Name: オルガノイド共培養を用いた食道線維芽細胞の機能特性評価と可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶオルガノイドと線維芽細胞の共培養法を用いて、食道前駆細胞ニッチの機能特性を評価する手法。全体マウントイメージングで細胞間相互作用を可視化し、がん関連線維芽細胞の研究にも応用可能です。

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この研究はERC StG TroyCAN(851241)によってサポートされました。E.E.はCancerfondenのポスドクアソシエイトです。M.G.はラグナル・ソデルバーグ・フェローであり、キャンサーフォンデンのジュニア研究者です。バイオメディカムフローサイトメトリーコア施設、バイオメディカムイメージングコア(BIC)、比較医学バイオメディカム(KMB)動物施設など、カロリンスカ研究所のコア施設からの技術支援に感謝しています。プロトコルを注意深く読み、コメントしてくれたGenanderラボのメンバーに感謝します。

<ol><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Lohmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+esophageal+organoid+culture+method+and+organoid-based+model+of+esophageal+squamous+cell+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia.</a> iScience. 24 (12), 103440(2021).</li>
<li>DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+in+the+mouse+esophagus+implicates+the+presence+of+a+nonquiescent+epithelial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population.</a> Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).</li>
<li>Kasagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esophageal+organoid+system+reveals+functional+interplay+between+notch+and+cytokines+in+reactive+epithelial+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%3A+Origins%2C+definitions%2C+and+functions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease.</a> Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesenchymal+cell+populations+generate+the+essential+intestinal+BMP+signaling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient.</a> Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).</li>
<li>Cordero-Espinoza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+contacts+between+periportal+mesenchyme+and+ductal+epithelium+act+as+a+rheostat+for+liver+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation.</a> Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).</li>
<li>Pastula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+gastrointestinal+organoid+culture+in+combination+with+nerves+or+fibroblasts%3A+a+method+to+characterize+the+gastrointestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche.</a> Stem Cells International. 2016, 3710836(2016).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>McGinn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomechanical+switch+regulates+the+transition+towards+homeostasis+in+oesophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium.</a> Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+stem+cells+of+the+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The development and stem cells of the esophagus.</a> Development. 148 (6), (2021).</li>
