肺由来サンプルからの微小血管および大血管内皮細胞の単離および精製(英語)

このプロトコルは、組織サンプルまたは非常に小さな血管片からの内皮細胞の単離に関連しています。この技術の主な利点は、どの研究室でも再現でき、非常に小さなサンプルからでも良好な純度の内皮細胞を得ることができることです。収集したサンプルを、塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含まないPBS、またはPBSマイナスマイナスを含む50ミリリットルのチューブで洗浄することにより、肺実質サンプルの準備を開始します。

サンプルを滅菌ペトリ皿に移し、外科用ハサミを使用して約3〜4ミリメートルの小さな断片に手動で切り刻みます。動脈セグメントについては、収集したサンプルをPBSマイナスマイナスを含む50ミリリットルのチューブで洗浄し、刻まずに滅菌ペトリ皿に移します。残留血液の大部分を除去するには、さいの目に切った肺実質または肺動脈セグメントにPBSマイナスマイナスの2回の洗浄を与えます。

次に、サンプルを15ミリリットルのチューブに入れ、5ミリリットルのタイプIIコラゲナーゼとともに摂氏37度と5%の二酸化炭素で10分間インキュベートします。大きな破片を取り除くには、滅菌済みの1ミリメートルメッシュサイズのストレーナーを50ミリリットルの収集チューブの上部に置き、15ミリリットルのチューブの内容物全体をストレーナーに注ぎます。次に、消化した組織をスパチュラで優しくマッサージしてから、収集チューブが満たされるまでPBSマイナスマイナスでサンプルをすすぎます。

非血管内皮細胞を除去するには、70マイクロメートルのメッシュサイズの細胞ストレーナーを使用して、消化された細胞から収集された流出を新鮮な50ミリリットルのチューブでろ過します。次に、40マイクロメートルのメッシュサイズのセルストレーナーを使用して、チューブ1とラベル付けされた新しい50ミリリットルのチューブに流出物を収集します。サンプルを室温で30 Gで5分間遠心分離し、細胞クラスターを沈降させます。

滅菌ピペットを使用して、上清をチューブ2とラベル付けされた新しい50ミリリットルのチューブに移します。ペレットをチューブ1に懸濁し、PBSマイナスマイナスで最大50ミリリットルまでチューブを満たします。同様に、チューブ2を最大50ミリリットルにPBSマイナスで充填します。

完了したら、サンプルを300 Gで室温で5分間遠心分離します。ペレットを2ミリリットルの増殖培地で懸濁し、事前にコードされた6ウェルプレートの2つの別々のウェルに懸濁液を播種します。平滑筋細胞またはSMCおよび線維芽細胞を含む処理された細胞凝集体の一部が長繊維に結合していることが観察された。

また、SMCは非血球一重項の大部分を占めていました。直径が10〜20マイクロメートルを超えない細胞の小さなコンパクトなクラスターには、間質組織の断片に起因する要素がありませんでした。約70%純粋なヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)単一細胞が得られた。

純粋なHLMVEC調製物を得る一方で、選別された細胞は特徴的な内皮様形状を呈した。焦点顕微鏡検査では、脂肪の精製細胞のほぼ100%が内皮細胞抗原、すなわちCD31およびより特異的なフォンビルブランド因子に対して陽性に染色されたことが示されました。これらの細胞をマトリゲルに装着すると、管状構造とHUVECが生成され、内皮表現型が確認されました。

酵素消化中のインキュベーション時間が短いため、コラゲナーゼを予熱することが重要です。そしてもう一つのポイントは、細胞クラスターの沈降中に、パレット内の細胞凝集体に触れることなく上清を穏やかに除去することが重要であるということです。この手順は遠心分離とろ過の使用に基づいているため、サイズやクラスタリングなどの特性に基づいて他の細胞タイプを分離するための新しい洞察を提供する可能性があります。