Name: ヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴づけるための空気-液体界面で増殖した初代鼻上皮細胞の感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ ヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を、空気-液体界面で増殖した初代鼻上皮細胞を用いて解析する方法。複製動態、細胞傷害性、自然免疫応答を評価し、呼吸器ウイルス感染の治療戦略開発に貢献する。

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この研究には、次の資金源があります:国立衛生研究所(NIH)R01AI 169537(SRWおよびN.A.C.)、NIH R01AI 140442(S.R.W.)、VA Merit Review CX001717(N.A.C.)、VA Merit Review BX005432(S.R.W.およびN.A.C.)、Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.)、Laffey-McHugh Foundation(S.R.W.およびN.A.C.)、 T32 AI055400 (CJO)、T32 AI007324 (AF)。

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<li>Hariri, B. M., Cohen, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+upper+airway+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Rhinology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">New insights into upper airway innate immunity.</a> American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).</li>
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<li>Hatton, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+induction+of+type+I+and+III+interferons+mediates+nasal+epithelial+cell+permissiveness+to+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2.</a> Nature Communications. 12 (1), 7092(2021).</li>
<li>Sungnak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+factors+are+highly+expressed+in+nasal+epithelial+cells+together+with+innate+immune+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes.</a> Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+induces+double-stranded+RNA-mediated+innate+immune+responses+in+respiratory+epithelial-derived+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118(2021).</li>
<li>Comar, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MERS-CoV+endoribonuclease+and+accessory+proteins+jointly+evade+host+innate+immunity+during+infection+of+lung+and+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119(2022).</li>
<li>Lee, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+D-amino+acids+suppress+sinonasal+innate+immunity+through+sweet+taste+receptors+in+solitary+chemosensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells.</a> Science Signaling. 10 (495), (2017).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385(2018).</li>
<li>Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+obtained+from+patients+with+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD.</a> PLoS One. 7 (3), e32924(2012).</li>
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<li>Robinot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+induces+the+dedifferentiation+of+multiciliated+cells+and+impairs+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance.</a> Nature Communications. 12 (1), 4354(2021).</li>
<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).</li>
<li>Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+disrupts+the+airway+epithelial+barrier+by+decreasing+cortactin+and+destabilizing+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin.</a> Journal of Cell Science. 135 (16), 259871(2022).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-13+impairs+tight+junctions+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222(2019).</li>
<li>Huang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+alters+tight+junction+proteins+expression+thereby+compromising+barrier+function+and+dampens+rhinovirus+induced+immune+responses+in+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749(2020).</li>
<li>Saatian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-4+and+interleukin-13+cause+barrier+dysfunction+in+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e24333(2013).</li>
<li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753(2020).</li>
<li>Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air%E2%88%92liquid+interface+cultures+of+the+healthy+and+diseased+human+respiratory+tract%3A+Promises%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+NanoBiomed+Research%22%5BJournal%5D)">Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions.</a> Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111(2021).</li>
<li>Seibold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-13+stimulation+reveals+the+cellular+and+functional+plasticity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium.</a> Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).</li>
<li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+of+airway+cells+causes+intense+viral+and+cell+shedding%2C+two+spreading+mechanisms+affected+by+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119(2022).</li>
</ol>

Susan Weissは、Ocugenの科学諮問委員会のメンバーです。ノーム・A・コーエンは、GSK、アストラゼネカ、ノバルティス、サノフィ/レジェロン、オイスター・ポイント・ファーマシューティカルズのコンサルティングを担当し、米国特許「Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection」(10,881,698 B2, WO20913112865)を取得し、GeneOne Life Sciencesとライセンス契約を結んでいます。