<li>Ohlund, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+inflammatory+fibroblasts+and+myofibroblasts+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).</li>
<li>Pentinmikko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notum+produced+by+Paneth+cells+attenuates+regeneration+of+aged+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium.</a> Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).</li>
<li>Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+serially+passaged+fibroblasts+on+dermal+and+epidermal+morphogenesis+in+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents.</a> Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).</li>
<li>Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+maintaining+primary+murine+cardiac+fibroblasts+in+two-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12889(2019).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここで提示されたプロトコルは、機能的な食道上皮-線維芽細胞相互作用を調査するための in vitro モデルを確立します。
上皮層は間質から分離されており、上皮コンパートメントと間質コンパートメントの両方に対して最適化された解離プロトコルを可能にします。上皮解離プロトコルの最適化にもかかわらず、組織凝集塊は明らかなままです。15分ごとに激しく上下にピペッティングすると、塊の数とサイズが大幅に減少します。他のプロトコルは、トリプシンを使用して上皮層をさらに解離させる5、6。ここで、トリプシンの使用、または解離時間をさらに増加させることは、上皮細胞の生存率およびオルガノイド形成効率の低下をもたらす傾向があるので、推奨されない。上皮とは対照的に、間質は容易に解離し、解離溶液中で30分は~90%の線維芽細胞生存率を有する単一細胞懸濁液をもたらす(図1E)。プロトコルで上皮-ストーム分離ステップを除外すると、解離時間が大幅に増加し、線維芽細胞の生存率が低下し、上皮細胞の収量が低下します。さらに、間質から上皮を分離することで、共培養のセットアップ時に、各集団の細胞数を決定し、異なるマウス系統の上皮細胞と線維芽細胞を混合する機会が得られます。
オルガノイド増殖に対する線維芽細胞機能の研究は、幹細胞生物学において一般的に使用される方法である9,10,11,15,16。確立された共培養培地は、10%ウシ胎児血清(FCS)9,15を添加したDMEMまたは成長因子低減培地10,16のいずれかである。このプロトコルでは、成長因子還元培地を使用して、線維芽細胞が大部分静止しているin vivo幹細胞ニッチの状態を模倣します。FCSは、共培養において線維芽細胞の活性化および増殖をもたらす成長因子に富む血清であり、おそらくin vivo状態とは異なる線維芽細胞状態に対応する。FCSを除外し、成長因子を低減することにより、培地単独(ER低)がオルガノイド増殖を支持せず、線維芽細胞の増殖を刺激しないようにすることで、オルガノイド増殖に対する線維芽細胞の影響を単離することができる。この培地では、NOGGINが除去され、RSPOが最小限に抑えられます(10%RPSO)。NOGGINとRSPOの両方が食道オルガノイドの成長に不可欠であることが実証されています6。EGFは、それ自体ではオルガノイドの増殖をサポートしないため、共培養培地に保持されました。しかし、線維芽細胞は、EGF還元培地(E低R低;図2B、D)。
オルガノイド共培養は、トリプシン処理中に線維芽細胞が失われるため、継代によって持続することはできません。ただし、食道オルガノイドは維持、拡張し、単培養としてさらなる実験に使用できるため、オルガノイド継代がプロトコルに含まれていました。単培養からの継代オルガノイドは、新たに単離された線維芽細胞との共培養をセットアップするために使用できます。初代細胞を使用することの欠点は、複数のオルガノイド共培養をセットアップするために必要なマウスの数です。線維芽細胞の小さな亜集団に焦点を当てると、得られる共培養の数は限られています。他のプロトコルでは、線維芽細胞は、オルガノイド共培養をセットアップするために使用する前に、まず培養中で増殖される10。しかしながら、線維芽細胞は継代中に形態および同一性を変化させることを、一次皮膚および心臓線維芽細胞を用いることによって示される17、18。食道線維芽細胞の従来の2D継代は、形態と表現型の両方の変化をもたらし、線維芽細胞の in vitro 濃縮は、内因性幹細胞ニッチの表現コピーを目的とした共培養には適していないことを示しています。
