Name: 無傷の心臓小柱を用いたリラクゼーションの機械的制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶ心臓小柱の機械的リラクゼーション制御法。齧歯類心臓から小柱を分離し、ひずみ依存性を測定することで、拡張期機能不全の新規治療標的を特定するための信頼性の高いプロトコルを確立します。

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この研究は、国立衛生研究所(1R01HL151738)および米国心臓協会(18TPA34170169)によってサポートされています。

以下のプロトコルは、ウェイン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。ここでのプロトコルは、げっ歯類の実験対象を利用するためのステップを記載しているが、他のモデル生物における使用に適合させることができる。
1. 事前準備
<ol><li>実験対象を入手し、実験室に順応させます。</li>
	<li>pH 7.3で、それぞれ10〜20 ppmのO2に酸素化することにより、250 mLの灌流溶液と250 mLの修飾タイロード溶液(表1)を準備します。</li>
	<li>カニューレを取り付けた5mLシリンジを準備します。シリンジに灌流液を入れます。マウスには23 G、小型または大型のラットにはそれぞれ18または16 Gのカニューレを使用します。鈍い針の端に長さ1mmのポリエチレン(PE)チューブをスライドさせて(材料表)、結ばれた後に大動脈がカニューレから滑り落ちるのを防ぎます。</li>
	<li>解剖およびカニュレーション領域の完全な準備(図1)<ol><li>2つのきれいな計量ボートの少なくとも半分に灌流溶液を入れます。カニューレの先端を灌流溶液に浸し、カニューレの周りに少なくとも1つの二重ループ縫合糸を配置します。バークランプでシリンジを所定の位置に保持します。</li>
		<li>簡単にアクセスできるように、外科用はさみ、止血剤、虹彩鉗子、小さな湾曲したはさみ、および2つの#3鉗子を配置します。</li>
	</ol></li>
	<li>改変されたTyrodeの溶液をプライミングして実験システム全体に循環させることにより、実験システム(図2)を準備します。チャンバーが完全にいっぱいで安定していることを確認してください。</li>
	<li>力変換器、長さモーター、ペーシングシステム、温度制御システム、データ収集コンピューターなど、すべてのデータ取得ボックスの電源を入れます。</li>
	<li>現在の実験を参照するために必要な *.dap ファイルとポインター ファイルを含むテンプレート フォルダーをコピーして名前を変更します。データ集録ソフトウェアを開きます。</li>
	<li>超純水または灌流溶液中の10%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)に先端を沈めて、小柱分離ツール(バンナスハサミ、#5または#55鉗子、ガラスプローブ)を準備し、金属をタンパク質でコーティングします(図2B)。 注:解剖前に実験システム全体を準備する必要があります。</li>
</ol>2.肉眼的解剖およびカニューレ挿入
<ol><li>動物の被験者の識別、体重、およびその他の関連情報を記録します。</li>
	<li>オプションで、冠状動脈灌流前の凝固のリスクを最小限に抑えるために、安楽死の少なくとも10分前に腹腔内注射 を介して 齧歯類に滅菌生理食塩水中の1,000 U / kgヘパリンを注射します。.</li>
	<li>動物を誘導室に入れ、標準的な手順に従って、100%酸素中で気化した3%〜5%イソフルランを使用して全身麻酔を誘発する。 注意: イソフルランへの暴露を最小限に抑えるために使用される外部スカベンジャー、ダウンドラフトテーブル、またはヒュームフードをオンにします。</li>
	<li>げっ歯類が右反射を失い、呼吸数が遅くなったら:<ol><li>(ラットの場合)動物を誘導室から取り出し、ノーズコーンを通して麻酔を続けながら、解剖パッドに仰臥位で置きます。</li>
		<li>(マウスの場合)誘導室から動物を取り出した直後に頸部脱臼を行う。ノーズコーンは必要ありません。イソフルラン気化器を0%にします。</li>
	</ol></li>
	<li>必要に応じて、げっ歯類の上肢を胸壁から離れた解剖パッドに貼り付け、ピンで支えられたテープを使用して、動物に突き刺さらないように注意します。解剖に進む前に、適切な麻酔の深さ(つま先のつまみ反応の欠如)を確認してください。</li>
	<li>剣状突起のすぐ下で外科用ハサミ(ラットの場合はメイヨー、マウスの場合はメッツェンバウム)を使用して、げっ歯類の腹部の全幅を横切って腹膜腔に皮膚を横切って切断します。</li>
	<li>外科用ハサミを使用して、横方向の切り傷から胸壁の左側と右側の両方に2つの垂直切り込みを傍矢状(胸壁の側面の上)にします。次に、横隔膜を横切って切断し、傍矢状切断を接続し、胸腔を解放します。</li>
	<li>止血剤を使用して剣状突起をげっ歯類の頭に向かってクランプして持ち上げ、胸骨と胸壁をげっ歯類の頭に向かって動かし、胸腔と心臓を露出させます。必要に応じて、傍矢状切開を第2椎骨腔の近くまですばやく伸ばして、心臓を完全に露出させたり、心膜を破壊したりします。</li>
	<li>湾曲した虹彩鉗子を使用して、心臓を慎重に持ち上げて大きな血管を視覚化します。心筋とげっ歯類の脊椎の間に鉗子を置き、より大きな血管を締め付け、心房や心室部分を固定しないように注意しながら心臓を持ち上げます。<ol><li>心臓を少し持ち上げながら、湾曲した虹彩鉗子とげっ歯類の背骨の間に湾曲した虹彩はさみ(凹面)をすばやく置き、大きな血管と肺を心臓から切り取ります。心臓を新鮮な灌流液が入った計量ボートまたはビーカーにすばやく移動し、振って心臓から血液を取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>イソフルラン気化器を0%にします(まだ行っていない場合)。肺、心膜、またはその他の組織の大部分が心臓に付着したままの場合は、カニューレ挿入への干渉を最小限に抑えるために、この時点でそれらを慎重に切り取って廃棄してください。</li>
	<li>湾曲した虹彩鉗子を使用して、準備したカニューレを水没させた状態で、心臓をきれいな計量ボートまたはビーカーに移動します。大動脈をカニューレし、ループ状の絹縫合糸を締めて大動脈を固定し、最大5 mLの灌流溶液で洗い流します。</li>
