Name: 植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学ぶ 水耕栽培法によるArabidopsisとMedicagoの根系アーキテクチャ可視化手法。ImageJを用いた非侵襲的解析で、栄養条件による根形態変化を定量化し、植物の環境応答メカニズム解明に貢献します。

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私たちは、この研究を支援してくれた米国農務省(Grant 58-6406-1-017)に感謝しています。また、米国ケンタッキー州ボーリンググリーンの西ケンタッキー大学のWKUバイオテクノロジーセンターと、インドのラクナウにあるCSIR薬用芳香植物中央研究所の所長が機器の設備とサポートを提供してくれたことに感謝します(CSIR CIMAP原稿通信番号CIMAP / PUB / 2022/103)。SSは、米国フィラデルフィアのセントジョセフ大学からの財政的支援を認めています。

プロトコル全体を 図1に概略的に要約し、プラントレットのルートシステムアーキテクチャ(RSA)を明らかにするために必要なすべての重要なステップを示しています。プロトコルの手順を以下に詳しく説明します。
1.シロイヌナズナ種子表面殺菌
<ol><li>種子の小さなスクープ(約100種子=約2.5 mg)を微量遠心チューブに移し、室温(RT)の蒸留水に30分間浸します。この手順全体は無菌状態で実行されます。</li>
	<li>種子を含む微量遠心チューブを500 x g で5秒間短時間遠心分離し、RTの卓上遠心分離機を使用して種子を落ち着かせます。</li>
	<li>水をデカントし、700 μLの70%(v / v)エタノールを加え、数秒間ボルテックスし、回転させます。必要に応じてボルテックスとスピニングを繰り返しますが、70%エタノールの処理時間が3分のままであることを確認してください。</li>
	<li>3分後、直ちに滅菌水で一度すすいでください。長時間のエタノール曝露は発芽を減少させるので、エタノール洗浄ステップをできるだけタイムリーに保ってください。</li>
	<li>種子を希釈した市販の漂白剤(4%v / v)でTween-20を7分間滴下して処理します。チューブを8〜12回急速に反転させて種子を漂白剤溶液と混合し、続いて短時間遠心分離機(RTで5秒間500 x g )を行います。チューブに泡が現れているのが見られます。</li>
	<li>1 mLピペットを使用して上清をデカントし、同じボルテックス手順に従って、滅菌水で少なくとも5回の洗浄で種子を洗い流します。</li>
	<li>表面滅菌した種子を水中に放置し、成層10のために4°Cで2〜3日間インキュベートします。</li>
</ol>2.種子発芽のための水耕栽培システムの設定
<ol><li>標準のマゼンタの箱に蒸留水を半分入れ、オートクレーブします。ポリカーボネートシート(透明な色と滑らかな質感)をオートクレーブし、4cm×8cmの長方形を切り取り、2つの長方形が一緒にスロットしてX字形10を形成することができるように、長方形の半分以上中点に切り欠きを入れます。このセットアップを使用して、12x 24インチシート10から切り取ったポリプロピレンメッシュ(250 μmの孔径の6 cm x 6 cm正方形、または要件に応じて)を保持します。 注意: ポリプロピレンは酸、アルカリ、およびその他の化学物質に対して非常に耐性があります。したがって、それは選択されています。オートクレーブはポリプロピレンメッシュを歪める傾向があります。したがって、アルミホイルで包んで別々に運ぶことをお勧めします。16分、121°C、15psi、または775mmHgの標準的なオートクレーブ条件が推奨されます。</li>
	<li>Shuklaら1で説明されているように、ビタミン+ 1.5%(w / v)スクロースを含む滅菌ハーフMS基礎培地を各ボックスに追加して、層流でポリプロピレンメッシュの下端に到達します。全ての手順は無菌条件下で行われる。</li>
	<li>表面滅菌した種子をメッシュ(孔径250μm)に水耕栽培で播種し、3日間生育させます。</li>
	<li>3日後、苗をメッシュ(500μmの孔径)に移し、2日間成長させます。</li>
	<li>2日後(合計5日後)、苗を対照培地(すなわち、2.0 mM NH4 NO 3、1.9 mM KNO3、0.15 mM MgSO4・7H2O、0.1 mM MnSO4・Oを含有する改変MS栄養培地1)に移し替える。H2O、3.0μM ZnSO4·7H 2O、0.1 μM CuSO 4·5H 2 O、0.3 mM CaCl 2·2H 2 O、5.0 μM KI、0.1 μM CoCl 2·6H 2 O、0.1 mM FeSO 4·7H 2 O、0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O、1.25mM KH 2PO 4、100 μM H 3 BO3、 1 μM Na2MoO4·2H2O、1.5%スクロース、1.25 mM MES、0.1 M MES [pH 6.1]で調整したpH 5.7)および実験培地(例えば、P-[0 mM]処理;KH2PO4は、上記1のような対照培地組成物由来の0.62mMK2SO4に置き換えられる。過剰なPi処理の場合、KH 2 PO4の濃度を修飾MS培地[2.5、5.0、10.0、20.0 mM]1)で増加させ、種子を7日間成長させます。 注:メッシュの孔径(500 μm)が大きいため、胚軸での損傷や切断を必要とせずに、苗全体をスムーズに摘み取りやすくなります。植物は、23°Cで標準的な成長条件(すなわち、16時間の明周期/8時間の暗日長、150μmol・m-2・s-1光強度、60%- 70%湿度)で成長します。</li>
</ol>3. RSAの審査
<ol><li>根の広がりのために寒天(1.1%)プレートを準備します(ペトリプレートサイズ:150 mm x 15 mm)。</li>
	<li>上記のように、オートクレーブ滅菌したろ過した水道水を10〜20 mLのペトリプレートに追加します。メッシュ(500 μm)から苗をそっと引き出し、プレート上の水に浸します。</li>
