Name: シミュレーション教師あり学習によるミトコンドリア形態の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T12:05:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶシミュレーション教師あり機械学習によるミトコンドリア形態解析法。固定細胞の蛍光顕微鏡画像から高精度セグメンテーションを自動化し、CCCP処理効果の定量的評価が可能となる革新的な計算生物学アプローチです。

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著者らは、アリフ・アフメド・セクとの議論を認める。ザンバラル・ブジャバルは、安定したH9c2細胞の構築に貢献したことで知られています。ERC開始助成金番号804233(KAへ)、科学再生のための研究者プロジェクト助成金番号325741(DKへ)、ノルウェー北部地域保健局助成金番号HNF1449-19(Å.B.B.)、およびUiTのテーマ別資金提供プロジェクトVirtualStain with Cristin Project ID 2061348(D.K.P.、Å.B.B.、K.A.、およびA.H.)。

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<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-morphosis%3A+Mitochondrial+fusion%2C+fission%2C+and+cristae+remodeling+as+key+mediators+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li>
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<li>Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+deprivation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+PC12+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).</li>
<li>Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+a+skeletal+muscle+cell+line+model+of+mitochondrial+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity.</a> Redox Biology. 2, 224-233 (2014).</li>
<li>Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+morphology+by+membrane+potential%2C+and+DRP1-dependent+division+and+FZO1-dependent+fusion+reaction+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).</li>
<li>Miyazono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupled+mitochondria+quickly+shorten+along+their+long+axis+to+form+indented+spheroids%2C+instead+of+rings%2C+in+a+fission-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner.</a> Scientific Reports. 8, 350(2018).</li>
<li>Ganote, C. E., Armstrong, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CCCP-induced+mitochondrial+uncoupling+and+cyclosporin+A+on+cell+volume%2C+cell+injury+and+preconditioning+protection+of+isolated+rabbit+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).</li>
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<li>Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+phase+contrast+optics+to+restore+artifact-free+microscopy+images+for+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation.</a> Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).</li>
<li>Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+of+bright-field+microscopy+images+depicting+pap-smear+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen.</a> Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).</li>
<li>Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberration+compensation+in+aplanatic+solid+immersion+lens+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Express%22%5BJournal%5D)">Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy.</a> Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).</li>
</ol>