	<li>カニューレから心臓を取り出し、シリコーンエラストマーでコーティングされた計量皿に入れて、小柱の分離の準備をします。</li>
</ol>3.小柱の分離と平衡化
<ol><li>実体顕微鏡下でシリコーンエラストマーコーティングされた皿に心臓を置き、それを照らします。</li>
	<li>右心室流出路を見つけます。左心房と心室の頂点を皿のシリコーンエラストマーに固定します。</li>
	<li>長いバンナはさみを使用して、右心室流出路から中隔に沿って頂点まで切り取ります。右心室流出路から大動脈近くの右心房まで切断し、次に右心房を切断します(図3B)。</li>
	<li>鉗子を使用して、組織を伸ばさないように注意しながら、流出管から右心室(RV)のない壁を慎重に引き開きます。 注:実験者は、心配することなく切断できる細い白い結合組織ストランドを見つける場合があります。より大きなピンク色(組織)色のストランドは、分離できる小柱である可能性があるため、注意して評価する必要があります。</li>
	<li>右心室三角形の自由壁を皿に固定し、右心室を露出させる(図3C)。</li>
	<li>溶融し、薄い(直径<500 μm)が鋭くない端部で形成されたガラスピペットを使用して、露出した心内膜で自立した小柱を検索します(図3C)。 注:自立型小柱は、その下を完全に調べることができる筋肉のストリップです。三角形の乳頭筋を避けて、平行な辺(一定の幅)を持つ小柱を使用してください。このプロセスとその後の解剖中は、小柱にひずみを加えると損傷を引き起こし、発生した力が低下する可能性があるため、注意してください。</li>
	<li>小さなバンナハサミを使用して小柱を解剖します。小柱の両端に≥1 mmの立方体の組織片を残して、取り付けを可能にします。可能な限り小柱を伸ばさず、金属製の工具も筋肉に損傷を与える可能性があるため、接触を最小限に抑えてください。特定された小柱の近くの筋肉への負担を最小限に抑えるために、必要に応じて心臓を保持しているピンを再配置します。</li>
	<li>7 mLトランスファーピペットの端から~2インチを切り取り、小柱をゆっくりとピペットに引き込み、50%灌流溶液と50%修飾Tyrode溶液を含む新しい計量皿に移します。筋肉を混合溶液中の細胞外カルシウムの増加に数分間平衡化させます。<ol><li>ステップ3.7〜3.8を繰り返して、この時点で追加の小柱を解剖し、バックアップとして追加の小柱を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>実験チャンバーに過融合および/または吸引を供給するポンプをオフにします。大口径トランスファーピペットを使用して、Tyrodeの溶液で満たされた実験チャンバーに小柱を移動します。</li>
	<li>小柱の端にある1つの>1 mmの立方体の組織片を力変換器のフックに固定し、次に2番目の立方体をモーターに固定します。 注意: トランスデューサーへのアクセスを改善するために最初の側面を取り付けるときはモーターと力のトランスデューサーを分離し、小柱がたるんだまま2番目の立方体の組織を取り付けるときはフックをできるだけ近づけます。</li>
	<li>灌流を再開し、筋肉のペーシングを開始してしきい値電圧を決定します。閾値電圧を20%上回るペースで約1時間、小柱を平衡化させます。</li>
	<li>この平衡期間の終わりに、発達した(最小からピークまでの)張力を観察することにより、最適な発達応力発生が達成されるまで、モーターに接続されたマイクロメーターを使用して筋肉をゆっくりと伸ばします。受動的な拡張期緊張がピーク張力よりも速く上昇し、最適な長さが経過したことを示す場合は、筋肉の長さの増加を停止します。</li>
	<li>透過顕微鏡照明をオフにし、グースネック照明器を使用して小柱を急角度で照らします。以前に較正された顕微鏡光学系を介して接続されたカメラを使用して、拡張期中の小柱の画像を実験フォルダにキャプチャします。小柱がカメラの視野よりも広い場合は、筋肉全体で複数の画像を撮ります。</li>
	<li>ピクセル距離を報告するイメージングソフトウェアで画像を開きます。<ol><li>筋肉の直径のピクセル距離をその長さに沿って4回測定します。組織の大きな立方体を除いて、筋肉(小柱)の長さをピクセル単位で測定します。</li>
		<li>筋肉の長さが視野よりも長い場合は、筋肉に沿って基準点を使用して全長を測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>実験フォルダ内のテンプレートを使用して、直径測定値を平均し、以前に取得したキャリブレーションを使用して直径と長さをピクセルからmmに変換します。断面積をπ*直径2/4(mm2)、筋肉の長さをμmで計算します。</li>
</ol>4. データ取得
<ol><li>筋肉が平衡化されたら、データ収集ソフトウェアを開き、 実験を選択します|長さコントロールをクリックし、キャリブレーションされた小柱の長さ(FL)と断面積(面積[m2])をキャリブレーションボックスに入力します。</li>
	<li>テンプレート フォルダー (手順 1.7) から、freeform_file.txtが正しいフォルダーを指していることを確認し、テキスト エディターで freeform.dap ファイルを開きます。*.dap ファイルで等張レベル (アイソトン) を 32,000 に設定します。</li>
	<li>[長さコントロール]ボックスで、[フリーフォーム]タブを選択し、適切な フリーフォーム リストファイルを参照します。データファイリングパスが、データを保存するための正しいフォルダでもあることを確認してください。 Run Experimentを押して完全等尺性けいれんからのデータ集録を開始し、比例ゲインパラメータと積分ゲインパラメータを持つフィードバック制御を使用してロードクランプデータを集録します。</li>
	<li>*.dapファイルでアフターロード(アイソトン)を定義して負荷クランプデータを集録し、テキストエディタでファイルを保存して比例ゲイン(propgain)パラメータと積分(Ki)パラメータの値を反復処理します。データ集録ソフトウェア・インターフェースの [実験の実行 ]を押します。<ol><li>モード(flswitch)を1から設定し、負荷クランプを終了するためのしきい値(flthreshold)をゼロから増やすことにより、この反復中にクランプが元の長さに再延長(緩和荷重5と呼ばれることもあります)してひずみ速度の最大範囲を達成することを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>モード(flswitch)を1から0に変更して、負荷クランプの端を制御します。ロードクランプの終端をゼロ再延長から完全な再延長を開始長さに戻すように変更しながら、収集を繰り返します。<ol><li>長さを長くするには、筋肉がほぼ元の長さに戻るまで、負荷クランプ(flthreshold)を終了するためのしきい値をゼロから段階的に増やします。</li>