	<li>丸い水彩画のアートブラシ(サイズ:14、16、18、20番)を使用して、水で満たされたプレートに各小植物の根をそっと広げます。 注:根系の拡散を実行している間、最初に一次根をつかみ、それが軸として機能するので、それを直線に広げます。次に、可能な限り、LRを一次根の両側に対称的に広げます。その後、1次LRにリンクされた2次LRを広げます。この拡散プロセスは一種の芸術です。RSAのイメージを描くアーティストのように、ゆっくりとゆっくりと行います。</li>
	<li>プレートを少し傾けて水を取り除きます。 注:この時点で、これらのスプレッドプレートを4°Cに置くことで手順を一時停止できます。 後で画像処理が必要になったら、プレートを取り出し、しばらくRTに置きます。凝縮した水を拭き取ると、画像を便利に処理できます。</li>
</ol>4. RSA用の画像記録
<ol><li>これらのペトリプレートを適切にスキャンまたは撮影します。 注意: 高品質の写真を取得するには、スキャンには600 dpiの解像度が推奨され、写真撮影には少なくとも12メガピクセルのカメラが推奨されます。</li>
	<li>無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して、ルートシステムのアーキテクチャ特性を測定します(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)。ImageJソフトウェアを使用して根の長さを測定する手順をすばやく実行するには、「DNA輪郭長の測定」17の例を参照してください。 注意: 高解像度スキャナーまたはカメラを使用してキャプチャされた画像のルートの長さを測定するには、次の手順に従います。<ol><li>指定された長さの距離を使用して、スケールを設定します。 図3 のスケールバーの既知の距離は2cmです。ImageJ ツールバーから 直線 ツールを選択します (左から 5 番目のツール)。 直線 ツールを使用して、縮尺記号の輪郭を描く線の選択範囲を作成します。アウトラインを完了したら、右クリック、ダブルクリック、または先頭のボックス内をクリックします。</li>
		<li>既知の縮尺記号の長さをピクセル単位で計測するには 、[解析] ツールバー> [計測] ツールバーを使用します。ピクセルの長さをメモします。</li>
		<li>[解析] タブの [縮尺の設定] タブをクリックして、[縮尺の設定] ダイアログ ボックスを開きます。[ピクセル単位の距離] フィールドに、ピクセルの長さを入力します (上記のとおり)。次に、[既知の距離]フィールドに、縮尺記号で示されている値を入力します(ここでは20 mmです)。[長さの単位] を mm に設定します。ピクセル縦横比は 1.0 です。これで、スケールはミリメートルあたりのxピクセル数で指定されます。この特定の画像のスケールをロックするには、[OK]をクリックします。</li>
		<li>[セグメント化されたライン] ツールを使用して、ルートの長さの輪郭を描くライン選択を作成します。アウトラインを完了したら、右クリック、ダブルクリック、または先頭のボックス内をクリックします。アウトラインに沿って小さな白黒の「ハンドル」をクリックしてドラッグし、必要に応じて線の選択を調整します。</li>
		<li>ImageJ の [解析] タブにある [計測] コマンドを使用して、ルートの長さを定量化します。測定データをスプレッドシートに転送するには、[結果]ウィンドウを右クリックし、ポップアップメニューから[すべてコピー]を選択し、スプレッドシートに切り替えてデータを貼り付けます。 注: 上記のように、ImageJ の [縮尺を設定] オプションで縮尺記号の既知の距離を使用して縮尺を設定します。これにより、単位長さあたりのピクセル数が得られます。新しい画像が分析されるたびに、スケールを新たに設定する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>RSA特性の測定と計算<ol><li>胚軸接合部から根の先端までの一次根の長さを測定します。</li>
		<li>1次および2次のLR長を測定します。</li>
		<li>一次根の分岐ゾーン(BZ)を測定します。1 次ルート (BZPR) の分岐ゾーンは、最初の LR 出現点から最後の LR 出現点まで広がっています。</li>
		<li>BZPR の境界内で発生する LR の数である LR の数を記録します。</li>
		<li>1°LRの全長を1°LRの総数で割ることにより、1次LRの平均長さ(1°LR)(根当たりセンチメートル)を導き出します。</li>
		<li>2次LRの平均長さを測定します。2°LRの全長を2°LRの総数で割って、2次LR(2°LR)の平均長さを計算します。</li>
		<li>1°LR密度を測定します。1°LRの数をBZ PRの長さで割ることにより、1°LR密度(BZPRの単位長さあたりの1°LRの数)を計算します。</li>
		<li>2°LR密度を測定します。2°LRの数を1°LRのBZの長さで割って、2°LR密度を計算します(1°側根のBZの単位長さあたりの2°LRの数)。</li>
		<li>合計ルート長 (TRL) を測定します。これは、一次根、1°LR、および2°LR(存在する場合はそれ以上)の長さの合計です。</li>
	</ol></li>
</ol>5.根毛測定
注:水耕栽培システムは根毛の成長と発達を促進するのに適していませんが、固体の成長培地と同じくらい堅牢であるにもかかわらず、現在の文脈でそれを研究することは依然として重要です。以下の手順に従って、苗の一次根の先端から5mmの切片で根毛の発達を分析します。
<ol><li>根の先端から一次根の2 cmの部分を切り取ります。</li>
	<li>根元部分をスライドにマウントし、10%グリセロールを封入剤として使用します。</li>
	<li>スライドを実体顕微鏡の下に置きます。</li>
	<li>軸方向キャリアを使用して、根毛の画像を視覚化およびキャプチャします。</li>
	<li>前述のように、ImageJソフトウェアを使用して画像を分析して根毛の構造と特性を調べます。</li>
</ol>

