Name: 高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学ぶ 高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養法。腫瘍組織の解離、コラゲナーゼ処理、BMEを用いた埋め込み培養により、in vitroで腫瘍微小環境を再現するモデルを構築し、新規治療薬と予測バイオマーカーの研究に応用する。

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このプロトコルを確立する上で、ロン・ボーズ医学博士の指導とバーバラ・ブラクート医学博士の支援に感謝しています。また、セントルイスの産婦人科および婦人科腫瘍学部門のワシントン大学医学部、ワシントン大学の学部長の奨学生プログラム、および生殖科学者開発プログラムに、このプロジェクトを支援してくれたことに感謝します。

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<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li>
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<li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+%28total+and+phosphoactivated+proteins%2C+and+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li>
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<li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581(2020).</li>
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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

卵巣癌は、診断時の進行段階、および化学療法耐性の一般的な発達のために非常に致命的です。卵巣がん研究における多くの進歩は、がん細胞株とPDXモデルを利用することによってなされてきました。ただし、より代表的で手頃な価格の in vitro モデルが明らかに必要です。PDOは、腫瘍の不均一性、腫瘍微小環境、および原発腫瘍のゲノムおよびトランスクリプトームの特徴を正確に表すことが証明されているため、薬物療法におけるオルガノイドモデルの実装など、さまざまな研究アプローチに理想的な前臨床モデルです16。
ここで説明するプロトコルは、97%の成功率で示されているように、非常に効果的で信頼性があります。現在の議定書には、慎重な注意を払うべき重要なステップがあることを強調することが重要です。まず、組織からオルガノイドを採取する場合、サンプルが完全に均質化されていることを確認することが不可欠です。これには、必要に応じて解離プログラムを複数回実行する必要があります。サンプルが均質でない場合、残りの組織片がオルガノイドの成長を損なう可能性が...

2021年には、米国で約21,410人の女性が新たに上皮性卵巣がんと診断され、12,940人の女性がこの病気で死亡しました1。手術と化学療法は十分に進歩していますが、進行性疾患の患者の70%以上が化学療法耐性を発症し、診断から5年以内に死亡します2,3。したがって、この致命的な病気を治療するための新しい戦略と、前臨床研究のための代表的な信頼できるモデルが緊急に必要とされています。
原発性卵巣腫瘍から作製されたがん細胞株および患者由来異種移植片(PDX)は、卵巣がん研究で使用される主要な機器です。がん細胞株の主な利点は、その急速な拡大です。しかし、それらの継続的な培養は、表現型および遺伝子型の変化をもたらし、癌細胞株を元の原発癌腫瘍サンプルから逸脱させる。がん細胞株と原発腫瘍の間には既存の違いがあるため、細胞株でプラスの効果がある薬物アッセイは、臨床試験でこれらの同じ効果をもたらすことができません2。これらの制限を克服するために、PDXモデルが使用されます。これらのモデルは、免疫不全マウスに新鮮な卵巣癌組織を移植することによって作成されます。それらは in vivo モデルであるため、ヒトの生物学的特性により正確に似ており、薬物の結果をより予測します。ただし、これらのモデルには、モデルの生成に必要なコスト、時間、リソースなど、大きな制限もあります4。
PDOは、がん細胞株とPDXモデルの両方の限界を克服する前臨床研究の代替モデルを提供します。PDOは、患者の腫瘍および腫瘍微小環境を再現し、したがって、前臨床研究に理想的なin vitro扱い可能なモデルを提供します2,3,5。これらの3Dモデルは、原発腫瘍をモデル化する自己組織化機能を有しており、これはそれらの2次元(2D)細胞株の対応物にはない特徴である。さらに、これらのモデルは、それらの親腫瘍を遺伝的および機能的に表すことが示されており、したがって、新しい治療法および生物学的プロセスを研究するための信頼できるモデルである。要するに、それらは細胞株と同様の長期的な増殖および保存能力を提供するだけでなく、マウスモデルに固有の微小環境および細胞間相互作用も包含する4,6。
本プロトコルは、97%を超える成功率を有する患者由来の腫瘍、腹水、および胸水サンプルからのPDOの作成について説明しています。その後、PDO培養を複数世代にわたって拡張し、薬物療法の感受性と予測バイオマーカーをテストするために使用できます。この方法は、PDOの治療反応に基づいて治療をパーソナライズするために使用できる技術を表しています。