	</ol></li>
	<li>モード(flswitch = 1)とスレッショルド(flthreshold = 0)をリセットし、最後のデータ集録を実行します。</li>
	<li>必要に応じて、手順4.4〜4.6を繰り返してスタディのアフターロードを変更します。この取得はすぐに行うことができます。</li>
	<li>必要に応じて、筋肉を伸ばしたり短くしたりして予圧を変更するか、Tyrodeの溶液に化合物を追加して筋肉を治療します。予圧を変更したり、コンパウンドを追加したりする場合は、低速応答20が安定していること、および/またはコンパウンドが筋肉に完全に浸透することを確認するには、最低9,15分待ちます。</li>
	<li>データ取得が完了したら、小柱を取り除きます。必要に応じて、生化学的または組織学的分析のために小柱を凍結または固定します。</li>
	<li>作業エリアと実験システムを清掃し、すべてのチューブを水で洗い流し、すべてのコンポーネントの電源を切ります。</li>
</ol>5.データ分析
<ol><li>定量分析プログラムを使用して、適切なファイル・パスにプログラムを指定してデータ・ファイルを開きます。</li>
	<li>データ解析プログラムがクランプされたビートを分析し、プログラムがロードクランプの開始を正しく取得するようにすることで、緩和を定量化します。<ol><li>等尺性緩和中の応力のピーク負の導関数から緩和率(1/τ)が定量化されるように、荷重クランプの端が特定されていることを確認します。</li>
		<li>グランツ法16を使用して、この指数時定数、またはその他の緩和の適切な定量化(応力の最小導関数、ロジスティック時定数17、または運動学的モデル18)を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>データ分析プログラムがひずみの時間微分を使用してひずみ速度を計算することを確認します。ひずみは、最適な収縮時の長さで割った時間の関数として長さとして計算されます。</li>
	<li>特定の条件のすべてのトレースに対して上記の手順を繰り返します。</li>
	<li>緩和速度とひずみ速度の関係をプロットし、最大データを1s-1未満の生理的ひずみ速度に制限します。緩和段階は指数関数的減衰を反映しない可能性があるため、低ひずみ速度(図4C)でのデータを除外します17,18。</li>
	<li>緩和速度とひずみ速度の間の線の傾きを求め、その傾きをMCRの指標として記録します。</li>
	<li>調査した条件ごとに上記の分析を繰り返します。</li>
</ol>

<ol><li>Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-length+relations+in+isolated+intact+cardiomyocytes+subjected+to+dynamic+changes+in+mechanical+load%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).</li>
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<li>Schick, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+preload+increases+Mechanical+Control+%28strain-rate+dependence%29+of+Relaxation+by+modifying+myosin+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Reduced preload increases Mechanical Control (strain-rate dependence) of Relaxation by modifying myosin kinetics.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 707, 108909(2021).</li>
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<li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+brightfield%2C+fluorescence%2C+and+optical+coherence+tomographic+imaging+of+contracting+cardiac+trabeculae+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62799(2021).</li>
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<li>Raff, G. L., Glantz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+loading+slows+left+ventricular+isovolumic+relaxation+rate.+Evidence+of+load-dependent+relaxation+in+the+intact+dog+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Volume loading slows left ventricular isovolumic relaxation rate. Evidence of load-dependent relaxation in the intact dog heart.</a> Circulation Research. 48, 813-824 (1981).</li>
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弛緩の機械的制御(MCR)は、弛緩進行筋のひずみ速度に対する心筋弛緩速度の依存性を定量化する8、9。ひずみ速度は、後荷重ではなく、緩和速度8を修正するために必要かつ十分である。カルシウム率を変更する介入は心臓の弛緩を大幅に改善することが証明されていないため、機械的介入はメカニズムへの新しい洞察を提供し、拡張期機能障害の新しい治療法を提供する可能性があります。