ホールマウント染色は、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用を維持および視覚化するためのツールを提供します。すべてのオルガノイドが線維芽細胞に直接付着しているわけではありませんが、ほとんどのオルガノイドは線維芽細胞と接触していることに注意してください( 図2Cを参照)。上皮-線維芽細胞の相互作用を維持するためには、オルガノイドの取り扱いに注意し、激しいピペッティング、ボルテックス、高速回転を避けることが重要です。最適な固定は、3D組織構造を維持し、内因性蛍光を維持するために重要です。H2BeGFPシグナルを保持するには30分の固定で十分であり、このプロトコルで使用される抗体に最適ですが、これは使用する蛍光色素と抗体によって異なる場合があります。オルガノイドをクリアすると、光の散乱が減少し、3D構造全体の視覚化が大幅に向上します。オルガノイドが小さいため、クリアリングは簡単かつ迅速です。ただし、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してオルガノイド全体をイメージングするには、複数のZスタックを作成する必要があるため、時間がかかる場合があります。スピニングディスクのような共焦点顕微鏡は、イメージング時間を短縮するために使用できます。
全体として、線維芽細胞の存在下で増殖した食道オルガノイドは、食道幹細胞ニッチの側面を理解するための貴重なツールを提供します。さらに、ホールマウントクリアリングは、線維芽細胞とオルガノイド間の相互作用を視覚化するためのアクセス可能な方法を提供します。

オルガノイドは、幹細胞および前駆細胞の特性評価、ならびに幹細胞ニッチの細胞成分に由来するシグナル伝達の手がかりを理解するための3Dインビトロアッセイとして使用されます1,2,3,4。マウス食道オルガノイドは2014年に初めて記載され、いくつかの論文では、食道オルガノイドの維持と通過に必要なR-Spondin(RSPO)、NOGGIN、上皮成長因子(EGF)などの成長因子が特定されており5,6,7、in vivoにも同様のシグナル伝達の手がかりが必要であると主張しています。 前駆細胞の再生。しかしながら、成長因子は一般に非生理学的濃度で添加され、必ずしもin vivoシグナル伝達環境を反映しないオルガノイド増殖条件をもたらす。
線維芽細胞は、多くの幹細胞ニッチにおいて前駆細胞特性を支える不均一な間質細胞集団である8。上皮前駆細胞と線維芽細胞を同じオルガノイド培養に組み合わせることで、外因的に補充された成長因子の濃度を抑えたオルガノイド形成が可能になります。腸管および肝上皮由来のオルガノイド共培養系が記載されているが、食道オルガノイド-線維芽細胞共培養を確立するためのプロトコルは依然として優れている9、10、11。
このプロトコルでは、トランスジェニックPdgfrαH2BeGFPマウス12または古典的な抗体染色を有する野生型マウスのいずれかを使用して、食道からの線維芽細胞に対する2つの蛍光活性化細胞選別(FACS)戦略が概説されている。線維芽細胞の異なる亜集団は、選択した細胞表面マーカーを使用して単離することができ、それによってプロトコルに柔軟性を提供する。さらに、オルガノイド形態を保存する3D蛍光イメージング技術を使用して、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用を特徴付けます。オルガノイドクリアリングは、オルガノイドの光透過深さを増加させる迅速な方法を提供し、オルガノイドと線維芽細胞の結合の視覚化を改善し、オルガノイド構造全体の再現を可能にします。このプロトコルは、食道オルガノイド共培養とホールマウントイメージング戦略を組み合わせて、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用の機能的特性評価を可能にします。

<table><tbody><tr><td>B-27サプリメント(50X)、無血清</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;マトリゲル&nbsp;成長因子低減(GFR)基底膜マトリックス</td>フィ<td>ッシャー</td>科学<td>356231</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド<td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAXサプリメント</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド不使用</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>ノーマルロバ血清</td><td>ジャクソン免疫</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>メルク</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー(Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ケミカルズ、ペプチド、および組換えタンパク質</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI溶液</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー62248</td><td></td></tr>解<tr><td>離溶液:0.25 mg/ml Liberase TM、0.25 mg/ml Dnase in