトの反復暴露には従わない7。周囲の粉塵への曝露が個人に与える影響は、この有毒物質の環境濃度をより正確に反映するエアロゾルの形でCSDに曝露することによって研究できます8。しかし、環境CSDは、マウスの鼻の特異な生理学的構造のために、単純に直接肺に吸入することはできない9。さらに、この技術に関連する機器は高価であるため、研究者はマウスの珪肺症モデル10を再評価しています。2週間以内に5回点鼻薬でCSD懸濁液を吸入することで、珪肺症の動的モデルを構築することができました。このモデルは、使いやすく、一貫性があり、安全です。この研究により、マウスでCSDの反復吸入が可能であることに注意することが重要です。この手順で作成されたマウス珪肺症モデルは、研究要件に対してより有益であることが期待されます。

<table><tbody><tr><td>0.5 mLチューブ</td><td>バイオシャープ</td><td>BS-05-M</td><td></td></tr><tr><td>10% ホルマリン中性固定剤</td><td>Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe&nbsp;</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>アルコール消毒剤</td><td>Xintai Kanyuan消毒製品有限公司</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>CD68</td><td>Abcam</td><td>ab125212</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸抗原賦活化溶液</td><td>biosharp ライフサイエンス</td><td>BL619A</td><td></td></tr><tr><td>DAB 発色キット</td><td>NJJCBio</td><td>W026-1-1</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルベンゼン</td><td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Enhanced BCA protein assay kit</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0009</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリンとエオシン(H&E)</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>HRP基質</td><td>Millipore Corporation</td><td>P90720</td><td></td></tr><tr><td>HRP共役 アフィニピュアヤギ 抗ウサギIgG(H+L)</td><td>プロテインテック</td><td>Sa00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Iceacetic</td> acid <td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td><td>NA ImageJ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Lifeサイエンス</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>マッソンのトリクローム染色キット</td><td>ソーラーバイオ</td><td>G1340</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>マックリン</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>ミリポア</td><td>AXYMCT150CS</td><td></td></tr><tr><td>NF-&kappa;B p65</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>8242S</td><td></td></tr><tr><td>振動サーモスタット金属浴</td><td>アブソン</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン埋め込み機</td><td>精密(常州)医療機器株式会社</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンスライ</td><td>サーJinhuaクラタイインスツルメンツ株式会社</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液(PBS)&nbsp;</td><td>バイオシャープ</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水&nbsp;</td><td>淮南市</td><td></td><td></td>の最初の人民病院</tr>NA<tr><td>ピペット</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Beyotime Biotechnological</td><td>ST505</td><td></td></tr>偏<tr><td>光顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>精密バランス</td><td>Acculab</td><td>ALC-110.4</td><td></td></tr><tr><td>Prism7.0</td><td>GraphPad&nbsp;</td><td>バージョン7.0</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>ミリポア</td><td>3010040001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA溶解バッファー</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>RODI IOTインテリジェント多機能浄水システム</td><td>RSJ</td><td>RODI-220BN</td><td></td></tr><tr><td>Scilogex SK-D1807-E 3Dシェーカー</td><td>Scilogex</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGEゲル調製キット</td><td>Beyotime</td><td>バイオテクノロジーP0012A</td><td></td></tr><tr><td>二酸化ケイ素</td><td>シグマ</td> <td>#BCBV6865</td><td></td></tr><tr><td>シリウス赤色染色南</td><td>京SenBeiJiaバイオテクノロジー株式会社</td><td></td><td></td>181012</tr><tr><td>小動物麻酔器</td><td>安徽Yaokun Biotech Co.、Ltd.</td><td>ZL-04A</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルピペットチップ(0.1&ndash;10 &micro;L)</td><td>KIRGEN</td><td>KG1011</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルピペットチップ(100&ndash;1000 &マイクロ;L)</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルピペットチップ(1&ndash;200 &micro;L)</td><td>キルゲン</td><td>KG1212</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス&nbsp;ミキサー&nbsp;</td><td>VWR</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS GeminiSEM 500</td><td>ツァイスドイツ</td><td>SEM 500</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actin</td><td>Bioss</td><td>bs-0061R</td><td></td></tr></tbody></table>