ここで説明する心筋ひずみ速度を修正するプロトコルは、等張性負荷クランプ8,9を利用する。等張荷重クランプの強みは、後荷重応力の定量的制御です。ウィンドケッセルのようなプロトコルを使用して、後負荷、前負荷、および心臓の働きの変化をさらに調査することができます2,6,7。ロードクランプによって制御されないランプを使用して、ひずみ速度からひずみの変化をより適切に分離することもできます。いずれにしても、後荷重自体は緩和率8の強い修飾子ではないようである。
プロトコルはまた、温度およびペーシング速度についてより生理学的条件に近づくように適合させてもよい。現在のプロトコルの詳細は、MCR の存在を示すために使用されました。実験の質問に応じて、生理学的条件で実験を行うことが一般的に推奨されます。ただし、37°Cまたは高いペーシングレートで行われた実験は、筋肉へのランダウン(損傷)をより迅速に誘発する可能性があります。酸素運搬能力が改善された溶液が必要になる場合があります。さらに、データ収集は、急速なけいれんを解決し、フィードバック制御を提供するのに十分な速さで長さと力をサンプリングできなければなりません。
現在のプロトコルでは、カルシウムの測定やサルコメアの長さの測定と制御は説明されていません。カルシウム測定は他のプロトコル11で対処されているが、サルコメア長測定は適切な装置で追加することができる。サルコメア長制御は、筋肉長が臨床状態と最も相関するパラメータであるため、現在のMCR研究では利用されていない19。さらなるサルコメア長制御(対筋肉長制御)は、動力学の質問に対する具体的な答えを提供するが、サルコメア間の変動と in vivoでのサルコメア長変化の最小限の理解のために、翻訳知識に追加する可能性は低い。
ここでは、データの再現性を高めるために、3つの実験上の考慮事項が強調されています。
第一に、自立型心小柱は、一部の動物では見つけるのが難しい場合があります(未発表の結果とコミュニケーション)。けいれん筋はほとんどのラットに見られますが、ラットの小柱からデータを取得するための合理的な成功率は3分の1です。トラベキュラの成功は、歴史的に20 で使用され、より多くのトラベキュラを持っていると報告されているブラウンノルウェーxルイスF1ラットでより高い可能性があります(未発表のコミュニケーション)。マウスの場合、成功率は低くなる可能性が高く、BL / 6バックグラウンドのマウスでは10人に1人未満が予想されます。ただし、FVBNバックグラウンドのマウスでは、より高いレートが予想されます(未発表の通信および観察)。
第二に、筋肉の損傷は出力を低下させる可能性があります。発達した力が25°Cおよび0.5Hzペーシングで10mN mm-2未満の場合、研究者はトラブルシューティングを実行して、不注意による伸張または金属鉗子と筋肉との接触が発生しているかどうかを評価する必要がある場合があります、溶液が適切に準備されていないかどうか、またはペーシングまたは実験装置が適切に機能しているかどうか。無傷の小柱を利用する他のプロトコルは、移送容器11としてルアーロックシリンジを使用することを示唆している。これは、特にユーザーが非常に遅い流量またはより小さな筋肉セグメントを制御する場合に可能ですが、現在のプロトコルでは、起こりうる損傷を最小限に抑えるために、はるかに大きなボアトランスファーピペットを使用しています。虚血性損傷が発生する可能性がある別のステップは、解剖中です。大動脈は、心筋細胞分離プロトコル21,22に記載されている制限と同様に、最初の腹部切断(ラット)または頸部脱臼(マウス)から3分以内にカニューレ挿入し、灌流溶液で洗い流す必要があります。これにより、心臓組織が心筋麻痺様灌流溶液にさらされない時間が最小限に抑えられます。さらに、30分以上続く解剖は、一般に痙攣性小柱を生じない。したがって、オペレーターは、損傷を最小限に抑えるために、迅速かつ慎重な解剖を実践する必要があります。0.2mm2(2×10〜7m2)を超える断面積は、コア虚血20に罹患し得る。
第三に、筋肉がモーターと力変換器に取り付けられる方法を考慮する必要があります。このプロトコルは現在、フックと自立型小柱に焦点を当てています。弛緩前のストレッチの時々急速な緊張速度は、適切に固定されていない場合に筋肉をスライドさせる可能性があり、それが現在のプロトコルが小柱を保持するために「バスケット」を使用しない理由です23,24。代替の取り付け方法(接着剤、クリップなど25,26)も検討および検証できます。ここで説明するプロトコルは、乳頭筋ではなく小柱を利用します。乳頭筋の脊索は、MCR9の変化を阻害することができる一連の弾力性を誘発する。ただし、筋肉内のアタッチメントの正確な配置は、小柱の長さ(および直径)が大幅に異なるため、測定値に影響を与える可能性は低いです。
フックで筋肉の端を突き刺すことの制限は、取り付けポイント自体も損傷する可能性があることです。(それらの強さに応じて)頻繁な収縮を伴う固定された筋肉組織の引き裂きの可能性は、長さまたは一連の弾性を変化させる可能性がある。この引き裂きの速度を制御することは困難です。同様に、組織とフックの損傷は、ストレッチ中に悪化する可能性があり、問題を引き起こす可能性があります。目視検査、および平衡等尺性力の残りの>80%の現像力値を使用して、調製物が損傷しているかどうかを評価し、除外する必要があります。
別の制限または考慮事項は、この方法によってどの実験的質問に回答できるかに影響します。例えば、灌流溶液中の2,3−ブタンジオンモノオキシム(BDM)の使用を考えてみましょう。BDMはホスファターゼであり、筋肉の機能を変化させる可能性があります。さらに、長い期間の除荷とペーシングの欠如は、潜在的なリン酸化状態が変化した可能性が高いことを意味します。したがって、収縮状態が変化している可能性が高いため、動物の筋収縮性(遺伝子型または治療の違い)を直接評価しようとする場合は注意が必要です。しかしながら、リン酸化の影響は、経路のアゴニストまたはアンタゴニストを添加することによって薬理学的に評価され得る。
要約すると、MCRは、リラクゼーションが筋肉の動き(ひずみ速度)によってどのように調節されるかについての洞察を提供します。MCRは、ミオシン動態の修飾などの薬理学的介入の標的とともに、拡張期疾患の診断とモニタリングに関するより良い洞察を提供するのに役立つ可能性があります。ここで概説されているプロトコルとアドバイスは、数年間の試験で開発された知識を示しており、心臓病の他のシステムやモデルにも適用できるはずです。