HBSS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>11284932001</tr><tr><td>ホルムアルデヒド、37%、10-15%メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>リベラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nogginマウス</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.47</td><td>SunJin Lab</td> <td>#RC147001</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスEGFタンパク質、CF</td><td>R&D systems</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin-1 マウス</td><td>Peprotech</td><td>315-32</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Plastic &ガラス製品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning滅菌セルストレーナー40um</td><td>VWR</td><td>15360801</td><td></td></tr><tr><td>Corning滅菌セルストレーナー70um</td><td>VWR</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Deckgl&auml;サーモ</td><td>フィッシャー</td><td>Q10143263NR15</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 反応チューブ、1.5 mL、PP</td><td>ザルスタット</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>スナップキャップ ローリテンションマイクロ遠心チューブ 0.6 mL</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3446</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストスライド</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05 mm 4 円形ウェルiSpacer</td><td>SunJin Lab</td> <td>#IS204</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子、生物学チップ</td><td>F.S.T</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Pen</td><td>VectorLaboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ サイドボールチップ 8mm カッティングエッジ</td><td>F.S.T</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal 顕微鏡 Stellaris 5&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡 ZEISS Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjugated Antibodies for FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A</td><td>123608</td><td>123608</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD26 (DPP-4) 抗体</td><td>H194-112</td><td>H194-112</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) 抗体</td><td>147310</td><td>147310</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies for Immunofluorescence</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD104 (&szlig;-integrin 4) Clone: 346-11A</td><td>BioLegend</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acris 抗体 (AbD Serotec)</td><td>BP5009</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin13 クローン: EPR3671</td><td>abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>E-カドヘリン (CD324) クローン: 2.40E+11</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3195</td><td></td></tr><tr><td>ケラチン 5 ポリクローナルニワトリ抗体, 精製 クローン: Poly9059</td><td>BioLegend</td><td>905901</td><td></td></tr><tr><td>p63 クローン: 4a4</td><td>abcam</td><td>ab735</td><td></td></tr><tr><td>リコンビナント抗KLF4 antibod クローン:EPR20753-25</td><td>abcam</td><td>ab214666</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5733</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

