ヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴づけるための空気-液体界面で増殖した初代鼻上皮細胞の感染

ここで説明するプロトコルは、ヒトコロナウイルス感染時の鼻上皮における複製速度論、宿主細胞親和性、自然免疫誘導、細胞毒性誘導などの重要な問題に対処します。このプロトコルにより、不均一な細胞集団や粘液繊毛機能など、in vivo鼻上皮の特徴を密接に再現するオルガノイド微小環境におけるヒトコロナウイルス宿主の相互作用の研究が可能になります。この技術は、下気道に由来するものなど、他のALI培養システムにも適用できます。

さらに、このシステムは、喘息性または嚢胞性線維症の気道などの臨床疾患状態を模倣するために使用できます。鼻腔の空気と液体の界面、またはALI培養物を、基底室と頂端室を持つトランズウェルで成長させ、区別します。解離したヒト副鼻腔細胞を水中で拡大し、その後、頂端チャンバーから培地を取り出して、気液界面での培養物の分化を可能にします。

感染の前日に、ALI培養物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で頂端に洗浄します。これを行うには、200マイクロリットルの温めたPBSを各トランズウェルの頂端コンパートメントに加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。PBSを吸引し、洗浄プロセスを2回繰り返します。

次に、基礎培地をウェルあたり500マイクロリットルの新鮮な培地と交換し、意図した感染温度で一晩培養物を平衡化します。翌日、ウイルスを無血清DMEMで希釈し、総接種量50マイクロリットルで所望の感染多様性を達成します。ウイルス接種物を頂端部に培養物に加え、インキュベーターに1時間戻します。

インキュベーション中は15分ごとに、プレートを両手でしっかりと保持して前後左右にゆっくりと揺らし、ウイルス接種物が均一に吸着するようにします。インキュベーション後、ウイルス接種物を吸引し、前述のように各感染培養物をPBSで3回洗浄することにより、ウイルス接種物を完全に除去します。必要に応じて、3回目のPBS洗浄液を採取し、入力ウイルスが適切に除去されたことを確認します。

感染したALIの基礎培地を72時間ごとに交換します。感染後の所定の時点で、感染した各トランスウェルの頂端チャンバーに200マイクロリットルのPBSを追加します。.PBSを5回上下にピペットで動かして、頂端から排出されるウイルスを最大限に収集し、全量をマイクロ遠心チューブに移して頂端表面液またはASLサンプルを収集します。

次に、サンプルを連続希釈して、標準的なウイルスプラークアッセイを使用してASL中のウイルス粒子の濃度を定量します。画面に示されているように、滴定するヒトコロナウイルス(HCoV)に応じて細胞タイプを選択します。必要に応じて、感染後のさまざまな時点で収集された希釈されていない基礎培地のプラークアッセイにより、基礎放出ウイルスが存在しないことを確認します。

経鼻ALI培養物でTEERを測定するには、製造元の指示に従ってEVOM装置を洗浄し、平衡化し、ブランクにします。ブランキングには鼻細胞のない空のトランズウェルを使用し、ブランク測定値を記録します。残留基礎培地を洗浄するには、各ウェルにカルシウムとマグネシウムを含む500マイクロリットルのPBSを含む、事前にラベル付けされた清潔な24ウェルプレートに、感染した各トランズウェルを移します。

次に、カルシウムとマグネシウムを含む200マイクロリットルのPBSを各トランズウェルの頂端コンパートメントに追加します。カルシウムとマグネシウムを含むPBSを1ミリリットルをEndohm-6測定チャンバーに加えます。鉗子を使用して各トランズウェルをEndohm-6測定チャンバーにセットし、蓋を元に戻してチャンバーを閉じます。

頂端電極が頂端コンパートメントの200マイクロリットルのPBSに沈んでいることを確認します。基底電極はチャンバーの底部に残ります。EVOMの読み取り値が安定したら、生のTEER測定値を記録します。

力価測定が必要な場合は、TEER測定後にASLサンプルを採取してください。生の TEER の読み取り値を、画面に表示される方程式を使用して、オーム/センチメートルの 2 乗の最終測定値に変換します。ヒトコロナウイルス(HCoV)については、感染後24時間または48時間間隔でTEERを評価します。

各時点でネガティブコントロールを含めるようにしてください。中程度またはバックグラウンドコントロールの場合は、ASLサンプルの収集に使用したものと同じ組成のPBSを使用します。ポジティブコントロールでは、コントロールALA培養物を200マイクロリットルの2%Triton X-100で頂端に処理します。

10〜15分間インキュベートした後、Triton陽性コントロールサンプル、模擬バックグラウンドコントロールサンプル、PBSコントロールサンプル、および実験サンプルで構成されるプレートレイアウトに従って、全ボリュームをTritonシーリングサンプルとして収集します。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDHプレート)を三重にロードします。最後に、表示された式を使用して、Tritonシーリング値に対する細胞毒性の割合を計算します、4つのHCoVに感染した鼻ALI培養物からの平均頂端排出ウイルス力価は、SARS-CoV-2およびHCoV-229Eが最も効率的に複製されたにもかかわらず、各ウイルスが生産的に複製したことを明らかにしました。

MERS-CoVの細胞内ウイルス力価と頂端性ウイルス力価は、感染後48時間(HPI)でほぼ同じでした。ウイルス抗原に特異的な抗体および繊毛細胞または杯細胞のマーカーを用いて感染した培養物を共染色したところ、SARS-CoV-2およびHCoV-NL63は主に繊毛細胞に感染したが、MERS-CoVは主に非繊毛細胞に感染したことが示された。SARS-CoV-2およびHCoV-NL63感染のベースラインから特定の感染時点またはデルタTEERまでのTEERの差は、MERS-CoV感染とは異なり、192HPIで陰性であり、TEERに大きな変化はありませんでした。

負のdelta-TEER値は、上皮バリアの完全性が損傷していることを示します。HCoV-229Eは、96 HPIの早い時点で上皮バリア機能障害を引き起こしましたが、感染の後半で模擬レベルまで回復しました。感染した各トランズウェルの生のTEERデータを経時的に描写したTEERトレースにより、感染過程のTEER傾向を視覚化することができました。

感染時に頂端から放出されたLDHを定量したところ、SARS-CoV-2、HCoV-NL63、HCoV-229Eは鼻腔培養で有意な細胞毒性を引き起こしたが、MERS-CoVはそうではなかったことが明らかになった。鼻腔培養におけるウイルス複製動態を理解することは、細胞毒性や自然免疫誘導などの他のダウンストリーム解析の最適な時点を決定するため、非常に重要です。TEERの測定は、感染前と感染後のさまざまな時期に同じ培養物で連続して行うと、感染過程におけるTEERの変化を監視するために最も有益です。

私たちの現在の研究では、記載されたシステムにRNAシーケンシングアプローチを適用して、ヒトコロナウイルス感染中の転写変化を理解するとともに、サイトカインやその他のタンパク質産生を測定するためのELISA技術を適用しています。