心臓弛緩は、ほぼすべての形態の心不全(駆出率が低下した心不全を含む)および多くの心血管疾患で損なわれています。透過性筋肉の心機能を評価するための多くの方法に加えて、無傷の心筋の評価が関心を集めています。そのような組織は、無負荷(収縮する自由な末端)または装填(長さまたは力制御)と評価される。歴史的に、無傷の単離された筋細胞は、細胞体が収縮中に自由に短くなる無負荷状態で評価されてきました。無傷の心臓小柱は、長さの変化が許されない等尺性条件で評価されることが多いが、応力(断面積あたりの力)が発生する。無傷の筋細胞および小柱の両方の方法は、負荷1,2の修飾に収束し始めています。
筋肉を負荷クランプするためのプロトコル(すなわち、生理学的後負荷をシミュレートする指定された値で筋肉の発達したストレスを制御する)は、数十年にわたって開発されてきた3、4、5。無傷の心臓組織では、ロードクランプにより、研究者は等張またはウィンドケッセル様の後負荷を使用してin vivo心周期をより厳密に模倣することができます6、7、8、9。このプロトコルの目的は、MCR(すなわち、緩和率のひずみ速度依存性)を定量化するために使用されるデータを取得することです8,9。
MCRプロトコルは以前の研究から適応されていますが、このプロトコルの焦点は(無傷の心臓組織を利用する同様のプロトコルと比較して)リラクゼーションを変更する生体力学的メカニズムにあります。負荷クランプ3、4、5、7、10を利用するプロトコルと、Windkesselモデル1、2、11に焦点を当てたプロトコルがいくつかありますが、このプロトコルでは、緩和前のストレッチが緩和率をどのように変更するかを具体的に説明しています。我々は、この制御が、ウィガーズ12によって最初に記述された段階である原拡張期8の間に起こることを示した。正常な健康な心臓では、心筋は大動脈弁閉鎖前の(すなわち、等体積弛緩の前)駆出中に延長緊張を受けます13。これは、筋肉が伸び始めるまで後負荷制御の持続時間を延長することによって模倣されます。臨床的証拠は、この延長が疾患状態14で弱まるか失われる可能性があることを示唆しており、収縮末期ひずみ率の変化の意味とメカニズムは完全には解明されていません。.駆出率が保存された拡張期疾患と心不全の治療選択肢がまばらであることを考えると、MCRは弛緩障害の根底にある新しいメカニズムへの洞察を提供する可能性があると仮定します。
ここで説明する肉眼的解剖はげっ歯類に焦点を当てていますが、小柱の単離は任意の無傷の心臓から行うことができ、以前はヒトの心臓小柱8で使用されていました。同様に、データ取得および分析は、心筋細胞または他の単離された筋肉型にも適用することができる1、10。議論には、方法の変更と適応の可能性に関する解説と、脊索9の機械的特性のために乳頭筋を利用しないように注意するなどの制限が含まれています。

<table><tbody><tr>ラット大動脈のカニューレ挿入用の<td>18または16ゲージの鈍い針/カニューレ、</td><td></td><td></td><td>1mmのPE160またはPE205チューブをストップとして使用します</td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオンモノキシム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-25G</td><td></td></tr><tr>マウス大動脈のカニューレ挿入用の<td>23ゲージの鈍い針/カニューレ</td><td></td><td></td>、<td>1mmのPE50チューブをストップ</td></tr><tr><td>5mLシリンジ</td><td>として使用します BD Luer-Lock</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>95% 酸素/5% CO2</td><td>AirGas</td><td>Z02OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>麻酔システム</td><td></td><td>EZ-SA800</td><td>任意の適切な麻酔法/システム</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP-1600</td><td>細かい鉗子、はさみの先端をコーティングするために</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和</td><td>物 フィッシャーケミカル</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>容器解剖皿</td><td>FisherBrand</td><td>08-732-113</td><td>解剖プレートを作成するための皿の重さを量</td></tr>る <tr><td>Crile Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td> マウス<td>肉眼的解剖用</td><td>13005-14</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェア</td><td>SLControl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ収集システム</td><td>MicrostarLabs</td><td>DAP5216a</td><td>任意のDAQを使用できます。&nbsp;これは、SLControl で使用するための PCI ベースのデータ取得です。PCIスロット付きのPCが必要です</td></tr><tr><td>データ解析ソフトウェア</td><td>Mathworks</td><td>Matlab</td><td>カスタムスクリプト</td></tr><tr><td>デュモン #3 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11231-30</td><td>大動脈のカニューレ挿入用</td></tr><tr><td>2倍 デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td>小柱分離用 2倍</td></tr><tr><td>実験システム</td><td>オーロラサイエンティフィック</td><td>801C</td><td>力と長さの制御で任意の適切な実験室を使用することができます</td></tr><tr><td>細かいはさみ、湾曲</td><td>した ファインサイエンスツール</td><td>14061-09</td><td>心臓の除去用</td></tr><tr><td>グースネック