著者は、この記事に関連する利益相反はないと宣言します。

プロトコルの重要なステップに関連する注意事項については、「ジオメトリ生成」と「シミュレータパラメータ」の段落で説明します。「転移学習」というタイトルの段落では、複数の顕微鏡に適応する際のスループットを高めるための変更について説明します。「粒子分析」および「他の細胞内構造の生成」に関する段落は、この方法の将来の応用に言及している。「生物学的真実との違い」に関する段落では、シミュレーションが実際のデータと異なる可能性があるさまざまな理由と、これらの理由がアプリケーションに影響を与えるかどうかについて説明します。最後に、「密集した構造」の段落で、この方法の困難なシナリオについて説明します。
ジオメトリ生成 ミトコンドリアの3Dジオメトリを生成するには、bスプライン曲線をスケルトンとして作成した単純な2D構造が合成データセットの作成に適しています。これらの合成形状は、2D細胞培養で観察されるミトコンドリアの形状に厳密にエミュレートしています。しかし、心臓組織などの3D組織の場合、ミトコンドリアの形状や配置はかなり異なります。このような場合、セグメンテーションモデルのパフォーマンスは、シミュレートされた画像に方向性を追加することで向上する可能性があります。
シミュレーターのパラメーター シミュレーターのパラメーターを設定するときは、推論を実行するデータのパラメーターと一致するように設定しないと、セグメンテーションのパフォーマンスが低下する可能性があるため、注意が必要です。そのようなパラメータの1つが信号対雑音比(SNR)範囲です。テストするデータの SNR の範囲は、シミュレートされたデータセットの値と一致する必要があります。さらに、使用するPSFは、ターゲット・テスト・データのPSFと一致する必要があります。例えば、共焦点PSFからのモデルトレーニング画像は、落射蛍光顕微鏡からの画像のテストには使用しないでください。注意すべきもう一つのパラメータは、テストデータで追加の倍率を使用することです。テストデータで追加の倍率が使用されている場合は、シミュレーターも適切に設定する必要があります。
転移学習 転移学習は、あるタスクでトレーニングされた学習済みモデルを別のタスクで使用するために活用する現象です。この現象は、さまざまな種類の顕微鏡データに関連する私たちの問題にも当てはまります。あるタイプの顕微鏡データでトレーニングされたセグメンテーションモデル(ソースコードで提供)の重みを使用して、別のタイプの光学顕微鏡データで使用するセグメンテーションモデルを初期化できます。これにより、トレーニングデータセットの大幅に小さなサブセット(10,000枚に対して3,000枚の画像)でトレーニングできるため、シミュレーションの計算コストを削減できます。
粒子分析 粒子解析は、セグメント化されたマスクに対しても実行できます。これにより、個々のミトコンドリアの面積や曲率などの情報を得ることができます。この情報は、ミトコンドリアの定量的比較の指標としても役立ちます(この実験には使用されません)。例えば、現在のところ、ミトコンドリアの長さに基づく閾値を用いてドット形態を定義している。場合によっては、楕円率を組み込んで、小さな棒状のミトコンドリアを点状または点状のミトコンドリアからよりよく分離することが有用であり得る。あるいは、特定の生物学的条件によってミトコンドリアが丸くなる場合は、ミトコンドリア集団を分析するために曲率の定量化が興味深い場合があります。