<table><tbody><tr><td>1% HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1% ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Fisher Scientific</td><td>30002CI</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tubes&nbsp;</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>14125</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ティッシュカルチャーディッシュ&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & マイクロ;m Cell Filter</td><td>MidSci</td><td>100ICS</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離チューブ</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Cryovial</td><td>Simport Scientific</td><td>T301-2</td><td></td></tr><tr><td>2% パラホルムアルデヒド固定剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;Cウォーターバス&nbsp;</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCM104</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R31541GA</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Lamda Biotech</td><td>C121</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルトレックス タイプ2</td><td>R&D Systems</td><td>3533-010-02</td><td>基底膜抽出物</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I 反応バッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>ペプロテック</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ペプロテック</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>ジェントルMACS C チューブ</td><td>ミルテニー・バイオテック</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>ジェントルMACS オクト・ディスソシエーター・ヒーター付き</td><td>ミルテニー・バイオテック</td><td>130-096-427</td><td>メーカーのプロトコルを使用しています。</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>ジペプチド、L-アラニル-L-グルタミン</td></tr><tr><td>ヘマトキシリンおよびエオシン染色キット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>NC1470670</td><td></td></tr><tr><td>ヒストプラスト・パラフィン・ワックス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>22900700</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷凍コンテナ</td><td>Fisher Scientific</td><td>07202363S</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>p1000 ピペット ヒント付き&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 ピペット ヒント付き&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット 9インチ</td> <td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>1367820D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>MT21031CM</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロスタグランジン E2</td><td>R&Dシステムズ</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Invitrogen</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>R&D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フード&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織包埋カセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>動物由来不使用の組換え酵素</td></tr><tr><td>II型コラゲナーゼ</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

オルガノイドは、患者由来の卵巣腫瘍組織、腹水、または胸水から正常に増殖できる3D動的腫瘍モデルであり、卵巣癌の新しい治療法と予測バイオマーカーの発見に役立ちます。 これらのモデルは、クローンの不均一性、腫瘍微小環境、および細胞間および細胞-マトリックス相互作用を再現しています。さらに、それらは形態学的、細胞学的、免疫組織化学的、および遺伝的に原発腫瘍と一致することが示されています。したがって、オルガノイドは腫瘍細胞および腫瘍微小環境に関する研究を容易にし、細胞株よりも優れています。本プロトコルは、97%を超える成功率で患者の腫瘍、腹水、および胸水サンプルから患者由来の卵巣癌オルガノイドを生成するための異なる方法について説明しています。患者サンプルは、機械的消化と酵素消化の両方によって細胞懸濁液に分離されます。次に、基底膜抽出物(BME)を利用して細胞を播種し、高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の培養に特異的なサプリメントを含む最適化された増殖培地でサポートします。最初のオルガノイドを形成した後、PDOは、その後の実験のための増殖のための継代を含む、長期間の培養を維持することができる。

PDOを生成するために、サンプルを機械的および酵素的に単一細胞懸濁液に消化しました。次に、細胞をBMEに再懸濁し、特別に操作された培地を添加しました(図3)。オルガノイドは通常、10日間の時間枠で樹立され、その後、培養中に個別のオルガノイドを示します(図4)。
<img alt="腫瘍からオルガノイドへのプロセス図;機械的消化;単一細胞培養;腫瘍研究;BME 埋め込み。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:オルガノイドに形成された患者コレクションの概略図。患者の組織、腹水、または胸...

患者由来オルガノイド(PDO)は、 in vitroで腫瘍環境を模倣できる3次元(3D)培養です。高悪性度漿液性卵巣がんにおいて、PDOは新しいバイオマーカーと治療法を研究するためのモデルです。

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

患者駆動型オルガノイドモデルは、遺伝的および機能的に親腫瘍を表すため、卵巣癌における新しい治療法および複雑な生物学的プロセスを研究するための信頼できるモデルです。これらのモデルは、クローンの不均一性、腫瘍微小環境、およびin vitro細胞間相互作用を再現することにより、癌細胞株および患者由来の異種移植片の限界を克服します。患者由来のオルガノイドは、長期的な拡張および保存機能を提供し、腫瘍生理機能を模倣します。その結果、それらは新しい治療法や予測バイオマーカーの研究に理想的なモデルです。腫瘍サンプルを10センチメートルの組織培養皿に入れ、組織を細かく刻んで使い捨てメスを使用して均質な混合物を作成することにより、オルガノイドの採取を開始します。均質な組織混合物を鉗子を使用して解離チューブに入れる。1〜2ミリリットルの均質化組織ごとに、オルガノイドベース培地中の1ミリリットルあたり1ミリグラムのタイプ2コラゲナーゼ溶液と1ミリリットルのDNase One溶液1ミリリットルを7〜8ミリリットル加えます。溶液を458 Gでボルテックスし、解離機を使用してコラゲナーゼ溶液中に組織を液化します。プログラム37CアンダースコアHアンダースコアTDKを1時間3回実行し、単一セル懸濁液となるまで実行する。完了したら、均質化した混合物を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。20〜40ミリリットルのオルガノイドベース培地を加え、458 Gで溶液をボルテックスし、100マイクロメートルのセルストレーナーを通して溶液をろ過して、新しくラベル付けされた50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。次に、濾過した混合物を1,650Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を吸引する。1ミリリットルあたり100マイクログラムのDnase Oneを調製し、滴下賢明なDNase One溶液を加えて、1ミリリットルのDnase One溶液に細胞を再懸濁します。室温で15分間インキュベートした後、25ミリリットルのオルガノイドベース培地を細胞に加え、転覆させて混合します。次に、細胞を摂氏4度で5分間1, 650 Gで遠心分離し、ガラス製牧草地ピペットを使用して上清を注意深く吸引します。新しく形成された細胞ペレットを、5ミリリットルの予熱した赤血球またはRBC溶解バッファーに再懸濁します。各円錐管内の溶液を458 Gでボルテックスし、5分間インキュベートします。再度、RBC溶解緩衝液に懸濁したペレットを遠心分離し、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を吸引する。ペレットを10ミリリットルのPBSで洗浄し、細胞を遠心分離する前に細胞をボルテックスします。大きな細胞ペレットの場合は、PBSを吸引し、ペレットの上に1ミリリットルのオルガノイドベース培地を追加します。溶液をボルテックス