結晶性シリカダストの反復吸入による珪肺症マウスモデル

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

珪肺症は、産業環境で呼吸器系結晶性シリカ粉塵(CSD)にさらされることによって引き起こされる可能性があります。ヒトにおける珪肺症の病態生理学、スクリーニング、および治療はすべて、マウス珪肺症モデルを使用して広く研究されています。マウスにCSDを肺に繰り返し吸入させることで、マウスはヒトの珪肺症の臨床症状を模倣することができます。この方法論は、時間と出力の点で実用的かつ効率的であり、手術による上気道への機械的損傷を引き起こしません。さらに、このモデルは、珪肺症の急性/慢性形質転換プロセスをうまく模倣できます。主な手続きは、以下の通りです。滅菌した1〜5μmのCSD粉末を完全に粉砕し、生理食塩水に懸濁し、超音波水浴中に30分間分散させた。イソフルラン誘発麻酔下のマウスは、約2秒間、浅い速呼吸から深くゆっくりとした吸引に切り替わりました。マウスを手のひらに置き、親指の先をマウスの顎の唇の端にそっと触れて気道をまっすぐにしました。各呼気の後、マウスは1つの鼻孔からシリカ懸濁液を一滴ずつ吸い込み、4〜8秒以内にプロセスを完了しました。マウスの呼吸が安定した後、吸入したCSDが咳をしないように、胸を撫でたり愛撫したりしました。その後、マウスをケージに戻した。結論として、このモデルは、上気道から末端細気管支および肺胞まで、肺への微小粒子の典型的な生理学的通過に沿ってCSDを定量化することができます。また、仕事による従業員の繰り返しの曝露を再現することもできます。モデルは1人で行うことができ、高価な機器は必要ありません。ヒト珪肺症の疾患の特徴を高い再現性で便利かつ効果的にシミュレートします。

マウスにおける珪肺症の潜在的な病因は、提案された方法を使用して調査されました。その結果、実験群のマウスの体重は対照群に比べて有意に減少し、曝露中止後の体重の回復が遅いことが分かりました。ここで使用した用量が最適化されているため、この実験ではシリカに曝露したマウスでは死亡率は観察されませんでした。CSDへの反復点鼻漏の技術的ロードマップを(図1)に示します。前述の手順には、CSD懸濁液の準備、イソフルラン誘発麻酔、点鼻薬、および胸部マッサージが含まれていました12。コラーゲン沈着と筋線維芽細胞の分化を4週間の静的摂食後に実証した12。私たちは、この粉塵曝露法を用いて、石炭粉塵によって引き起こされる肺線維症の根本的なメカニズムを研究しています。マクロファージの新しいサブセットとビタミンDの介入効果は、シングルセルトランスクリプトーム技術によって発見されました13。本研究では、気管支末梢弾性線維の損傷を引き起こすCSDへの曝露により、マウスの...

このプロトコルは鼻の点滴によって無水ケイ酸懸濁液への反復的な露出によって珪肺症のマウス モデルを確立する方法を記述する。このモデルは、ヒト珪肺症の病理学的プロセスを効率的、便利、かつ柔軟に模倣し、高い再現性と経済性を備えています。