ここで詳述する方法は、患者由来の鼻上皮細胞を空気と液体の界面で増殖させ、HCoVと宿主の相互作用の研究に適用する一次上皮培養システムについて説明しています。分化されると、これらの鼻腔ALI培養物は、繊毛細胞、杯細胞、基底細胞が表される不均一な細胞集団や、繊毛と粘液分泌を頑強に鼓動する無傷の粘膜繊毛機能など、 in vivo 鼻上皮の多くの特徴を再現します。この不均一な細胞集団は、ウイルス感染時の宿主細胞の向性特性評価を可能にするため、従来の呼吸器上皮細胞株に対するこの培養システムの重要な利点です( 図2を参照)。また、従来の気道上皮細胞株は、インターフェロン産生などの自然免疫経路とともに呼吸器系ウイルスに対する一次防御に重要な役割を果たす機能的な粘膜繊毛クリアランス機構を欠いています。
プロトコル内の重要なステップには、最初の感染手順が含まれます。例えば、培養物は感染前に所望の温度で平衡化する必要があり、各感染を開始するために一貫した方法論を使用する必要があります。これらのステップは、分析法を標準化し、ダ...

これまでに7種類のヒトコロナウイルス(HCoV)が確認されており、さまざまな呼吸器疾患を引き起こします2。一般的または季節性のHCoV(HCoV-NL63、-229E、-OC43、および-HKU1)は、通常、上気道の病理学に関連しており、毎年一般的な風邪症例の推定10%〜30%を引き起こします。これは一般的なHCoVに関連する典型的な臨床表現型ですが、これらのウイルスは、子供、高齢者、免疫不全の個人など、リスクのある集団でより重大な下気道疾患を引き起こす可能性があります3,4。過去20年間に、重症急性呼吸器症候群(SARS)-CoV、中東呼吸器症候群(MERS)-CoV、SARS-CoV-2の3つの病原性HCoVが出現し、重大な公衆衛生上の緊急事態を引き起こしています。致死的なHCoVは、より重篤な気道病変と関連しており、MERS-CoV症例に関連する致死率>34%(2012年の出現以来、2,500例以上で894例)5,6。致死的なHCoVは、現在進行中のCOVID-19パンデミックに見られるように、無症候性感染症から致死性肺炎まで、さまざまな気道疾患も引き起こすことに注意することが重要です7。
HCoVは、他の呼吸器病原体と同様に、気道に入り、鼻上皮に生産的な感染を確立します8。下気道への広がりは、口腔/鼻腔から肺への誤嚥に関連していると考えられており、HCoVはより重大な下気道病状を引き起こします9,10,11。したがって、鼻はウイルス侵入の最初のポータルとして機能し、その強力な粘膜繊毛クリアランス機構と、下気道へのウイルスのさらなる拡散を防ぐことを目的とした独自の自然免疫メカニズムにより、感染に対する主要な障壁となります12,13。例えば、鼻の上皮細胞は、抗ウイルスインターフェロンおよびインターフェロン刺激遺伝子の基底レベルが平均よりも高いことが報告されており、鼻細胞が呼吸器系ウイルスに対する早期応答の準備ができている可能性があることを示しています14,15,16。
私たちはこれまで、患者由来の初代鼻上皮細胞を気液界面(ALI)で増殖させ、HCoV感染が始まる鼻のHCoVと宿主の相互作用をモデル化しました。経鼻ALI培養は、病原性(SARS-CoV-2およびMERS-CoV)と一般的なHCoV(HCoV-NL63およびHCoV-229E)の両方に寛容であり、A549(肺腺癌細胞株)などの従来の気道上皮細胞株に比べてさまざまな利点があります16,17。分化後、鼻腔ALI培養物は不均一な細胞集団を含み、粘膜繊毛クリアランス機構など、in vivo鼻上皮に期待される機能の多くを示す18。鼻細胞は、細胞学的ブラッシングによる鼻上皮細胞の獲得は、HBECを達成するための気管支鏡検査などの技術の使用と比較して侵襲性が大幅に低いため、下気道培養システム(ヒト気管支上皮細胞、HBEC)よりも利点もあります19,20,21。
この論文では、この鼻腔ALI培養システムを利用して、鼻上皮におけるHCoVと宿主の相互作用を特徴付ける方法について説明します。これらの手法を最近発表された研究に適用し、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63、およびHCoV-229E 1,16,17を比較しました。これらの方法と代表的な結果は、この鼻細胞モデルにおけるHCoVの研究を強調していますが、このシステムは他のHCoVや他の呼吸器病原体にも高い適応性を持っています。さらに、これらの方法は、ウイルス複製と細胞向性、ならびに感染後の細胞毒性と自然免疫誘導を調査するために、他のALI培養系により広く適用することができます。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 二次抗体 (488, 594, 647)</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>BSA (ウシ血清アルブミン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cytotoxicity detection kit</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + カルシウム + マグネシウム</td><td>Gibco</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Endohm-6G 測定チャンバー</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-6G</td><td></td></tr><tr><td>上皮細胞接着マーカー (EpCAM;CD326)</td><td>eBiosciences</td><td>14-9326-82</td><td></td></tr><tr><td>上皮電圧/オーム (TEER) メーター (EVOM)</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW software for imaging</td><td>Olympus</td><td>Version 4.02</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-470</td><td></td></tr><tr><td>HCoV-NL63 nucleocapsid antibody</td><td>Sino Biological</td><td>40641-V07E</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli sample buffer (4x)</td><td>BIO-RAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>LLC-MK2 cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-7</td><td>To titrate HCoV-NL63</td></tr><tr><td>MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012)</td><td>BEI Resources&nbsp;</td><td>NR-44260</td><td></td></tr><tr><td>MERS-CoV ヌクレオカプシド抗体</td><td>Sino Biological</td><td>40068-MM10</td><td></td></tr><tr><td>MUC5AC 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAB91539</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 共焦点顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 647 stain</td><td>Abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH34000000</td><td>任意のプレートリーダーまたは ELISA リーダーで十分です。492 nm</td></tr><tr><td>の RIPA バッファー (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% デオキシコール酸; 0.1% SDS; 1% NP40)</td> で吸光度を読み取ることができる必要があります。サー<td>モフィッシャー</td><td>89990</td> 社内<td>で調製するか</td></tr>、<tr><td>RNeasy Plus キット</td>を購入できる <td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-52281</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2ヌクレオカプシド抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX135357</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Type IV &β;- tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11315</td><td></td></tr><tr><td>VeroCCL81</td><td>細胞 ATCC</td><td>CCL-81</td><td>MERS-CoV</td></tr><tr><td>VeroE6細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td>SARS-CoV-2</td></tr></tbody></table>

ヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴づけるための空気-液体界面で増殖した初代鼻上皮細胞の感染

Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions

SARS-CoV(2002年)、MERS-CoV(2012年)、SARS-CoV-2(2019年)の3つの高病原性ヒトコロナウイルス(HCoV)が出現し、過去20年間に重大な公衆衛生上の危機を引き起こしました。毎年、風邪の症例のかなりの部分(HCoV-NL63、-229E、-OC43、-HKU1)がさらに4つのHCoVを引き起こしており、生理学的に関連するシステムでこれらのウイルスを研究することの重要性が強調されています。HCoVは気道に侵入し、すべての呼吸器病原体が遭遇する主要な部位である鼻上皮に感染を確立します。私たちは、患者由来の鼻サンプルを気液界面(ALI)で増殖させる一次鼻上皮培養システムを使用して、この重要なセンチネル部位での宿主と病原体の相互作用を研究しています。これらの培養物は、存在する細胞の種類、繊毛機能、粘液産生など、 in vivo 気道の多くの特徴を再現しています。HCoV感染後の経鼻ALI培養におけるウイルス複製、宿主細胞の向性、ウイルス誘発性細胞傷害性、および自然免疫誘導を特徴付ける方法を、致死性と季節性HCoVを比較した最近の研究を例に説明します1。鼻腔内の宿主と病原体の相互作用に関する理解が深まれば、HCoVやその他の呼吸器系ウイルスに対する抗ウイルス治療薬の新たな標的となる可能性があります。

代表的な数値は、Otter et al.1の原稿に見られるデータから部分的に改作されています。4人または6人のドナー由来の経鼻ALI培養物を、上記のプロトコルに従って4つのHCoV(SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63、およびHCoV-229E)のいずれかに感染させ、各ウイルスの平均頂端排出ウイルス力価を 図1Aに示します。これら4つのHCoVはすべて経鼻ALI培養で生産的に複製されますが、SARS-CoV-2とHCoV-229Eは最も効率的に複製します。なお、これらは平均的なウイルス力価であり、個々のドナーにおける各HCoVの力価が最近発表されたものであることに留意されたい1。プロトコルセクション3に記載されているように経鼻ALI培養物を洗浄した後、頂端表面液(ASL)中のMERS-CoV力価を 図1Bの細胞内ウイルス力価と比較します。MERS-CoVの細胞内および頂端から排出されたウイルス力価は、感...