<ol><li>Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+study+of+excess+phosphate+response+reveals+ethylene+mediated+signaling+that+negatively+regulates+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3074(2017).</li>
<li>Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+root+system+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Environmental control of root system biology.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).</li>
<li>Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+Arabidopsis+root+system+under+nutrient+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies.</a> Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).</li>
<li>Shukla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+reveals+contrasting+regulation+of+phosphate+starvation+response+%28PSR%29+in+root+and+shoot+of+Arabidopsis+and+its+association+with+biotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress.</a> Environmental and Experimental Botany. , 188(2021).</li>
<li>Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+is+required+for+perception+of+water+availability+to+pattern+root+branches+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).</li>
<li>Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+and+phosphate+availability+and+distribution+have+different+effects+on+root+system+architecture+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).</li>
<li>Lynch, J. P., Brown, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topsoil+foraging%3A+an+architectural+adaptation+of+plants+to+low+phosphorus+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability.</a> Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).</li>
<li>López-Bucio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+availability+alters+architecture+and+causes+changes+in+hormone+sensitivity+in+the+Arabidopsis+root+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system.</a> Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+sucrose+and+auxin+on+localized+phosphate+deficiency-induced+modulation+of+different+traits+of+root+system+architecture+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+the+composition+of+gelling+agents+affect+morphophysiological+and+molecular+responses+to+deficiencies+of+phosphate+and+other+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients.</a> Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).</li>
<li>Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+deficiency+and+excess+of+zinc+on+morphophysiological+traits+and+spatiotemporal+regulation+of+zinc-responsive+genes+reveal+incidence+of+cross+talk+between+micro-+and+macronutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients.</a> Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Fe-responsive+genes+in+bioreduction+and+transport+of+ionic+gold+to+roots+of+Arabidopsis+thaliana+during+synthesis+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).</li>
<li>Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+availability+regulates+root+system+architecture+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).</li>
<li>Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+Arabidopsis+iron+deficiency+response+reveals+conserved+transition+metal+homeostasis+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks.</a> Plant Physiology. 152 (4), 2130(2010).</li>
<li>Kobae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+transporter+of+Arabidopsis+thaliana+AtMTP1+is+localized+to+vacuolar+membranes+and+implicated+in+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.</a> Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).</li>
<li>Al-Ghazi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+responses+of+Arabidopsis+root+architecture+to+phosphate+starvation%3A+evidence+for+the+involvement+of+auxin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling.</a> Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).</li>
<li>S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).</li>
<li>Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+lateral+root+development%3A+pitfalls+and+how+to+avoid+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them.</a> The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).</li>
<li>Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+planta+method+for+transformation+of+Alfalfa+%28Medicago+sativa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa).</a> Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).</li>
<li>Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+Arabidopsis+under+gold+exposure+to+identify+putative+genes+involved+in+the+synthesis+of+gold+nanoparticles+%28AuNPs%29.Genomics+Data%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data.</a> 3, 100-102 (2015).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