他の細胞内構造の生成 物理ベースの細胞内構造のセグメンテーションは、ミトコンドリアと小胞について実証されています1。小胞はさまざまな形状を示しますが、サイズは小さく、蛍光顕微鏡で観察すると単純な球体に見えます。したがって、小胞の形状は、適切な直径範囲の球構造を使用してシミュレートされます。これは、関数の変更が構造の形状(ミトコンドリアの場合は円柱、小胞の場合は球)とそれぞれのパラメータを生成することを意味します(プロトコルセクションのステップ5.4)。幾何学的には、小胞体および微小管も管状構造体としてシミュレートされている17。直径150 nmの小胞体と平均外径25 nmの微小管、直径15 nmの内側の中空管をモデル化することで、これらの構造の形状の近似が得られます。これらの細胞内構造のそれぞれについて変化する別のパラメータは、蛍光色素密度である。これは、蛍光色素が結合する生体分子の分布と結合確率に基づいて計算されます。
生物学的グラウンドトゥルースとの違い ディープラーニングモデルのシミュレーション教師ありトレーニングに使用されるシミュレーションデータは、多くの点で実際のデータと異なります。(i)シミュレーションデータに非特異的標識が含まれていないのは、実データに浮遊蛍光色素が存在することが多いため、実データとは異なります。これにより、実際の画像の平均背景値が高くなります。この差は、SNRを一致させ、観測された実際の値と一致するように背景値を設定することで軽減されます。(ii)細胞内構造の運動と光動力学は、システム内のダイナミクスの2つの源です。生細胞内の移動する構造(数ミリ秒の範囲で移動する)は、モーションブラーを引き起こします。ぼかし効果を回避するために、実際のデータ収集中の露光時間が短縮されます。一方、タイムラプスをシミュレートせず、動かない構造を想定します。この仮定は、実データの露光時間が小さい場合に有効です。ただし、この仮定により、実際のデータの露光時間がモーション ブラーを導入するのに十分な大きさである場合、出力に誤差が生じる可能性があります。一方、光動力学はナノ秒からマイクロ秒のオーダーであり、実験の通常の露光時間は光動力学の効果を平均化するのに十分な長さ(ミリ秒のオーダー)であるため、シミュレーションでは省略できます。(iii)顕微鏡画像のノイズは異なる発生源を持ち、これらの発生源は異なる確率密度関数を持っています。これらの個々のノイズ源をモデル化する代わりに、一定のバックグラウンド上のガウスノイズとして近似します。この差は、シグナル対バックグラウンド比が低い条件(2〜4の範囲)および蛍光色素1のマクロ密度を扱う場合のデータ分布を大きく変えることはありません。(iv)イメージングのアーティファクトは、収差、ドリフト、および体系的なぼやけから発生する可能性があります。顕微鏡は整列しており、実際のデータで分析するために選択された領域にはこれらのアーチファクトがないと仮定します。これらのアーティファクトのいくつかをPSF 18,19,20でモデル化する可能性もあります。
密集した構造 重なり合うロッドとネットワークを区別できないことの難しさは、2D顕微鏡データのセグメンテーションにおける永続的な問題です。非常に困難なシナリオが 図5に提示されており、ミトコンドリアが密集しているため、セグメンテーションモデルと次の分析で最適ではない結果が得られます。この課題にもかかわらず、このような状況で形態学的演算子を使用してスケルトン化をスリムにすることは、すべてのミトコンドリア形態カテゴリの有意な変化を引き続き検出できるようにしながら、これらの過度に接続されたネットワークを壊すのに役立ちます。さらに、イメージングに広視野顕微鏡ではなく共焦点顕微鏡を使用することは、焦点が合っていない光を排除することによってこの問題を部分的に軽減する1つの方法です。さらに将来的には、交差する(物理的にネットワークを形成する)ミトコンドリアと、単一の平面内の突起が互いに重なる棒状のミトコンドリアを区別するために3次元セグメンテーションを行うことが有用であると考えられる。
ディープラーニングセグメンテーションは、顕微鏡ユーザーの分析機能を拡張する有望なツールであり、以前は管理できなかった複雑なデータや大規模な定量データセットの自動分析の可能性を開きます。

