免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)
February 24th, 2023
本プロトコルは、患者由来卵巣癌オルガノイドにおけるDNA損傷修復タンパク質を評価するための方法を記載する。ここには、包括的なめっきおよび染色方法、および詳細で客観的な定量手順が含まれています。
DNA損傷応答の研究は、新しい標的療法における卵巣癌の潜在的なバイオマーカーの病態生理学を理解するために必要です。この技術により、サンプルを無傷のままにすることができ、抗原の作用位置での抗原の検査が可能になります。このプロトコルは迅速であり、免疫蛍光に適した任意の抗原に適合させることができます。
この方法は、化学療法およびPARP阻害剤耐性に関与する卵巣癌およびDNA損傷修復プロセスへの洞察を提供します。これらの方法は、3D培養およびオルガノイドの使用を含む他の研究分野に適用することができる。まず、照射およびインキュベートしたオルガノイドから培地を吸引し、3Dマトリックスを乱すことなく吸引します。
その後、300マイクロリットルのPBSで洗浄します。オルガノイドを300マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドに10分間固定します。固定後、オルガノイドを300マイクロリットルの染色バッファーで洗浄し、シェーカーに5分間置きます。
次いで、300マイクロリットルの透過処理バッファーを穏やかに添加してオルガノイドを透過処理する。20分間のインキュベーション後、バッファーを除去し、300マイクロリットルの染色バッファーで洗浄します。オルガノイドをシェーカーに5分間置きます。
次に、300マイクロリットルの染色バッファーを加えて、透過処理工程をブロックします。シェーカーに30分間置き、ピペットを使用して染色バッファーを吸引します。次に、染色バッファーで希釈した300マイクロリットルの一次抗体を追加します。
摂氏4度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、一次抗体溶液を除去します。300マイクロリットルの染色バッファーで、シェーカー上でそれぞれ5分間3回洗浄します。
染色バッファーで希釈した二次抗体溶液300マイクロリットルを加え、暗所で1時間インキュベートします。1時間後、二次抗体溶液を吸引し、300マイクロリットルの希釈DAPIを加える。シェーカーに5分間置きます。
300マイクロリットルの染色バッファーで、シェーカー上でそれぞれ5分間3回洗浄します。染色バッファーを除去し、チャンバースライドに含まれている除去キットを使用してチャンバーを取り外します。P200ピペットチップのチップを切断し、これを使用して、オルガノイドタブを含む各ウェルを覆う封入剤を追加します。
気泡を避けながら、試験片の上にカバースリップを置きます。透明なマニキュアを取り、カバーガラスの側面にペイントしてスライドをシールします。1時間固めてから、摂氏20度に置きます。
共焦点顕微鏡で63倍の対物レンズと液浸オイルを使用して画像を取得します。このプロトコルを用いて、患者由来の卵巣癌オルガノイドを照射前後のDNA損傷修復タンパク質について染色し、DNA損傷のマーカーであるγH2AXや相同組換え修復のマーカーであるRAD51などのバイオマーカーを評価しました。複製ストレスのマーカーであるRPA、非相同結合のマーカーである53BP1、およびGS2期の細胞周期マーカーであるGemininもこの手法を使用して評価されました。
BMEタブは解重合する傾向があるため、固定および吸引後に細心の注意を払うことが重要です。抗原を分析してオルガノイドの損傷とDNA損傷応答を開始する能力を決定することは、化学療法耐性の評価に役立つ可能性があります。
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概要
このプロトコルは、患者由来の卵巣がんオルガノイドにおけるDNA損傷修復タンパク質を評価する方法を概説しています。包括的なプレート形成および染色技術と客観的な定量化手順が含まれています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 卵巣がん研究
- DNA損傷応答
- オルガノイド技術
背景
- 卵巣がん病態生理学にとってDNA損傷応答の理解は重要です。
- この研究は標的療法のための潜在的バイオマーカーを探ります。
- このプロトコルは機能的な位置での抗原の検査を可能にします。
- 免疫蛍光に適した様々な抗原に適応可能です。
研究の目的
- 卵巣がんにおけるDNA損傷修復プロセスを調査すること。
- 化学療法およびPARP阻害剤耐性に関する洞察を提供すること。
- 3D培養とオルガノイドを含む他の研究に適用可能な方法を開発すること。
使用される方法
- 3Dマトリックスを破壊することなく、照射および培養されたオルガノイドから培養液を吸引すること。
- 抗原検査に免疫蛍光を利用すること。
- 様々な抗原に対して迅速で適応可能なプロトコルを実装すること。
- 分析に客観的な定量化手順を採用すること。
主要な結果
- 卵巣がんにおけるDNA損傷修復メカニズムへの洞察。
- 化学療法に対する耐性メカニズムの同定。
- 異なる抗原に対するプロトコルの適応性の実証。
- 他の研究分野への方法の潜在的適用。
結論
- このプロトコルは卵巣がんにおけるDNA損傷応答を研究するための貴重なツールを提供します。
- 治療耐性メカニズムの理解を深めます。
- オルガノイドを含む様々な研究コンテキストに方法を広く適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Visualizing DNA damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids using immunofluorescence enables high-content, spatially resolved biomarker analysis in disease-relevant 3D models. This approach enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for therapeutic strategies addressing chemoresistance. Integrating these assays at the discovery and preclinical interface supports risk-adjusted portfolio decisions in oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of DNA repair pathways and functional target validation in clinically relevant 3D tumor models.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing protein recruitment and colocalization after genotoxic stress.
- Facilitates identification of predictive biomarkers for chemotherapeutic and PARP inhibitor resistance.
Screening & Assay Development
- Establishes validated immunofluorescence workflows for quantitative protein foci analysis in organoids.
- Delivers reproducible, high-sensitivity readouts for downstream screening of DNA repair modulators.
- Enables standardization of imaging and automated foci quantification for scalable assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomarker evaluation with disease-relevant 3D models, improving translational continuity.
- Supports preclinical assessment of drug response and resistance mechanisms in patient-derived systems.
- Provides a platform for evaluating temporal and spatial dynamics of DNA repair proteins in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence assay positions within the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational biomarker validation in ovarian cancer research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of DNA repair function and pathway engagement in intact organoids.
- Screening: Provides quantitative, reproducible foci counts for comparative analysis of treatment conditions.
- Analytics: Supports automated image analysis and statistical comparison of protein localization and colocalization.
- Translational Research: Connects in vitro findings to patient-relevant resistance mechanisms and biomarker profiles.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other antigens and 3D disease models for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of resistance.
- Operational Value: Standardizes immunofluorescence workflows for reproducibility and scalability in 3D models.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking biomarker dynamics to therapeutic response.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets and resistance-modifying strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D organoid culture and immunofluorescence imaging.
- Demands access to confocal microscopy and automated image analysis software.
- Necessitates careful handling to preserve organoid integrity during processing.
- Standardization across teams is essential for reproducible quantitative outputs.
- Adaptation to other tumor types or antigens may require protocol optimization.