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

記載されたマウス珪肺症モデルでは、結晶シリカダストのレーザー内注入によって生成された、すべてのCSD懸濁液がヒト珪肺症の発生と発症を数回シミュレートしました。この方法は、時間の節約とレベルの節約であるだけでなく、実用的で効果的です。また、手術による上気道への機械的損傷を生じさせない。この方法は、ウイルスや細菌などの疾患モデルの作成にも使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生で、珪肺症マウスモデルの準備に熟練しているHangbing Caoです。点鼻薬を投与する少なくとも1日前に、結晶性シリカダストまたはCSDを準備することから始めます。これを行うには、瑪瑙乳鉢でシリカを30分間挽きます。粒子の大きさや形状を確認するには、走査型電子顕微鏡やSEM用に導電性テープでシリコン粒子を結合させ、試料を作製します。ヘアドライヤーを使用して、しっかりと結合していない粒子をそっと吹き飛ばしてから、画像のキャプチャに進みます。次に、超音波シェーカーを使用して、粉砕シリカと滅菌生理食塩水を1ミリリットルあたり20ミリグラムの濃度で混合します。最後に、準備したCSD懸濁液を10秒間ボルテックスします。麻酔をかけたマウスに50マイクロリットルのCSDを点鼻薬で4〜8秒間投与します。対照マウスを等量の生理食塩水で処理し、マウスの体を手のひらで持ち、親指と人差し指で首の後ろの皮膚をつまみ、他の指でマウスの後肢を固定します。もう片方の人差し指でマウスの心臓の鼓動部分を5〜10回、5秒間静かに押します。パラフィン包埋肺組織をホットプレート上で摂氏60度で4時間以上加熱します。パラフィン切片を脱ワックスして水和させるには、スライドをキシレンに30分間2回浸し、次にスライドを無水95%85%および75%エタノールにそれぞれ5分間順次浸し、最後に脱イオン水に浸し、スライドをヘマトキシリン染色バケツに10分間入れてから、流水で5分間穏やかにすすぎます。エオシン染色バケツに10秒間浸します。サンプルを75%85%95%と無水エタノールでそれぞれ5分間脱水した後、キシレンに5分間浸漬して組織切片を除去し、約60マイクロリットルの中性樹脂滴で密封します。カバースライドをセクションの上に慎重に置きます。Masson染色では、脱ワックスおよび水和パラフィンサンプルを新たに調製した50%Weigertヘマトキシリンで10分間染色し、次に組織を酸性エタノール液化に10秒間浸した後、流水でスライドを穏やかにすすぎ、核の青化を行います。次に、試料を赤色染色液の滴で7分間染色し、30%塩酸作動液で1分間洗浄します。スライドを95%アルコールに20秒間浸した後、無水エタノールでサンプルを1〜3秒間2回脱水し、前に示したように、サンプルを透明化して密封します。シリウスレッド染色では、シリウスレッド染色液で脱ワックスおよび水和切片に1時間浸潤し、次にメイヤーヘマトキリン染色液で細胞核を8〜10分間染色します。流水で10分間静かにすすぎ、脱水し、取り除き、スライドを密封します。脱ワックスおよび水和パラフィンサンプルに、30ミリリットル/ミリリットルの3ミリグラムのEDTA抗原賦活化溶液を浸潤します。サンプルを20〜30分間煮沸してから、脱イオン水で洗浄し、PBSTで5分間インキュベートします。調製したばかりの0.3%過酸化水素水溶液にサンプルを15分間浸し、PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。0.3%Triton 100溶液で検体の膜を15分間透過処理し、30〜40マイクロリットルの5%ウシ血清アルブミンまたはBSAで1時間ブロックします。ブロッキング溶液を除去した後、適切に希釈した一次抗体NF-κBおよびCD-68を添加し、顕微鏡スライドIHCウェットボックス内で2〜8°Cで検体を一晩インキュベートします。翌日、試料を室温に1時間移した後、PBSTで5分間ずつ3回洗浄する。サンプルをウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体中で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをPBSTでそれぞれ5分間、3回再度洗浄し、次に、酵素標識抗体に対応するDAB基質とサンプルを5〜20分間インキュベートします。脱イオン水で反応を急冷した後、ワイゲルトヘマトキシリンでサンプルを30秒間対比染色します。流水で1分間すすぎ、脱水し、透明にし、組織を密封します。ウェスタンブロット分析に進む前に、ハンドヘルド電動グラインダーを使用して、氷上で5分間、RIPA作業溶液で組織をホモジナイズします。振とうしながら氷上で1時間インキュベートし、ホモジネートを14, 800Gで摂氏4度で15分間遠心分離する。上清を採取し、BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を測定します。上清に20マイクロリットルの5倍ローディングバッファーを加え、RIPAで調製した6マイクログラム/マイクロリットルのタンパク質保存溶液を100°Cの金属浴中で20分間加熱します。タンパク質溶液100マイクロリットルのアリコートを各チューブに摂氏マイナス80度で保管します。電気泳動の場合は、アリコートをRIPAライセートで1マイクロリットルあたり2〜3マイクログラムに希釈し、ウェルあたり20マイクログラムのサンプルを添加してゲルを泳動させます。400ミリアンペアの電流で1〜2時間、湿式転写法を使用して、メタノールで20秒間事前に活性化されたPVDFメンブレンにタンパク質を移します。メンブレンをPBST溶液でそれぞれ5分間5回洗浄した後、5%BSAまたはスキムミルクで1時間ブロックします。5%BSAで希釈したNF-κBとβアクチンを含む一次抗体溶液にストリップを浸します。ストリップを摂氏2〜8度で一晩静かに振ってから、PBSTで洗浄します。次に、ストリップを、希釈した二次抗体中で室温で1時間穏やかに振とうし、次に増強化学発光現像液で3分間インキュベートします。ストリップをゲルイメージャーに20秒間曝露し、ストリップのグレー値を測定して、システムソフトウェアでタンパク質レベルを評価します。CSDのSEM画像は、粒子が不規則な形状であることを示しました。コラーゲン沈着を測定するために実施したシリウスレッド染色は、マウスの肺線維症の進行が1ヶ月間のCSD曝露で有意に加速されることを示しました。偏光顕微鏡検査により、3種類のコラーゲン線維が明らかになり、そのうち赤色で示した1型コラーゲン線維は珪肺症の危険因子であるが、ビヒクル群では有意な線維化は認められなかった。これは、それぞれの線維症スコアによっても示されました。CSD処理したマウス肺組織のHE染色では、中心部のCSDが貪食された後、液化壊死を特徴とする典型的なシリカ結節が示され、周囲はマクロファージに囲まれていました。Masson染色は、結節が線維化を伴うCSDで強化されていることも示しました。CD-68の免疫組織化学染色により、肺組織にマクロファージが広く存在することがさらに明らかになりました。偏光顕微鏡検査では、これらのマクロファージがCSDを摂取し、重度の肺損傷を引き起こしていることが示されました。免疫組織染色では、より高いNF-κB染色が示され、CSD治療群ではビヒクル群よりも炎症反応が高いことが示されました。代表的なウェスタンブロットでは、CSD処理マウスは肺でのNF-κBの発現が高く、2つのグループ間の発現の差が有意であることも示されました。呼吸閉塞を回避し、呼吸の回復を促進するために、マウスの心臓領域は、5秒間後に示されているように、5〜10回穏やかにマッサージする必要があります。このモデルは、珪肺症の根本的なメカニズムを探り、治療薬のスクリーニングを支援するとともに、投与量や期間などの重要なパラメータを確立することができます。この技術は、マウスモデルを粒子状物質に曝露するための便利で効果的で経済的な手段を提供します。マウスの行動を監視することは、粒子状物質を吸い込んだ場合の潜在的な影響を判断するのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

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結晶性シリカダストの反復吸入による珪肺症マウスモデル

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