本論文では、蛍光ミトコンドリアマーカーを発現する固定心筋芽細胞の蛍光顕微鏡画像における細胞内セグメンテーション1 のための物理ベースの機械学習ツールの有用性を実証します。
ミトコンドリアは、哺乳類細胞の主要なエネルギー産生細胞小器官です。具体的には、ミトコンドリアは非常に動的な細胞小器官であり、長さと分岐が絶えず変化しているネットワークによく見られます。ミトコンドリアの形状はその機能に影響を与え、細胞は環境の変化に適応するためにミトコンドリアの形態を素早く変化させることができます2。この現象を理解するために、ミトコンドリアをドット、ロッド、またはネットワークとして形態学的に分類することは非常に有益です3。
ミトコンドリアのセグメンテーションは、細胞内のミトコンドリア形態の解析に不可欠です。ミトコンドリアの蛍光顕微鏡画像をセグメント化および分析する現在の方法は、手動セグメンテーションまたは従来の画像処理アプローチに依存しています。大津4 のような閾値ベースのアプローチは、顕微鏡画像のノイズレベルが高いため、精度が低くなります。通常、ミトコンドリアの形態学的解析用の画像は多数のミトコンドリアを特徴としているため、手動のセグメンテーションは面倒です。MorphoLibJ5 のような数学的アプローチやWeka6 のような半教師あり機械学習アプローチは非常に要求が厳しく、専門知識が必要です。ミトコンドリア7 の画像解析技術のレビューは、深層学習ベースの技術がこのタスクに役立つ可能性があることを示しました。実際、自動運転などのアプリケーション向けの日常生活画像の画像セグメンテーションは、ディープラーニングベースのモデルの使用によって革命を起こしました。
ディープラーニングは、大量のデータから学習するアルゴリズムを提供する機械学習のサブセットです。教師ありディープラーニングアルゴリズムは、グラウンドトゥルース(GT)ラベルで注釈が付けられた大量の画像セットから関係を学習します。蛍光顕微鏡画像でミトコンドリアをセグメント化するために教師ありディープラーニングを使用する場合の課題は2つあります。まず、教師ありディープラーニングにはトレーニング画像の大規模なデータセットが必要であり、蛍光顕微鏡の場合、この大規模なデータセットを提供することは、より簡単に利用できる従来のカメラベースの画像を使用する場合と比較して、広範なタスクになります。第二に、蛍光顕微鏡画像は、トレーニング画像内の関心のあるオブジェクトのGTアノテーションを必要としますが、これは専門知識を必要とする面倒な作業です。この作業は、蛍光標識された細胞内構造を持つ細胞の単一の画像に対して、専門家の時間の数時間または数日かかることがあります。さらに、アノテーター間のばらつきも問題となります。手動アノテーションの必要性を排除し、ディープラーニング技術の優れたパフォーマンスを活用できるようにするために、ここでは、シミュレートされた画像でトレーニングされたディープラーニングベースのセグメンテーションモデルが使用されました。物理ベースのシミュレータは、顕微鏡での画像形成のプロセスを模倣および制御する方法を提供し、既知の形状の画像の作成を可能にします。物理ベースのシミュレータを利用して、ミトコンドリアのシミュレートされた蛍光顕微鏡画像の大規模なデータセットがこの目的のために作成されました。
シミュレーションは、形状生成にパラメトリックカーブを使用したジオメトリ生成から始まります。エミッタは、密度が実験値と一致するように均一に分布した方法で形状の表面にランダムに配置されます。顕微鏡の3次元点像分布関数(PSF)は、ギブソン・ラニモデル9の計算効率の高い近似8を用いて計算される。シミュレーション画像と実験画像とを厳密に一致させるために、暗電流とショットノイズの両方をエミュレートして、写真のリアリズムを実現します。物理 GT はバイナリ マップの形式で生成されます。データセットを生成し、シミュレーションモデルをトレーニングするためのコードが利用可能であり10、このシミュレートされたデータセットを作成する手順を図1に示します。
固定心筋芽細胞の共焦点顕微鏡画像を解析することにより、シミュレートされたデータセットで完全にトレーニングされたディープラーニングベースのセグメンテーションの有用性を紹介します。これらの心筋芽細胞は、ミトコンドリア外膜に蛍光マーカーを発現し、蛍光顕微鏡画像におけるミトコンドリアの可視化を可能にした。ここで例として挙げた実験を行う前に、細胞からグルコースを奪い、培養中で7日間ガラクトースに適応させた。増殖培地中のグルコースをガラクトースに置き換えると、培養中の細胞がより酸化的になり、したがって、エネルギー生産をミトコンドリアに依存するようになります11,12。さらに、これにより、細胞はミトコンドリアの損傷に対してより敏感になります。ミトコンドリアの形態変化は、細胞培養培地13にカルボニルシアン化物m−クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)などのミトコンドリア脱共役剤を添加することによって実験的に誘導することができる。CCCPはミトコンドリア膜電位(ΔΨm)の喪失をもたらし、したがって、ミトコンドリアをより管状(棒状)からより球状(ドット状)の形態に変化させる14。さらに、ミトコンドリアはCCCP治療中に腫脹する傾向があります15。ガラクトース適応心筋芽細胞をミトコンドリア脱共役CCCPで処理した場合のミトコンドリア変化の形態分布を表示します。ミトコンドリアの深層学習セグメンテーションにより、ミトコンドリアをドット、ロッド、またはネットワークとして分類することができました。次に、さまざまなミトコンドリア表現型の枝の長さと存在量を評価するための定量的指標を導き出しました。解析のステップを図2に概説し、細胞培養、イメージング、ディープラーニングによるセグメンテーションのためのデータセット作成、ミトコンドリアの定量解析の詳細を以下に示します。