ピギーバックイルミネーター</td><td>AmScope</td><td>LED-6WA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>イメージングソフトウェア</td><td>IrfanView</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アイリス鉗子</td><td>の世界</td><td>心臓の除去のための</td>精密機器<td>15915</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td></td></tr><tr><td>メイヨーハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14110-15</td><td>ラット肉眼的解剖用</td></tr><tr><td>メッツェンバウムはさ</td>み<td>ファインサイエンスツール</td><td>14116-14</td><td>マウス肉眼的解剖用</td></tr><tr><td>顕微鏡接続カメラ</td><td>Flir</td><td>BFS-U3-27S5M-C</td><td>取得ソフトウェア付属</td></tr><tr><td>顕微鏡/デジタルイメージングシステム</td><td>オリンパス</td><td>IX-73</td><td>適切な顕微鏡を使用できます。&nbsp;筋肉の長さ、断面積の測定に必要</td></tr><tr><td>取り付けピン/針</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305136</td><td>心を皿に保持するため&nbsp; 27 G x 1-1/4</td></tr><tr><td>取り付けピン/針</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26000-40</td><td>心を皿に保持するため 直径0.4mmの昆虫ピン (Alt to 27G 針)</td></tr> <tr><td>酸素 (O2)</td><td>AirGas</td><td>OX USP300</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>レイニンウサギ</td><td></td><td>実験チャンバー内の流れを作り出すための任意の手段にすることができます</td></tr><tr><td>pHおよび酸素センサー</td><td>メトラー・トレド</td><td>SevenGo pHおよびDO</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237205-100G</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488-500G</td><td></td></tr><tr><td>ロチェスター・ピーン・ヘモスタット</td><td>・ワールド・プレシ</td>ジョン・インスツルメンツ<td>・501708</td><td>ラット肉眼解剖</td></tr><tr><td>用シルク縫合糸、サイズ:4/0</td><td>ファイン・サイエンス・ツール</td><td>18020-40</td>を<td>~1.5インチのピースにカット、水に浸した</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907-100G</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>AmScope</td><td>SM-1TX</td><td></td></tr><tr><td>学生用バンナス スプリングはさみ&nbsp;</td><td>RV</td>のSYLGARD 184シリコーンのエラストマー基盤の開いた<td>ためのファインサイエンスツール</td><td>91500-09</td></tr> ダ<tr><td></td><td>ウコーニング</td><td>3097358-1004</td><td>解剖版を作成するための</td></tr><tr><td>シリンジホルダー</td><td>ハーバーFrieght</td><td>Helping Hands 60501</td><td>リングスタンドの代わりとして使用することができます</td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T0625-1KG</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペットフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>13-711-7M</td><td>先端から幅を広げるボアまで ~1 インチカット</td></tr><tr><td>Vannas スプリングはさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15000-00</td><td>小柱分離用</td></tr></tbody></table>

無傷の心臓小柱を用いたリラクゼーションの機械的制御

Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae

拡張期機能障害は、心血管疾患の症状にまたがる一般的な表現型です。心臓のこわばりの上昇(左心室拡張末期血圧の上昇)に加えて、心臓弛緩障害は拡張期機能障害の重要な診断指標です。リラクゼーションには細胞質カルシウムの除去とサルコメアの細いフィラメントの失活が必要ですが、そのようなメカニズムを標的にした効果的な治療法はまだ提供されていません。血圧(すなわち、後負荷)などの機械的メカニズムは、弛緩を修正するために理論化されている。最近、我々は、その後の心筋組織の弛緩速度を修正するために、後負荷ではなくストレッチのひずみ速度を変更することが必要かつ十分であることを示しました。リラクゼーションの機械的制御(MCR)と呼ばれるリラクゼーションのひずみ速度依存性は、無傷の心臓小柱を使用して評価できます。このプロトコルは、小動物モデルの調製、実験系およびチャンバー、心臓の単離およびその後の小柱の単離、実験チャンバーの調製、ならびに実験および分析プロトコルを記載する。無傷の心臓の緊張を延長する証拠は、MCRが、無傷の筋肉の筋フィラメント動態を評価する方法とともに、薬理学的治療のより良い特性評価のための新しい分野を提供する可能性があることを示唆しています。したがって、MCRを研究することで、心不全治療における新しいアプローチと新しいフロンティアへの道を解明できる可能性があります。

