重水素(2H)標識法を用いたヒトにおけるin vivo脂肪組織動態の測定

サマリー

ここで提示するのは、重水素(^2H)標識法を使用してヒトのin vivo脂肪組織動態を測定するためのプロトコルです。

要約

白色脂肪組織は、全身のエネルギー恒常性を維持するために必要な高度に可塑性のある器官です。脂肪組織の質量と脂肪の質量または分布の変化は、脂肪細胞とトリアシルグリセロールの合成と分解(すなわち、ターンオーバー)の変化によって調節されます。脂肪形成が肥満および関連疾患の病因に関与しているため、皮下脂肪組織の拡張(すなわち、肥大と過形成)および代謝回転の方法と大きさが代謝の健康に影響を与える可能性があることを示唆する証拠があります。脂肪代謝回転が人間の健康に果たす潜在的な役割にもかかわらず、脂肪細胞の生体内動態に関する知識は不足しています。これは、部分的には、脂肪組織中の細胞の代謝回転速度が遅いことと、in vivoでそれらの代謝前駆体を直接標識することの実際的な複雑さによるものです。ここでは、重水素(^2H)標識水の消費を通じて、ヒトの生体内脂肪動態と代謝回転率を測定する方法について説明します。プレ脂肪細胞および脂肪細胞のDNAのデオキシリボヌクレオチド部分に^2Hを取り込むことで、細胞の形成と死(脂肪代謝回転)を正確に測定できます。全体として、これはin vivo脂肪動態を測定するための革新的なアプローチであり、他のin vitro評価とは大きく異なります。

概要

肥満は、過剰な白色脂肪組織(AT)を特徴とする疾患であり、II型糖尿病および心血管疾患の発症の重大な危険因子です¹。白色ATは、トリアシルグリセロール(TG)の形でエネルギーを蓄える高度に可塑性な器官であり、代謝恒常性2に^{不可欠です。}白色ATは、成人期に拡大、縮小、およびリモデリングする能力を保持し^3、AT質量は、脂肪細胞体積の動的変化(TG合成および分解による )、前脂肪細胞の増殖および分化 による 継続的な脂肪細胞形成(すなわち、過形成または脂肪形成)、および脂肪細胞死⁴によって決定されます。

証拠は、皮下AT代謝回転(例えば、脂肪細胞の形成と死亡)と心血管^{代謝の健康と}の間に重要な関連性があることを示唆しており5,6,7,8、そして肥満関連障害の病因における脂肪生成の役割は議論の余地があります^....

プロトコル

ペニントン生物医学研究センターの治験審査委員会 (IRB) は、すべての手順を承認し (#10039-PBRC)、すべての被験者は書面によるインフォームド コンセントを提供しました。

1. 8週間 ^2H₂O-ラベリング期間

1. 滅菌プラスチック容器に70%または99.9%の重水素標識水(²H₂O)のアリコートを投与します。
2. 参加者に、99.9% 濃縮 ²H₂O の 35 mL 用量または 70% 濃縮 ²H₂O の 40 mL 用量を 1 週 1 日 3 回 1 回 (プライミング期間) に飲み、2 週目から 8 週目に 1 日 35 mL または 50 mL を 1 日 2 回飲むように指示します。
   注:一過性のめまいまたはめまいは、 ²H₂O摂取の唯一の既知の悪影響であり、内耳の毛包によって知覚されるバルク水流の急激な変化に関連しています。.したがって、一過性めまいやめまいのまれな発生を避けるために、参加者に少なくとも ~2 時間間隔で用量を服用するように指示します¹⁵

結果

^2H₂O標識プロトコル(セクション1)は、図2に示すように、8週間の標識期間¹⁰の期間中、体水中のプラトーに近い^2H濃縮を1.0%〜2.5%の範囲に維持する。以前の研究では、セクション2〜8で詳述されているように、脂肪細胞のDNAに²Hを組み込むことにより脂肪動態を評価するために²H₂O標識プロトコルを利用し、in vivo脂肪生成(前脂肪細胞増殖と脂肪細胞形成の両方)は、肥満の女性の皮下腹部(scABD)デポーと比較して皮下大腿骨(scFEM)で高かったと報告されました(図5)¹³.追加のデータは、皮下ATデポにおける前脂肪細胞および脂肪細胞形成率が、体脂肪全体の割合と正の関連があることを示しました(図6

ディスカッション

in vitro評価はATの自然環境を網羅していないため、白色AT代謝回転のダイナミクスと肥満および関連する代謝性疾患におけるその役割に関する新しい知識を提供するためには、in vivo評価が必要です。脂肪動態を評価するためのレトロスペクティブ放射性炭素年代測定法の使用は有益であるが ^7,25、このアプローチは、前向き介入研究中の動的変化を捉えるのには適していない。²H標識法は、ヒトにおけるin vivo脂肪細胞の形成と代謝回転の生理学的測定を提供することが検証されており、他の評価とは大きく異なります。近年、このアプローチは、げっ歯類²⁶とヒト13,27,28の両方における新規の脂肪動態を評価し.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-メチルイミダゾール	ミリポアシグマ	336092
2H2O	Sigma Aldrich
無水酢酸	Aldridge	539996
ACK Lysing Buffer (赤血球溶解バッファー)	Quality Biological Inc (VWR)	10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS	Agilent
Anti-human CD31 (PECAM-1) Biotin	Invitrogen	13-0319-82
Anti-human CD34 Biotin	Invitrogen	13-0349-82
Anti-human CD45	BioLegend	304004
Antibiotic Antimycotic Solution	MilliporeSigma	A5955
Collagenase type 1	Worthington Biochemical株式会社	LS004196
デオキシリボース(2-デオキシd-リボース)	ミリポアSigma	31170
酸化重水素	ミリポアSigma	756822
DB-225カラム(30m、0.25mm、0.25um)	J&W Scientific	122-2232
ジクロロメタン (DCM)	MilliporeSigma	34856
DNA standard (仔牛胸腺 DNA)	MilliporeSigma	D4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (DNA extraction kit)	Qiagen	69504
Easy Sep Human Biotin kit	Stem Cell Technologies	17663
EasySep Human CD14 Positive Selectionカクテル	幹細胞技術	18058C
酢酸エチル	フィッシャー	EX0241-1
ファルコン 5 mL 丸底ポリスチレン試験管	VWR	60819-295
Ficoll-Paque Plus	MilliporeSigma	GE17-1440-02
GC バイアル (2 mL)	フィッシャー	C-4011-1W
GC バイアル インサート	フィッシャー	C-4011-631;C-4012-530
氷酢酸	フィッシャー	AC14893-0010
ガラス管(加水分解用)	フィッシャー	14-959-35AA
HEPES バッファー	サーモフィッシャー	15630080
ハイクロン 水、分子生物学グレード	トーマス・サイエンティフィ	SH30538.02
MEM アルファ	フィッシャー・サイエンティフィック	32561-037
PFBHA(o-(2,3,4,5,6)-ペナットフルオロベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩)	ミリポアシグ	マ194484
pH指示薬ストリップフィ	ッシャー	987618
ホスファターゼ酸	カルバイオケム(VWR)	80602-592
S1ヌクレアーゼ(麹菌由来)	ミリポアシグマ	N5661
硫酸ナトリウム	ミリポアシグマ	23913

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