<table><tbody><tr><td>12ウェルプレート</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>水性グルタルアルデヒド EMグレード 25%</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>16200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1</td><td>ツァイス</td><td></td><td>明視野顕微鏡</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>n/a</td><td>n/a</td> Linux <td>/ Windowsオペレーティングシステムを実行している必要があります NVIDIA GPUを搭載した少なくとも4GBのメモリ</td></tr><tr><td>カバースリップVWR</td><td></td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(汚れ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr>スライド<tr><td>ガラス(つや消しエッジ)</td><td>epredia</td><td>AA00000112E01MNZ10</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 mCherry-EGFP-OMP25</td><td></td><td></td><td>購入した細胞株に由来する社内安定細胞株</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>用封入剤 (ガラス)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液、PBS 中 4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>プランアポクロマート 63x オイル (M27) 対物レンズ、NA 1.4</td><td>ツァイス</td><td>420782-9900-000</td><td></td></tr><tr><td>滅菌層流フード</td><td>Labogene</td><td></td><td>SCANLAF MARS</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Vacusafe 吸引システム</td><td>VACUUBRAND</td><td>20727400</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.6</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

シミュレーション教師あり学習によるミトコンドリア形態の解析

Analyzing Mitochondrial Morphology Through Simulation Supervised Learning

細胞蛍光顕微鏡画像におけるミトコンドリアなどの細胞内オルガネラの定量的分析は、これらの小さく形態学的に多様な構造のセグメンテーションに固有の課題があるため、困難な作業です。本稿では、固定細胞の蛍光顕微鏡画像におけるミトコンドリア形態の定量化のための機械学習支援セグメンテーションおよび分析パイプラインの使用を示します。ディープラーニングベースのセグメンテーションツールは、シミュレートされた画像でトレーニングされ、教師ありディープラーニングのグラウンドトゥルースアノテーションの必要性を排除します。蛍光ミトコンドリアマーカーを安定発現させた固定心筋芽細胞の蛍光顕微鏡画像に対するこのツールの有用性を実証し、特定の細胞培養条件を使用してミトコンドリアの形態変化を誘導します。

蛍光ミトコンドリアマーカーを発現する固定心筋芽細胞の共焦点画像におけるミトコンドリアの深層学習セグメンテーションの結果は、この方法の有用性を示しています。この方法は、他の細胞タイプや顕微鏡システムと互換性があり、再トレーニングのみが必要です。
蛍光ミトコンドリアを有するガラクトース適応H9c2心筋芽細胞をCCCPの有無にかかわらず2時間処理した。次に、細胞を固定し、核色素で染色し、蛍光顕微鏡分析のためにスライドガラスに取り付けました。共焦点顕微鏡を利用して、コントロール細胞とCCCP処理細胞の両方の画像を取得しました。12枚の共焦点画像で解析を行い、条件ごとに約60個の細胞を使用しました。次に、各画像におけるミトコンドリアの形態学的状態を決定し、定量化した。訓練されたモデルから得られたセグメンテーションマスクは、この実験のために個々のミトコンドリアのトポロジーの分析を可能にするためにスケルトン化されました。個々のミトコンドリアの枝長を分類のパラメータとして使用した。個々のミトコンドリアは、次の規則によって形態学的クラスに分類されました。具体的には、長さが1,500 nm未満のミトコンドリア骨格を ドットと見なし、長いミトコンドリアをさらに ネットワークまたはロッドに分類しました。2 つ以上の分岐が交差するジャンクションが少なくとも 1 つある場合、これは ネットワークとして定義されました。そうでなければ、ミトコンドリアは 棒として分類されました。形態クラスで標識されたミトコンドリア骨格を有する画像の例を 図3に示す。
図4Aのミトコンドリア形態分類は、CCCPを2時間適用したときに有意な変化を検出できることを示しています。これは、CCCP処理細胞のドットの増加によって最も明確に実証されています。
図4Bの平均分岐長は、形態の検出可能で有意な変化を説明するための別の手段である。ロッドとネットワークの両方が、予想通り、細胞をCCCPで処理した場合、対照と比較して有意に減少しました。ドットの平均枝長の大幅な増加も、CCCPにさらされたときにミトコンドリアが受ける腫れを考えると予想されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig01.jpg"> 図1:蛍光顕微鏡画像のシミュレーションのためのパイプライン。 パイプラインには、(i)3Dジオメトリ生成、(ii)エミッタおよびフォトキネティクスエミュレーション、(iii)3D PSF畳み込み、(iv)ノイズ追加、および(v)二値化が含まれます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig02.jpg"> 図2:機械学習によるミトコンドリア形態解析の手順 。 (1)セグメント化する画像は、最初にセグメンテーションモデルで許容できるサイズにトリミングされます。(2)深層学習ベースのセグメンテーションが画像作物に適用されます。(3)セグメント化されたアウトプット作物は、元のサイズに縫い付けられます。(4)モンタージュセグメンテーションはスケルトン化されています。(6)スケルトン化からのトポロジーに基づいて形態素解析を行う。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig03.jpg"> 図3:顕微鏡画像のセグメンテーション出力にオーバーレイされたミトコンドリア骨格 。 (A)セグメンテーション出力。(B) 直線スケルトン(分岐の始点と終点の間のユークリッド距離)がセグメンテーション出力の上にオーバーレイされます。骨格の色分けはミトコンドリアのクラスを表しています。ネットワークは赤、ロッドは緑、ドットの色は紫です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig04.jpg"> 図4:ミトコンドリア形態の解析。 (A)ミトコンドリアの全長に基づくさまざまな形態学的カテゴリーの相対的な割合の概要。(B)実験条件間および形態学的カテゴリー間の平均ミトコンドリア分岐長の比較。x軸は形態分類を表示し、y軸はミトコンドリアの平均分岐長をナノメートル(nm)で表示します。p値の形式での統計的有意性は、* p &lt; 0.05、** p &lt; 0.01、*** p &lt; 0.001、および **** p &lt; 0.0001として 示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64880/64880fig05v2.jpg"> 図5:セグメンテーションの失敗事例 高密度のミトコンドリアは、セグメンテーションモデルにとって困難なシナリオです。色付きの骨格は、画像で検出された最長の単一ミトコンドリアを示しています。長さ測定を行うことで、これらのシナリオを検出し、形態演算子Erode(検出された骨格をスリムにする)を使用してセグメンテーション結果を改善するために取り組むことができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64880/64880fig05laregv2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この記事では、固定細胞の蛍光顕微鏡画像でミトコンドリアの形態を分析するために、シミュレーション教師あり機械学習を使用する方法について説明します。