オルガノイド共培養を用いた食道線維芽細胞の機能特性評価と可視化

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

上皮幹および前駆細胞は、生涯を通じて上皮バリアの形成および維持に寄与する。ほとんどの幹細胞および前駆細胞集団は、解剖学的に異なる場所に隠れており、ステム性を維持するニッチシグナルとの排他的な相互作用を可能にします。上皮オルガノイド培養の開発は、恒常性および疾患における幹細胞および前駆細胞の役割を理解するための強力なツールを提供するが、ニッチ環境内での相互作用はほとんど存在しないため、幹細胞の挙動に影響を与える因子の同定が妨げられている。線維芽細胞は、上皮幹と前駆細胞の運命を指示する上で重要な役割を果たします。ここでは、食道前駆細胞の再生および分化における線維芽細胞亜集団の描写を可能にする包括的なオルガノイド-線維芽細胞共培養プロトコルが提示される。このプロトコルでは、食道から上皮細胞と線維芽細胞の両方を並行して単離する方法が記載されている。トランスジェニックレポーターまたは野生型マウスのいずれかから食道前駆細胞と線維芽細胞亜集団の両方を単離するための明確な蛍光活性化細胞選別戦略が概説されています。このプロトコルは、特定の線維芽細胞亜集団の単離に対応するために適応できる汎用性の高いアプローチを提供します。食道上皮オルガノイド単培養の確立と継代がこのプロトコルに含まれているため、共培養システムとの直接比較が可能です。さらに、上皮-線維芽細胞相互作用の詳細な画像解析を可能にする3Dクリアリングアプローチについても説明します。まとめると、このプロトコルは、食道幹細胞ニッチ成分 をインビトロで同定および理解するための比較および比較的ハイスループットの方法を記載する。

食道は、上皮、固有層、粘膜下組織、および外筋筋のさまざまな層に分かれています(図1A)。線維芽細胞は、間質と呼ばれる粘膜下層および固有層内に存在します。このプロトコルでは、外筋筋が機械的に除去され(図1B)、間質に存在する線維芽細胞(PdgfrαH2BeGFP+)の喪失にはつながりません(図1C)。解離する前に、上皮は間質から分離され、2つの組織セグメントが生じます(図1B)。2つの層を分離することは、脆弱な間質層と比較して、より堅牢な上皮層の解離時間を増加させる機会を提供する。このようにして、生存可能な上皮前駆細胞ならびに間質線維芽細胞の両方を生じる効率的な単離プロトコルが確立される(図1B)。食道前駆細胞は、その高いINTEGRIN-β4およびE-CADHERIN発現に基づいてソートされます(図1C、D)。
線維芽細胞の亜集団は、別個のマーカーを用いて単離することができる。このプロトコルでは、一般的に使用される線維芽細胞マーカーPDGFRαおよびDPP4(CD26)に基づく線維芽細胞単離のための戦略が提供される。PdgfrαH2BeGFP レポーター発現またはDPP4抗体のいずれかによる単離は、単離された細胞の約50%が線維芽細胞であることを示しています(図1E、F)。さらに、PDGFRα+線維芽細胞の70%はDPP4+であり、大きく重複しているが同一ではない線維芽細胞集団が得られることを示しています。上皮細胞集団と間質細胞集団の両方を単離した後、食道前駆細胞を単独で、またはマトリックスドーム内で線維芽細胞と一緒に培養します。オルガノイド形成に対する線維芽細胞の寄与を研究するために、共培養は成長因子還元培地中で維持される(図1G)。
食道前駆細胞は、EGF、NOGGIN、およびRSPO(ENR)の存在下でオルガノイドを形成します。ノギンを除去し、RSPOの量を減らす(25 ng / μL;ER低)は、オルガノイド形成を防ぐのに十分である(図2A)。興味深いことに、DPP4+またはPDGFRα+線維芽細胞のいずれかをER低培地の食道前駆細胞に加えると、オルガノイド形成能が回復し、両方の線維芽細胞集団に対する支持機能が実証されます(図2A-D)。PdgfrαH2BeGFP導入遺伝子の可視化は、線維芽細胞がオルガノイド形成中に上皮前駆細胞と密接に接触していることを示している(図2A)。6日目の時点で、PdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞は共培養中にまだ豊富に存在しています。線維芽細胞は、ドーム全体、オルガノイドの近くおよび接触(完全な矢印)に存在し、またはオルガノイドに付着している(矢じり;図2D)。
ホールマウント染色は、線維芽細胞とオルガノイドとの相互作用の3D表現を示しています(図3)。クリアリングソリューションを使用せずにマウントプロトコル全体を実行することは可能ですが、オルガノイドの透明度とレーザー透過性が低下します(図3B、z-view)。オルガノイドを取り付ける場合、スペーサーはオルガノイドの形態を維持するのに役立ちます。対照的に、カバーガラスをオルガノイドに直接メッキすると(スペーサーなし)、オルガノイドが平らになり、オルガノイド構造が失われます(図3A、B)。