この作業では、シンプルな実験装置を使用したRSAのマッピングを実証しました。この方法を使用して、表現型の変化が洗練されたレベルで記録されます。この戦略の利点は、シュート部分がメディアと接触することがないため、小植物の表現型がオリジナルであることです。この方法では、プロトコルに記載されているように、水耕栽培システムを設定して小植物を栽培します。次に、各苗をそのまま取り出し、寒天を充填したペトリプレートに置く。次に、アートブラシを使用して手動でルートシステムを広げ、写真を撮影してImageJソフトウェア1,10,11,12で分析します。
種子の発芽には、細菌、真菌、ウイルスを除去するための種子表面の滅菌が必要です。アルコール - 70%エタノール - は種子表面の殺菌に使用されます。種子を破壊せずに消毒するには、アルコール滅菌の処理...

地下にある根系アーキテクチャ(RSA)は、植物の成長と生産性にとって重要な器官です1,2,3。胚期の後、植物はそれらの最も重要な形態学的変化を経験する。根が土壌中で成長する方法は、地上の植物部分の成長に大きく影響します。根の成長は発芽の最初のステップです。それは異なる利用可能な栄養素1,2,3,4に独自に反応するので、それは有益な形質です。RSAは高度な発達可塑性を示し、これは環境が常に開発に関する決定を行うために使用されることを意味します2,5。環境の変化により、現在のシナリオでは作物生産がより困難になっています。RSAは継続的に、環境シグナルを発達上の選択に組み込んでいます5。その結果、根の発達の背後にある原理を完全に理解することは、植物が変化する環境にどのように反応するかを学ぶために不可欠です2,5。
RSAは、さまざまな栄養素濃度を感知し、表現型の変化をレンダリングします4、6、7、8、9、10、11、12。研究によると、根の形態/ RSAはシュートの形態と比較して非常に可塑性が高いことが示唆されています1,3。RSA形質マッピングは、周囲の土壌環境を変化させる効果を記録するのに非常に有効である1、11、12。
一般に、根の表現型に対する様々な栄養欠乏の影響の不一致は、多くの以前の研究で報告されている3、11、13、14、15。たとえば、リン酸塩(Pi)飢餓による側根(LR)の数、長さ、密度の変化については、いくつかの対照的な報告があります。LR密度の増加は、Pi欠乏条件6,8の下で報告されています。対照的に、Pi欠損条件下でのLR密度の減少は、他の著者によっても報告されています3,13,16。これらの不一致の顕著な原因の1つは、寒天がしばしば10を含む元素汚染しやすいゲル化培地の使用です。研究者は通常、寒天ベースのプレートシステムで実験植物を育て、根の形質を記録します。多くのRSA形質は、寒天物質内に隠蔽または定着していることが多く、文書化することはできません。ユーザーが培地から1つの成分を完全に排除することが多い栄養欠乏症の誘発に関連する実験は、元素汚染が発生しやすいゲル化培地では実行できません11、14、15。寒天培地には、P、Zn、Feなど、多数の栄養素が大量に頻繁に存在します11、14、15。さらに、RSAの成長は、非寒天ベースの液体培地よりも寒天ベースの培地の方が遅い。その結果、RSAの表現型を定量化し定性的に記録するための代替の非寒天ベースのアプローチを確立する必要があります。その結果、ポリカーボネートウェッジ1,10,11で支持されたポリプロピレンメッシュの上にマゼンタボックスベースの水耕栽培システムで苗を飼育する現在の方法が開発されました。
この研究は、Jainらによって記述された以前の方法の詳細な即興バージョンを提示します10。この戦略は、植物の根生物学における現在の需要に合わせて調整されており、モデル植物以外のアルファルファのような植物にも使用できます。プロトコルは、RSAの変化を測定するための主要な方法であり、必要なのは単純な機器だけです。本プロトコルは、正常および改変培地(Pi欠損)において一次根および側根などのいくつかの根の特徴を表現型化する方法を示す。著者の経験から収集された段階的な指示やその他の役立つヒントは、研究者がこの方法で提供される方法論に従うのを助けるために提供されます。本研究は、高次LRを含む植物の根系全体を簡便かつ効果的に明らかにする手法を提供することを目的とする。この方法では、丸い水彩アートブラシを使用して根系を手動で広げ、根の露出を正確に制御できます1,10,11,12。高価な機器や複雑なソフトウェアは必要ありません。この方法は、栄養素の取り込みと成長率を改善しました。植物は根に吸収されやすい栄養豊富な溶液を持っています。この方法は、特に発育初期(発芽後10〜15日)に、植物の根系の形質を詳細にマッピングしたい研究者に適しています。小さな根系、シロイヌナズナやタバコなどのモデル植物、アルファルファなどの非従来型植物に、根系がマゼンタの箱に収まるまで適しています。
シロイヌナズナにおけるRSA発生の表現型分析のステップは、このプロトコルで次のように概説されています:(1)植物の種子表面滅菌の方法(シロイヌナズナ)、(2)水耕システムをセットアップするステップ、続いて培地に種子を播種するステップ、(3)RSA分析のために完全な播種を取り出してペトリプレート上に広げる手順、 (4)RSA用の画像を記録する方法、および(5)ImageJソフトウェアを使用して重要なRSAパラメータを計算する方法。

<table><tbody><tr><td>シロイヌナズナ (Col 0)</td><td>Lehle Seeds</td><td>WT-02</td><td>Columbia (Col-0**, no markers)*</td></tr><tr><td>アートブラシ</td><td>Amazon または他のベンダー</td><td></td><td>水彩丸ブラシ サイズ No. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), 20 (14.2 mm)</td></tr><tr><td>デジタルカメラ付き自動顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>LAS version 4.12.0, Leica Microsystems</td></tr><tr><td>Imaging Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>イメージJ V &nbsp;1.8.0</td></tr><tr><td>マゼンタボックス GA-7</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>50-255-176</td><td></td></tr><tr><td>Medicago sativa</td><td>Johnny's Seeds</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリプレート (150 mm x 15 mm)</td><td>USA Scientific</td><td>8609-0215</td><td>150 mm x 15 mm PS ペトリ皿 (https://www.usascientific.com)</td></tr><tr><td>フォトカメラ</td><td>キャノンまたはニコン</td><td></td><td>マクロモードの任意の高メガピクセル (12 メガピクセル/インチ以上) カメラ</td></tr><tr><td>Plant-Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3301</td><td>アガルゲル&nbsp;植物組織培養に適しています</td></tr><tr><td>ポリカーボネートシート</td><td>アマゾン</td><td></td><td>1 mm&nbsp; 厚い</td></tr><tr><td>ポリプロピレンメッシュ</td><td>アマゾン</td><td></td><td>ポアサイズ 250 & マイクロ;メートル、500&マイクロ;mおよび1000 &micro;m</td></tr><tr><td>スキャナー</td><td>エプソン</td><td></td><td>エプソン パーフェクション V700 写真 (600 dpi でスキャン)</td></tr></tbody></table>