鼻上皮は、すべての呼吸器病原体が遭遇する主要なバリア部位です。ここでは、空気液界面(ALI)培養物として増殖させた初代鼻上皮細胞を用いて、生理学的に関連性の高いシステムにおけるヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴付ける方法について概説します。

Three highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012), and SARS-CoV-2 (2019) - have emerged and caused significant public ...

ここで説明するプロトコルは、ヒトコロナウイルス感染時の鼻上皮における複製速度論、宿主細胞親和性、自然免疫誘導、細胞毒性誘導などの重要な問題に対処します。このプロトコルにより、不均一な細胞集団や粘液繊毛機能など、in vivo鼻上皮の特徴を密接に再現するオルガノイド微小環境におけるヒトコロナウイルス宿主の相互作用の研究が可能になります。この技術は、下気道に由来するものなど、他のALI培養システムにも適用できます。さらに、このシステムは、喘息性または嚢胞性線維症の気道などの臨床疾患状態を模倣するために使用できます。鼻腔の空気と液体の界面、またはALI培養物を、基底室と頂端室を持つトランズウェルで成長させ、区別します。解離したヒト副鼻腔細胞を水中で拡大し、その後、頂端チャンバーから培地を取り出して、気液界面での培養物の分化を可能にします。感染の前日に、ALI培養物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で頂端に洗浄します。これを行うには、200マイクロリットルの温めたPBSを各トランズウェルの頂端コンパートメントに加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。PBSを吸引し、洗浄プロセスを2回繰り返します。次に、基礎培地をウェルあたり500マイクロリットルの新鮮な培地と交換し、意図した感染温度で一晩培養物を平衡化します。翌日、ウイルスを無血清DMEMで希釈し、総接種量50マイクロリットルで所望の感染多様性を達成します。ウイルス接種物を頂端部に培養物に加え、インキュベーターに1時間戻します。インキュベーション中は15分ごとに、プレートを両手でしっかりと保持して前後左右にゆっくりと揺らし、ウイルス接種物が均一に吸着するようにします。インキュベーション後、ウイルス接種物を吸引し、前述のように各感染培養物をPBSで3回洗浄することにより、ウイルス接種物を完全に除去します。必要に応じて、3回目のPBS洗浄液を採取し、入力ウイルスが適切に除去されたことを確認します。感染したALIの基礎培地を72時間ごとに交換します。感染後の所定の時点で、感染した各トランスウェルの頂端チャンバーに200マイクロリットルのPBSを追加します。.PBSを5回上下にピペットで動かして、頂端から排出されるウイルスを最大限に収集し、全量をマイクロ遠心チューブに移して頂端表面液またはASLサンプルを収集します。次に、サンプルを連続希釈して、標準的なウイルスプラークアッセイを使用してASL中のウイルス粒子の濃度を定量します。画面に示されているように、滴定するヒトコロナウイルス(HCoV)に応じて細胞タイプを選択します。必要に応じて、感染後のさまざまな時点で収集された希釈されていない基礎培地のプラークアッセイにより、基礎放出ウイルスが存在しないことを確認します。経鼻ALI培養物でTEERを測定するには、製造

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

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Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

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本報告書における調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの見解を示すものではない。...

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P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

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この記事では、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の肺上皮、間葉、内皮細胞、およびマクロファージで構成される複雑な多細胞気道バリアモデルを気液界面培養で生成する方法について説明します。...

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学ぶ ヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を、空気-液体界面で増殖した初代鼻上皮細胞を用いて解析する方法。複製動態、細胞傷害性、自然免疫応答を評価し、呼吸器ウイルス感染の治療戦略開発に貢献する。

ヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴づけるための空気-液体界面で増殖した初代鼻上皮細胞の感染

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