DPP4+線維芽細胞とPDGFRα+線維芽細胞の両方がオルガノイドに巻き付いていることがわかっています(図3C、ビデオ1、およびビデオ2)。食道オルガノイドの分化は、異なるマーカーを用いて評価することができる。図4は、提供された染色プロトコルが、染色が容易なケラチン(KRT14/13)および染色が困難な転写因子(TRP63/KLF4)に適していることを示しています。共培養プロトコルは、インビボ13,14で実証され、ENR培地で増殖したオルガノイドに見られるように、同様の分化パターンを持つオルガノイドを生成します。KRT14+またはTRP63+の前駆細胞は外層を形成し、KRT13+またはKLF4+の分化細胞は内側に配向します。
このプロトコルは、食道幹細胞ニッチを in vitro で研究するためのツールを提供し、オルガノイドと線維芽細胞の間の相互作用を視覚化します。抗体を用いて線維芽細胞を単離するためのプロトコルを実施することにより、この方法は適応可能であり、トランスジェニックマウスを必要とせずに線維芽細胞亜集団の研究に使用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig01.jpg"> 図1:食道からの前駆細胞および線維芽細胞亜集団の単離。 (A)食道のさまざまな層の概略図。間質には固有層と粘膜下組織が含まれています。(B) 絶縁プロトコルの概略図筋肉(筋筋)は鉗子を使用して機械的に除去されます。残りの食道を切り開き、サーモリシン中でインキュベートして上皮層を間質から分離する。上皮と間質を分離し、機械的にミンチし、酵素的に消化して単一細胞懸濁液にします。次に、解離した細胞を染色し、FACS用に調製します。(C)外筋筋層から剥離した食道の断面で、間質にPdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞を示す。インテグリン-Β4(ITGβ4)およびE-カドヘリン(ECAD)のダブルポジティブ細胞は、食道の上皮前駆細胞です。スケールバー= 100μm。 (D)上皮細胞単離の代表的なフローサイトメトリープロットは、すべての単一細胞からの生細胞の割合(上のパネル)を示す。下のパネルは、すべての生細胞から単離されたITGβ4+ ECAD+前駆細胞の割合を示しています。(E)生細胞の割合を示す間質細胞単離の代表的なフローサイトメトリープロット(左上のパネル)。すべての生細胞における単離されたDPP4+線維芽細胞(Fibr.;右上パネル)およびPdgfrα+線維芽細胞(左下パネル)の割合を示す代表的なフローサイトメトリープロット。Pdgfrα+線維芽細胞の70%もDPP4+です(右下パネル)。(F)DPP4+のみの細胞(2.5%)、DPP4+ PDGFRα+細胞(37.5%)、およびPDGFRα+のみの細胞(17.7%)を示す間質の代表的なフローサイトメトリープロット。パーセンテージはすべての生細胞のものです。(G)上皮のみの細胞を、50 ng/μL EGF、100 ng/μL NOGGIN、および250 ng/μL RSPO(ENR)の存在下でマトリックスドームに播種するか、EGFおよび低濃度のRSPO(25 ng/μL)の存在下で線維芽細胞と一緒に播種します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig02.jpg"> 図2:オルガノイド共培養の代表的な結果。 (A)1日目から6日目までのオルガノイドの成長を示す明視野画像。PdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞と共培養したオルガノイドを用いた明視野画像も、核内eGFPシグナルを示しています。スケールバー= 25μm。 (B)6日目のマトリックスドーム全体の明視野画像。左の列は、ER低またはE低R低培地でPdgfrα+線維芽細胞の存在下で増殖したオルガノイド共培養を示しています。中央の列は、ER低またはE低R低培地でDPP4+線維芽細胞の存在下で増殖したオルガノイド共培養を示しています。右の列は、ENR培地で増殖させたオルガノイド単培養物を示す。ENR培地 = EGF (50 ng/μL)、ノギン (100 ng/μL)、および RSPO (250 ng/μL)低小胞体 = EGF および 25 ng/μL RSPO です。E低 R低 = 5 ng/μL EGF および 25 ng/μL RSPO です。スケールバー=500μm。 (c)オルガノイド形成効率(%)(すなわち、異なる培養条件でオルガノイドを形成する細胞の割合)を示すグラフ。各ドットはマトリックスドームを表し、バーは条件ごとのすべてのドットの平均を表します。(D)PdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞と共培養した6日目のオルガノイドの明視野および蛍光画像。PdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞はドーム全体に存在し、オルガノイドに付着し(矢じり)、付着していないがオルガノイドと接触している(完全な矢印)。スケールバー = 250 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig03.jpg"> 図3:線維芽細胞とオルガノイドの相互作用を研究するためのホールマウント染色プロトコル 。 (A)マウント免疫蛍光プロトコル全体の概略図。AB =抗体。(B)透明化されたオルガノイドと比較してレーザー光の透明度と透過性が低下していることを示す未透明のホールマウント染色の免疫蛍光写真。スペーサーが存在しないと、オルガノイドが平坦化し、オルガノイドの形態が失われます。(C)共培養オルガノイドのホールマウント画像は、ビメンチン+線維芽細胞(Fibr.)がオルガノイドに巻き付けられ、密着しているオルガノイドの3D表面を示しています。3D断面と2D平面画像は、オルガノイドの内腔を示しています。