The quantitative analysis of subcellular organelles such as mitochondria in cell fluorescence microscopy images is a demanding task because of the ...

固定細胞の蛍光顕微鏡画像中のミトコンドリアを解析するためのシミュレーション教師あり機械学習ツールの使用を実証します。顕微鏡画像中のミトコンドリアをセグメント化する現在の方法には、Osteまたは手動セグメンテーションなどの自動閾値ベースの方法が含まれます。閾値ベースの手法は、信号対バックグラウンド比が低い場合、パフォーマンスが低下します。通常、形態素解析用の画像には多数のミトコンドリアが含まれているため、手作業によるセグメンテーションは面倒です。教師ありディープラーニング手法は、高精度でセグメンテーションを実行しますが、トレーニングには多数の入力グラウンドトゥルースペアデータが必要です。このアプローチでは、物理ベースのシミュレータを使用して顕微鏡画像のペアと、その2Dグラウンドトゥルース形状マスクを生成するため、手動で注釈を付ける必要がありません。次に、シミュレートされた画像でトレーニングされたモデルを使用して、実際の顕微鏡画像でミトコンドリアをセグメント化します。ディープラーニングベースのセグメンテーションツールを使用して、このタスクを高精度で自動化でき、トレーニングに注釈付きのグラウンドトゥルースデータセットを必要としません。シミュレーションは、形状生成にパラメトリックカーブを使用したジオメトリ生成から始まります。エミッタは均一に分布し、密度が実験値と一致するように、生成された形状の表面にランダムに配置されます。顕微鏡の3D PSFは、ギブソン-ラニモデルを使用して計算されます。シミュレーション画像と実験画像の間でフォトリアリズムを実現するために、ダークノイズとショットノイズの両方をエミュレートします。物理グラウンドトゥルースは、バイナリマップの形で生成されます。共焦点顕微鏡で画像化した固定心筋芽細胞のミトコンドリア形態に対するCCCP治療の効果を評価します。細胞培養。細胞を播種するための準備をし、滅菌層流フード内で操作し、各実験条件のカバースリップを12ウェルプレートのウェルに配置する。適切な量を各ウェルに分注する前に、遠沈管の内容物を数回上下にピペッティングして、希釈した細胞懸濁液が適切に混合されていることを確認します。実験手順。次に、12ウェルプレートのウェルから細胞培養培地を吸引し、新鮮な予熱培地をコントロールウェルにすばやく適用し、予熱した培地を10マイクロモルCCCP溶液とともに試験条件ウェルに塗布します。摂氏37度のセルインキュベーターで2時間インキュベートします。ウェルから細胞培養培地を吸引し、予熱した固定液を塗布します。カバースリップへの細胞の染色と取り付け。準備したスライドガラスに10マイクロリットルの封入剤を追加して、カバースリップを取り付けます。ピンセットを使用して12ウェルプレートからカバースリップを拾い上げ、カバースリップの端と背面に軽く触れて、カバースリップから水分を軽くたたきます。待機中のマウントメディアの液滴にカバースリップをそっと下げます。顕微鏡とイメージング。接眼レンズを使用して、サンプルに焦点を合わせるようにZレベルを手動で調整します。ソフトウェア内の取得したタブに切り替えます。スマートセットアップを使用して、イメージングに使用する蛍光チャンネルを選択します。カバースリップの中央に配列し、合計12の位置を画像化します。カバースリップの中央にRAを配置します。自動化された方法で複数の場所を画像化することができます。シミュレートされたトレーニング データを生成します。コードをダウンロードし、内容を解凍します。指示と readme に従って環境をセットアップします。という名前のフォルダに移動します src「コピーを作成するか、フォルダ2を使用します。ミトコンドリアシミュレーションエアリー」と改名。このフォルダーには、トレーニング データのシミュレーションに関連するすべてのファイルが含まれています。シミュレーションに設定するパラメータは 3 セットあります。まず、バッチ設定ファイルで、シミュレータのミトコンドリア数、直径範囲、Z軸範囲、蛍光色素密度のパラメータを設定します。次に、データセットの開口数、倍率、最小波長の光学パラメータをファイル顕微鏡で設定し、PSFモード。py"ファイアgenerate_batch_parallelの画素サイズと発光波長に希望の値を設定します。py"出力画像のサイズ、各画像のタイル数、ファイルgenerate_batch_parallel内の合計画像数など、出力データセットに関する3番目のパラメーターセットを設定します。