代表的なデータセットを図4に示し、追加の結果を先行文献8,9に見出すことができる。簡単に言うと、ひずみ速度は、等尺性緩和の直前のひずみの導関数から計算されます。ひずみは、最適な長さでの筋肉の長さで割った時間の関数としての長さです。緩和率は1 / τとして計算されます(τは指数時定数16です)。複数のひずみ速度とその結果生じる緩和速度は、緩和の機械的制御(MCR)を決定するために必要です。これらのデータは、緩和率対ひずみ速度グラフにプロットされます。線の傾きはMCRインデックスを提供します。
収縮期末期および拡張期のひずみ速度は1 s-1を超える可能性は低いことに注意してください。したがって、勾配には 1 s-1 &lt;ひずみ速度のみを含める必要があります。低ひずみ速度での緩和率は、応力の最小時間微分(dStress/dtmin)の変化によって交絡する可能性があり、これらの場合、約0.15 s-1 未満のストレッチからのデータは無視される可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig01.jpg"> 図1:肉眼解離と心臓カニュレーション領域の設定。 右から左へ:a。動物用の麻酔導入室は解剖エリアの近くにあります。b.オプションの揮発性ガススカベンジャー用のシュノーケル。c.動物が仰臥位に配置される解剖パッドは、げっ歯類に継続的な麻酔を提供するために(時計回りに)d.ノーズコーン、e.止血剤、f.外科用はさみ、g.利き手(切断)手で簡単にアクセスできるように配置された湾曲した細かいはさみ、H.利き手ではない手で簡単にアクセスできるように配置された湾曲した虹彩鉗子。げっ歯類の上肢は、テープを使用して解剖パッドに貼り付けることができ、心臓をすすぐために灌流溶液を含む解剖皿(または小さなビーカー)を近くに置く必要があります。j.カニューレ挿入のためにステージングされた領域は近くに配置する必要があります。適切なカニューレを備えた注射器をリングスタンドに取り付けます。k.(挿入図)16 Gカニューレのより詳細な画像で、1 mmのPE205チューブが取り付けられ、縫合糸が緩く結ばれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig02.jpg"> 図2:実験領域とツール 。 (A)実験エリア。実験室とデータ収集システムは、近くの倒立顕微鏡(左)で準備されます。小柱の分離と取り付けはステレオスコープの下で行われます(右)。(B)10%BSA溶液に浸して、2つの鉗子、大小のバンナはさみ、およびカスタムガラスプローブの先端を準備します。(C)追加の解剖ツール。シリコーンエラストマーメッキの皿は、細かい解剖中に心臓を取り付けることができます。エンドカットを施した7 mLトランスファーピペットをディッシュとガラスプローブの下に示します。トランスファーピペットのカットチップは廃棄され、拡大されたボアを使用して筋肉を移し、伸びや脱水のリスクを最小限に抑えます。(D)長さ約2 mm、直径0.25〜0.5 mmのガラスピペットの端の拡大画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig03.jpg"> 図3:解剖のガイド。 (A)肉眼的解剖は、皮膚を通って剣状突起の下の腹腔への横方向の切断(1.緑色)から始める必要があります(下肋骨と剣状突起は細い灰色の線で示されています)。腹膜腔から胸郭までの傍矢状切断は(2.ティールと3.青い線)に従い、その後横隔膜を切断する必要があります。次に、止血剤を使用して、剣状突起をクランプし、胸壁を頭に向かって持ち上げることができます。(B)右心室流出路(RVOT)、右心房(RA)、大動脈(Ao)、および左心房(LA)のビューで方向付けられた、シリコンエラストマー皿に固定された無傷のラット心臓。カットの最初のセットは、RVOTからセプタムに沿った頂点までである必要があります(1。黄色の線)。2番目のカットセットは、RVOTから心臓の基部に沿って、次に右心房を横切る必要があります(2.オレンジ色の線)。(C)RVOTを大動脈から慎重に引き離して心臓を開き、ピンで留めることができます。黄色とオレンジ色の線は、 Bで説明したカットに対応しています。自立小柱は、RV自由壁の基部付近と中隔の近くによく見られますが、どこにでも発生する可能性があります(赤い線は共通の場所を示します)。(d)小柱下のガラスプローブの拡大図(黄色の矢印は小柱とプローブの交点を示す)。(E)実験システムには、力変換器(左)とモーター(中央右)の間に小柱(赤い矢印)が取り付けられており、2本のペーシングリード(小柱の上下水平)が側面にあります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig04.jpg"> 図4:代表的なトレースと結果 。 (A)グースネックLEDライトを使用して顕微鏡レンズの軸から急な角度(~75°)で照らされた単一の心臓小柱は、小柱のコントラストを高めます。この例では、2 つの画像が並べて表示され、小柱の全長が示されています。(B)同じ小柱の応力時間(上)曲線とひずみ時間曲線(下)。等尺性けいれんと、収縮期末ひずみ速度の増加における3つの負荷クランプけいれんが示されています。(C)代表的なMCR計算。MCRは、緩和速度とひずみ速度の間の線の傾きとして定義されます。議論で述べたように、定量的で再現性のあるMCRを提供するために、ひずみ速度を制限することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1: ソリューション。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879_Table1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

急速な心筋および心臓の弛緩は、正常な生理機能に不可欠です。機械的緩和機構は、ひずみ速度に依存することが現在知られている。このプロトコルは、リラクゼーションの機械的制御をさらに研究するための実験の取得と分析の概要を提供します。

Diastolic dysfunction is a common phenotype across cardiovascular disease presentations. In addition to elevated cardiac stiffness (elevated left ...