植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

植物の根系構造(RSA)開発に関する包括的な知識は、栄養素の使用効率を改善し、環境問題に対する作物品種の耐性を高めるために重要です。水耕栽培システムのセットアップ、植物の成長、RSAの拡散、およびイメージングのための実験プロトコルが提示されます。このアプローチでは、ポリカーボネートウェッジで支えられたポリプロピレンメッシュを含むマゼンタボックスベースの水耕栽培システムを使用しました。実験設定は、様々な栄養素(リン酸塩[Pi])供給下での苗床のRSAを評価することによって例示される。このシステムはシロイヌナズナのRSAを調べるために設立されましたが、 メディカゴサティバ (アルファルファ)などの他の植物の研究にも容易に適応できます。 シロイヌナ ズナ(Col-0)の植物を本調査では、植物RSAを理解するための例として用いる。種子は、エタノールと希釈された市販の漂白剤を処理することによって表面滅菌され、層別化のために4°Cに保たれます。種子を発芽させ、ポリカーボネートウェッジで支持されたポリプロピレンメッシュ上の液体ハーフMS培地上で成長させる。植物を標準的な生育条件下で所望の日数だけ生育させ、メッシュから穏やかに摘み取り、含水寒天プレートに浸す。小植物の各根系は、丸いアートブラシの助けを借りて、水で満たされたプレート上に穏やかに広げられます。これらのペトリプレートは、RSA特性を文書化するために高解像度で撮影またはスキャンされます。一次根、側根、分岐ゾーンなどの根形質は、無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して測定されます。この研究は、制御された環境環境における植物の根の特性を測定するための技術を提供します。(1)苗を育て、根のサンプルを採取して広げる方法、(2)拡散したRSAサンプルの写真を取得する方法、(3)画像をキャプチャする方法、(4)画像解析ソフトウェアを使用して根の属性を定量化する方法について説明します。本方法の利点は、RSA形質の汎用性が高く、簡単で効率的な測定である。

ルートシステムアーキテクチャ(RSA)のさまざまな形態測定特性は、簡単な実験ツールを使用して測定され、その手順は 図1に概略的に示されています。水耕栽培のセットアップの詳細は、RSAの測定におけるプロトコルの可能性を示しています(図1 および 図2)。
ゲル化剤の観察された違いを考慮して、水耕栽培システムを使用してすべての研究を実施しました3,10。概念実証として、この水耕栽培システムはうまく機能し、Pi不足および十分な条件下での明らかな対照的な表現型を反映しています(図3)。シロイヌナズナの種子を、図2に示すように、ポリプロピレンメッシュ上のハーフMS培地で5日間水耕栽...

簡単な実験ツールを使用して、シロイヌナズナとメディカゴの根系アーキテクチャ(RSA)を調べます。小植物はメッシュ上で水耕栽培され、アートブラシを使用して広げられ、RSAが明らかになります。画像はスキャンまたは高解像度カメラを使用して撮影され、ImageJで分析されて形質をマッピングします。