py"ファイルgenerate_batch_parallelを実行します。py"をクリックしてシミュレーションを開始します。最終的なサイズのイメージを取得するには、5 という名前のフォルダーのコピーを作成します。データ準備とトレーニング/データ準備」に移動し、そこに移動します。バッチ数とバッチあたりの画像数、ファイルData_generatorに追加するノイズの範囲のパラメータを設定します。py"ファイルData_generatorを実行します。py"モンタージュ画像を作成します。image"とセグメント"という名前のフォルダをデータトレイン/トレーニング"フォルダにコピーします。ディープラーニングベースのセグメンテーション。新しい顕微鏡画像設定のセグメンテーションモデルをトレーニングするには、train"という名前のフォルダーに移動し、train_unetという名前のファイル内で、バッハサイズ、セグメンテーションのバックボーンモデル、エポック数、およびトレーニングの学習率のパラメーターを設定します。py"ファイルtrain_unetを実行します。py"トレーニングを開始します。トレーニングプロセスでは、シミュレートされた検証セットのセグメンテーションモデルを評価するためのメトリックが表示されます。トレーニングが完了すると、モデルはbest_modelとして保存されます。h5 "という名前のフォルダで train「顕微鏡画像でモデルをテストするには、画像を列車モデルが望むサイズに分割する必要があります。このためには、6という名前のフォルダに移動します。テストデータを準備します」とデータのPNG形式のファイルをフォルダPNGにコピーします」そしてファイルsplit_1024_256を実行します。py"これにより、データフォルダ内の画像の256 x 256サイズのトリミングが作成されます。画像の切り抜きをセグメント化するには、7という名前のフォルダーに移動します。セグメンテーションをテストし、segmentという名前のファイルを実行します。py"を使用する保存済みモデルの名前を設定した後。セグメント化された画像は出力フォルダーに保存されます。形態素解析。make_montageという名前のファイルを配置します。py"を7という名前のフォルダに入れます。セグメンテーションをテストし、ファイルを実行して、セグメント化された出力を画像の元のサイズに戻します。9 という名前の新しいフォルダーを作成します。形態素解析」をソースフォルダに移動し、そのフォルダに移動します。コマンドを使用してskanライブラリとseabornライブラリをインストールしますpip seaborn skanをインストール「セグメンテーションマスクは、skanという名前のライブラリを使用してスケルトン化されます」個々のミトコンドリアのトポロジーを分析できるようにします。ファイルをフォルダー 9 に配置します。形態素解析「実験の異なるグループの画像をフォルダ7内の異なるフォルダに配置する。テストセグメンテーション「ファイルを実行して、分析用のプロットを作成します。業績。実行する定量分析は、研究の質問または仮説によって異なります。実験では、ミトコンドリアの3つの異なる形態、すなわちドット「小さなミトコンドリアビット」、ロッド「ミトコンドリアのような繊維状または糸状、およびマルチブランチネットワーク」に興味を持ち、形態を特定するために、まずセグメンテーション出力をスケルトン化し、異なるクラスの分岐リンクを分析しました。ガラクトース適合細胞の2群、対照群とCCCP処理群についての解析結果を示す。CCCPにさらされたときにミトコンドリアが受ける腫れを考えると、ドットの平均分岐長の大幅な増加が見られます。細胞がCCCPで処理された場合、桿体とネットワーククラスの両方の個々の長さにおけるミトコンドリアの割合は、対照と比較して有意に減少し、したがって私たちの仮説を検証します。私たちの方法にとって挑戦的なシナリオは、画像が密集したミトコンドリアを持っている場合です。ピンク色は、画像で検出された最長の単一ミトコンドリアを示しており、これはセグメンテーション結果の誤差の増加が原因です。これらの失敗例は、ミトコンドリアの長さの制御と形態学的演算子を使用して検出できます。私たちのアプリケーションは、ミトコンドリアの形態の解析方法の一例ですが、そのような解析とそれに関する研究の質問は、マイトファジーおよび関連する生物学的実験のさまざまな側面に対して定式化できると考えています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