generation-culturing-high-grade-serous-ovarian-cancer-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

本プロトコルは、患者由来卵巣癌オルガノイドにおけるDNA損傷修復タンパク質を評価するための方法を記載する。ここには、包括的なめっきおよび染色方法、および詳細で客観的な定量手順が含まれています。...

免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

患者由来の乳房腫瘍切除術または正常な乳房組織からヒト乳房オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルがここに提供される。このプロトコルは、ヒト患者由来の乳房オルガノイドを培養、凍結、解凍するための包括的なステップバイステップの手順を提供します。...

患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

患者由来の卵巣がんオルガノイドを用いた治療薬試験の実施に使用できるプロトコルを提示します。...

前臨床薬物検査のための卵巣癌患者由来オルガノイドモデル

腫瘍オルガノイドは、がん研究と個別化医療へのアプローチに革命をもたらしました。これらは、臨床的に関連性のある腫瘍モデルであり、研究者は診療所で腫瘍の一歩先を行くことができます。このプロトコルは、新鮮な膵臓腫瘍組織サンプルおよび膵臓腺癌起源の患者由来の異種移植片から腫瘍オルガノイドを確立します。...

膵臓癌由来腫瘍オルガノイドおよび線維芽細胞の新鮮組織からの樹立

このプロトコルは、さまざまな病期からの卵巣がんオルガノイドを確立するための体系的なフレームワークを提供し、患者固有の変動性の課題に対処して、収量を増やし、その後のアプリケーションのための堅牢な長期拡張を可能にします。これには、組織処理、播種、培地要件の調整、および免疫蛍光染色の詳細な手順が含まれています。...

卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

このプロトコルは、初代ヒト卵巣表面上皮(hOSE)細胞からの三次元(3D)組織オルガノイドの確立を説明しています。このプロトコールには、新たに採取した卵巣からのhOSEの単離、hOSEの細胞増殖、凍結保存融解手順、およびオルガノイドの誘導が含まれます。免疫蛍光、定量分析、スクリーニングプラットフォームとしての有用性の紹介が含まれています。...

組織再生研究のプラットフォームとしてのヒト卵巣表面上皮オルガノイド

このプロトコルは、 in vitro および in vivoでの高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)マウスモデルの開発について詳しく説明しています。マウス卵管オルガノイドの誘導から,ヒトHGSOC遺伝学を再現するための遺伝子組み換え,および腫瘍の in vivo...

高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

私たちは、卵巣の間質豊富な部分からマウス卵巣体細胞を単離する方法と、足場を使わない方法でマウス卵巣体細胞オルガノイドを生成する方法を述べます。...

卵巣微小環境の探査:マウス卵巣体細胞の単離、2次元培養、オルガノイド培養の方法

CRC の PDX 由来器官毛細細胞に緑色蛍光タンパク質 (GFP) レンチ ウイルス粒子の効率的な伝達のためのプロトコルを示す本普及のひと大腸癌の高感度検出 (CRC)...

GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出

患者由来異種移植片(PDX)は、黒色腫の分子および生物学的特徴をより強固に要約し、従来のプラスチック組織培養ベースのアッセイと比較して治療応答のより予測的である。ここでは、新しいPDXモデルの確立と既存のPDXモデルの特性/実験のための標準的な動作プロトコルについて説明します。...

黒色腫患者由来異種移植片モデル

学ぶ 高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養法。腫瘍組織の解離、コラゲナーゼ処理、BMEを用いた埋め込み培養により、in vitroで腫瘍微小環境を再現するモデルを構築し、新規治療薬と予測バイオマーカーの研究に応用する。

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

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