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

これは、日常的なラボ機器を使用して根系アーキテクチャを測定するための非侵襲的な水耕栽培法です。このプロトコルは、手動で広げることによって植物の根系全体を完全に視覚化することを可能にする。RSA分析の主な利点の1つは、不要な元素汚染を導入することなく植物の根系を研究できることです。この方法は、ホルモン、栄養素、および気候条件を含む直接的な環境相互作用を植物システムのRSAと記録することができる。シロイヌナズナの種子の表面殺菌は、室温の蒸留水に約100個の種子の小さなスクープを浸すことから始めます。30分後、卓上遠心分離機を使用して種子を500 Gで5秒間短時間遠心分離します。次に、水をデカントし、チューブを数秒間ボルテックスする前に700マイクロリットルの70%エタノールを追加します。種子を再度遠心分離します。必要に応じて、ボルテックスと遠心分離を繰り返し、70%エタノール処理が3分を超えないようにします。3分後、直ちに滅菌水で種子を洗い流してください。次に、TWEEN20の滴を含む希釈市販の漂白剤を使用して種子を7分間処理します。チューブを8〜12回急速に反転させて、種子を漂白剤溶液と混合します。短時間遠心分離した後、1ミリリットルのピペットを使用して上清をデカントし、同じボルテックス手順に従って、滅菌水で種子を少なくとも5回すすぎます。表面滅菌した種子を水中に残し、成層のために摂氏4度で2〜3日間インキュベートします。標準のマゼンタボックスを蒸留水で半分満たしたオートクレーブ。オートクレーブ処理したポリカーボネートシートを4 x 8センチメートルの長方形にカットし、長方形の半分以上で中点に切り込みを入れて、2つの長方形が一緒にスロットしてX字型を形成できるようにします。このセットアップを使用して、6 x 6センチメートルの正方形にカットされた250マイクロメートルの細孔サイズのポリプロピレンメッシュを保持します。層流キャビネットで、ビタミンと1.5%スクロースを含む滅菌ハーフMS基礎培地を各ボックスに追加して、ポリプロピレンメッシュの下端に到達します。表面滅菌種子を水耕栽培でメッシュに播種し、3日間栽培します。3日後、苗を500マイクロメートルの孔径メッシュに移し、2日間成長させます。次に、苗を対照培地と実験培地に移し、種子を7日間成長させます。10〜20ミリリットルのオートクレーブ滅菌ろ過水道水をペトリプレートに加えます。500マイクロメートルのメッシュから苗をそっと引き出します。丸いアートブラシの助けを借りて、水で満たされたプレートに植物のような根を広げ、それらを水に浸します。プレートを少し傾けて水を取り除きます。これらのペトリプレートを適切にスキャンまたは撮影します。無料で入手できるImageJソフトウェアを使用してルートシステムアーキテクチャまたはRSA特性を測定し、分析するファイルを開きます。縮尺を設定したら、直線ツールを使用して、縮尺記号の輪郭を描く線の選択範囲を作成します。アウトラインを終了します 右クリック、ダブルクリック、または最初のボックス内をクリックします。既知の縮尺記号の長さをピクセル単位で測定するには、[分析]、[ツールバーの測定]の順にクリックします。ピクセルの長さをメモします。[解析] タブの [縮尺の設定] タブをクリックして、[縮尺の設定] ダイアログ ボックスを開きます。ピクセル単位の距離フィールドでピクセルの長さを確認します。次に、既知の距離フィールドに縮尺記号の値を入力し、長さの単位をミリメートルに設定します。[OK]をクリックして、この特定の画像のスケールをロックします。セグメント化されたラインツールを使用して、ルートの長さの輪郭を描くラインを選択します。