哺乳類の脳組織からのミトコンドリアの可視化と分析は困難な作業です。ここでは、シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBFSEM)による3次元(3D)再構成解析を使用して、この重要なエネルギー生成オルガネラの形態学的および体積的解析に関する洞察を得る方法について説明します。...

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。...

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。...

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ミトコンドリアネットワークは非常に複雑で、解析が非常に困難です。新しいMATLABツールは、タイムラプス画像でライブ共焦点画像化されたミトコンドリアを解析しますが、出力量が大きく、個別の手動操作が必要です。この問題に対処するために、ルーチン最適化が開発され、迅速なファイル分析が可能になりました。...

アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

本研究では、マウスの脳組織 をin...

パーキンソン病モデルにおけるミトコンドリア形態の組織学的検討

このプロトコルは刺激された放出枯渇(STED)の顕微鏡検査を使用してミトコンドリアの微細構造の視覚化および分析のための培養されたSH-SY5Yのセルそして第一次ラットの海馬ニューロンの伝播、微分および汚損のためのワークフローを示す。...

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このプロトコルは、老化中の C.エレガンスの...

老化中の C.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化

この研究では、ステップバイステップのプロトコルを説明し、サンプル調製、画像取得、データ解析など、生細胞のミトコンドリアの形態学的特性を決定するための重要な詳細を強調します。この方法は、さまざまな条件を研究するためにミトコンドリアの形態を調べるために一般的に使用されます。...

共焦点顕微鏡法を用いた生細胞のミトコンドリア形態の決定

ここでは、ミトコンドリアの分裂と融合活動の経時的な3次元変化の定量化に役立つImageJプラグインであるミトコンドリアイベントローカライザー(MEL)について説明します。また、ImageJでの分析前の顕微鏡写真のクリーンアップに役立つ画像処理パイプラインについても説明します。...

動的および3次元蛍光顕微鏡写真によるミトコンドリア形態の変化の理解

脳オルガノイドは、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード (MELAS)...

脳オルガノイドを用いたミトコンドリア疾患のモデル化:ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに焦点を当てる

学ぶシミュレーション教師あり機械学習によるミトコンドリア形態解析法。固定細胞の蛍光顕微鏡画像から高精度セグメンテーションを自動化し、CCCP処理効果の定量的評価が可能となる革新的な計算生物学アプローチです。

シミュレーション教師あり学習によるミトコンドリア形態の解析

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