このプロトコルは、心臓小柱における弛緩の機械的制御または筋弛緩のひずみ依存性を測定する方法を記載している。この技術の主な利点は、心臓の弛緩に焦点を当てていることです。拡張期疾患の治療選択肢がないことを考えると、この手法は、心臓の弛緩に関連する新しい指標と薬物標的を特定するために使用される可能性があります。この方法はげっ歯類の心臓で示されますが、無傷の筋肉にも使用できます。この手順を実演するのは、私と私の研究室の学部研究助手であるアニタ・アボです。まず、肉眼的に解剖した小動物モデルの心臓をカニューレから取り出し、シリコーンエラストマーでコーティングされた計量皿に入れて、小柱の分離の準備をします。次に、実体顕微鏡で心臓を置いて照らします。右心室流出路を見つけた後、左心房と心室頂点を皿のシリコーンエラストマーに固定します。長いバンナはさみを使用して、右心室流出路から中隔に沿って頂点まで切り取ります。次に、右心室流出路から大動脈近くの右心房まで切断し、次に右心房を切断します。鉗子を使用して、組織を伸ばさずに流出路から右心室自由壁を慎重に引き開きます。白い細い結合組織ストランドが見つかった場合、切断できますが、大きなピンク色の組織ストランドは小柱である可能性があるため、切断することはできません。右心室三角形の自由壁を皿に固定して、右心室を露出させます。薄い鈍端の溶融ガラスピペットを使用して、圧力を加えることなく、露出した心内膜で自立性小柱を検索します。三角形の乳頭筋を避け、右心室自由壁の基部近くと中隔に沿ってよく見られる平行な側面を持つ小柱を選択します。小さなバンナスハサミを使用して小柱を解剖し、小柱の両端に1ミリメートル立方体の組織片を残して取り付けます。次に、7ミリリットルのトランスファーピペットの端から約2インチを切り取り、小柱をゆっくりとピペットに引き込み、50%灌流溶液と50%修飾タイロード溶液を含む新しい計量皿に移します。筋肉を平衡化させて、混合溶液内の細胞外カルシウムの増加を数分間放置する。実験室に過融合または吸引を供給するポンプをオフにします。大口径トランスファーピペットを使用して、Tyrodeの溶液で満たされた実験チャンバーに小柱を移動します。小柱の端にある1つの立方体の組織片を力変換器のフックに固定し、次に2番目の立方体をモーターに固定します。灌流を再開し、筋肉のペーシングを開始してしきい値電圧を決定します。しきい値電圧を約20%上回るペースで約1時間。この平衡期間の終わりに、モーターに接続されたマイクロメータを使用して筋肉をゆっくりと伸ばし、発達した張力を観察することによって最適な発達応力発生が達成されるまで。受動的な拡張期緊張がピーク張力よりも速く上昇し、最適な長さが経過したことを示す場合は、筋肉の長さの増加を停止します。透過顕微鏡照明をオフにし、グースネック照明器を使用して急角度で小柱を照らします。顕微鏡光学系を介して接続された以前に較正されたカメラを使用して、拡張期中の小柱の画像を実験フォルダにキャプチャします。直径を測定し、以前に取得したキャリブレーションを使用して、直径と長さをピクセルからミリメートルに変換します。断面積と筋肉の長さをマイクロメートルで計算します。データ収集ソフトウェアでは、dapファイルで後負荷を定義して負荷クランプデータを取得し、テキストエディタでファイルを保存して比例ゲインと積分パラメータの値を反復し、インタフェースの[実験の実行]を押します。モードを変更して負荷クランプの端を制御します。ロードクランプの端をゼロから完了に変更しながら、取得を繰り返し、開始長さまで再延長します。長さを長くするには、筋肉が元の長さにほぼ再延長されるまで、負荷クランプを終了するためのしきい値をゼロから段階的に増やします。必要に応じて、アフターロードを変更し、すぐに集録を繰り返します。必要に応じて、筋肉を伸ばしたり短くしたりして予圧を変更するか、Tyrodeの溶液に化合物を追加して筋肉を治療しますが、遅い力の反応が安定し、化合物が筋肉に完全に浸透するまで、最低20分待ちます。データ取得が完了したら、小柱を取り外し、実験系を清掃します。データ解析プログラムがクランプされたビートを分析し、プログラムが負荷クランプの開始を正しく取得するようにすることで、緩和を定量化します。特定の条件のすべての痕跡を定量化した後、緩和速度とひずみ速度の関係をプロットし、最大データを1秒あたり1未満の生理学的ひずみ速度に制限します。緩和段階は指数関数的減衰を反映していない可能性があるため、ひずみ速度が低いデータを除外します。弛緩速度とひずみ速度の間の線の傾きを求め、その勾配を弛緩の機械的制御の指標として記録します。ここでは、グースネックLEDライトを使用して顕微鏡レンズの軸から75度の急角で照らされた単一の心臓小柱を示しています。同じ小柱の応力時間とひずみ時間曲線は、増加および収縮期のひずみ速度で等尺性けいれんと3つの荷重クランプけいれんを示しました。ひずみ速度は、等尺性緩和直前のひずみの導関数から計算されます。データは緩和率対ひずみ速度グラフにプロットされ、線の傾きは緩和の機械的制御、つまりMCRインデックスを提供します。このプロトコルで最も難しい要素は、心臓小柱の慎重な分離です。このプロトコルは、細胞内カルシウム、収縮性、サルコメア長など、筋肉の他の測定値と組み合わせることができます。また、この方法は、分子メカニズムを特定し、心臓弛緩障害の病態生理学をよりよく理解するために使用されています。

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無傷の心臓小柱を用いたリラクゼーションの機械的制御

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