アウトラインが完成したら、アウトラインに沿って小さな白黒のハンドルをクリックしてドラッグして、ラインの選択を調整します。ImageJ の [解析] タブで、計測コマンドを選択し、ルートの長さを定量化します。測定データをスプレッドシートに転送するには、結果ウィンドウを右クリックし、ポップアップメニューから[すべてコピー]を選択し、スプレッドシートに切り替えてデータを貼り付けます。RSA形質の測定と計算のために、胚軸接合部から根の先端までの間の一次根の長さを測定します。次に、1次側根、または1度のLR長、および2次の側根、または2度のLR長を測定します。完了したら、すべての測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。最初の側根の出現点から最後の側根の出現点にまたがる一次根(BZPR)の分岐ゾーンを測定して記録します。同様に、BZPRの境界内を起点とする側根の数を記録します。次に、一次および高次側根の平均長さを測定します。一次側根の全長を一次側根の総数で割ることにより、一次側根の平均長さを導出します。次に2次側根の平均長さを測定し、二次側根の全長を二次側根の総数で割ることにより二次側根の平均長さを算出する。一次側根の数をBZPRの長さで割ることにより、一次側根密度を測定します。次に、個々の側根の分岐帯を測定し、二次側根の数を2次側根長の分岐帯の長さで割ることにより、二次側根密度を算出する。完了したら、ルートの全長、つまりTRLを測定します。これは、一次根と一次および二次側根の長さの集合体です。この実験で使用された水耕栽培システムは、無機リン酸塩欠乏および十分な条件下での明らかな対照的な表現型を反映して、うまく機能しました。様々なRSA形質を、水耕栽培条件下で対照的な無機リン酸レジームの下で分析した。無機リン酸欠乏処理は、無機リン酸十分条件と比較して、より短く、より浅く、そしてより少ない分岐RSAを示す根表現型を呼び起こした。一次根長は無機リン酸欠乏条件下で有意に減弱した。1.25ミリモルの無機リン酸塩または対照培地の存在下での一次根長の有意かつ急速な増加は、水耕栽培システムの効率を示し、生理学的変化を適切に反映しました。分岐帯は無機リン酸欠乏条件下で有意に減少した。一次側根の平均長はπ欠損条件において有意に減少した。リン酸欠乏状態により、平均二次側根長も同様に減少したが、平均一次側根長よりも量が少なかった。一次および二次側根の数は、対照の1.25ミリモル無機リン酸条件と比較して、リン酸塩欠乏条件下で大幅に減少しました。一次側根密度は、リン酸欠乏条件下では変化せず、対照に対して、1.25ミリモルの無機リン酸条件であった。二次側根密度は有意な変化を示さず、RSA可塑性への洞察を得るための側根密度の重要性を示しています。ピンセットを使ってメッシュから苗をそっと取り除きました。丸いブラシを使用して水で満たされたプレートに根を広げ、すべての一次根をまっすぐに広げ、側根を対称的に広げ、一次側根にリンクされた二次側根を広げます。同様の方法を使用して、シロイヌナズナの植物の先端のすす面積を計算することができます。シロイヌナズナの葉をもう一方のプレートに広げた後、無料で入手できるImageJソフトウェアを使用して画像をキャプチャおよび分析し、すす領域を決定することができます。このプロトコルは、ルートシステムの可塑性に対する環境の影響に関する質問に答えるために使用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この資料では、RootChipのシロイヌナズナ実生の栽培のためのプロトコル、細胞内の代謝産物レベルの微視的なルートのモニタリングおよびFRETベースの測定と成長条件の自動制御を組み合わせたマイクロイメージングプラットフォームを提供します。...

RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

このプロトコルは、市販のフラットベッドスキャナを使用して、重力刺激に応答するシロイヌナズナ実生の画像を迅速に収集するためのプロセスを説明します。この方法は、下流の分析アルゴリズムのために適した高解像度画像の安価な大容量の捕捉を可能にする。...

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

イン土壌取得したX線コンピュータ断層撮影データから視覚的および定量的な根の構造情報を得るための方法が提供されます。...

三次元根系のための抽出メトリック：イン土壌のX線コンピュータ断層撮影データからボリュームおよび表面分析

ここに提示されているのは、高開口数の対物レンズと浸漬媒体としてのパーフルオロデカリンを使用して、最長3日間の根および胚軸発達の高解像度共焦点経時撮影イメージングのための簡単な技術である。...

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

この資料は、主根と 1 つの光学的平面に根毛を閉じ込めた 2...

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

RGB とハイパー スペクトル イメージング植物根系の生育する土壌の評価の実験的プロトコルが表示されます。ケモメトリック ハイパー スペクトル情報かシリーズ スキャン RGB...

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

可視化とルート成長の in situ測定は非常に困難です。根の発育と栄養への応答に時間をかけて増殖を追跡するカスタマイズ可能な rhizobox...

根の生長およびローカライズされた栄養素に対する反応性を可視化する最適化された Rhizobox プロトコル

リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq...

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

根系の形質を特徴づけることは、特にサトウキビにおいて、まだ初期段階にある研究分野の1つです。サトウキビの根を正確に表現型にするための複数のアプローチを統合することで、包括的かつ全体的な結果が得られ、特定された形質とメカニズムを従来の育種および分子育種に利用することができます。...

サトウキビの根系を特徴付けるための多面的な表現型解析アプローチ

ここでのプロトコルでは、アーバスキュラー菌根のコロニー形成パターンの評価方法と、 Zea mays と Festuca...

フェストゥカルブラとゼアメイズの根におけるコロニー形成パターンと真菌戦略を探索するためのツールとしての菌根マップ

学ぶ 水耕栽培法によるArabidopsisとMedicagoの根系アーキテクチャ可視化手法。ImageJを用いた非侵襲的解析で、栄養条件による根形態変化を定量化し、植物の環境応答メカニズム解明に貢献します。

植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル

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