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64905/64905fig04.jpg"> 図4:ホールマウント画像は、明確な基底細胞集団と基底上細胞集団を明らかにし ます。 (A)外層にKRT14+基底細胞とKRT13+分化した基底上細胞を示すPdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞を用いた単培養および共培養オルガノイドのホールマウント染色。スケールバー= 50μm。(B)外層のTRP63+基底細胞とKLF4+分化基底上細胞を示すPdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞による単培養および共培養オルガノイドのホールマウント染色。スケールバー = 50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/64905fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:オルガノイド培地成分を記載した表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Table1_revised_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ1:PdgfrαH2BeGFP+線維芽細胞がオルガノイドに巻き付き、密着しています。 このビデオは 、図3Cの上部パネルに付属しています。 図3C のスケールバーは50μmで、オルガノイドの直径は~120μmです。ビメンチンは白、E-カドヘリンは赤、PdgfrαH2BeGFPは緑、DAPIは青で示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%201_Re.avi" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ2:DPP4+線維芽細胞がオルガノイドに巻き付き、密着している。 このビデオは、 図3Cの下部パネルに付属しています。 図3C のスケールバーは50μmで、オルガノイドの直径は~120μmです。ビメンチンは白、E-カドヘリンは赤、DAPIは青で表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64905/Video%202_RE.avi" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

オルガノイド-線維芽細胞共培養は、 in vivo 幹細胞ニッチを研究するためのモデルを提供します。ここでは、食道オルガノイド-線維芽細胞共培養のためのプロトコルについて説明する。さらに、ホールマウントイメージングを使用して、線維芽細胞とオルガノイドの相互作用を視覚化します。

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...

そのため、前駆細胞は環境と相互作用して組織の恒常性を維持します。そして、このプロトコルを使用して、線維芽細胞が食道前駆細胞の挙動にどのように影響するかを理解し始めることができます。共培養システムは、正常な食道前駆細胞ニッチを模倣する最初に単離された細胞を使用する。イメージング前にオルガノイドをクリアすることで、細胞相互作用とオルガノイド形態の両方の解析が可能になります。この方法は、ヒト食道オルガノイドに適用できます。例えば、健康な患者や癌患者からの材料を使用する。そうすることで、がん関連線維芽細胞の特異的な機能に関する知見を得ることができます。上皮細胞と間質細胞の解離は、生存可能なオルガノイドを得るために重要です。消化不足では細胞収率が低くなり、過剰消化では細胞生存率とオルガノイド形成能力が低下します。はじめに、解剖顕微鏡と鉗子を使用して食道の筋筋を機械的に除去します。1対の鉗子を使用して解剖された食道の遠位端を保持し、もう一方の鉗子を使用して、食道の遠位端から近位端まで筋肉をつかんで引っ張ります。筋肉層を取り除いて捨てます。食道を縦方向に開くには、食道の一端を持ち、微小解剖スプリングハサミのボールを内腔に挿入して組織の損傷を防ぎます。端をつかんだまま食道を切り開き、1.5ミリリットルの微量遠心チューブまたは24ウェルプレートに入れます。開いた食道をHBSSの1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのサーモリシンに浸し、ロッカーシェーカーで摂氏37度で15分間インキュベートします。サーモリシン溶液から食道を除去した後、食道上皮を間質から慎重に分離する。上皮層と間質層をHBSS中の200マイクロリットルの解離溶液を含む2つの別々の1.5ミリリットルの微量遠心管に移し、それらを氷上に置きます。鋭利なメスを使用して食道上皮を細切りにし、200マイクロリットルの解離溶液でペトリ皿から細切組織を収集します。1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。800マイクロリットルの新鮮な解離溶液を加え、ミンチの上皮層を含むチューブを摂氏37度のロッカーシェーカーに60分間置きます。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、溶液を約20回上下に15分ごとにピペットで送ります。解剖ハサミを使用して200マイクロリットルの解離溶液を含む1.5ミリリットルのチューブで間質層を細かく切り、800マイクロリットルの新鮮な解離溶液を加える。チューブを摂氏37度のロッカーシェーカーに30分間置きます。間質溶液の場合は30分間、上皮溶液の場合は60分間インキュベーションした後、溶液をさらに20回上下にピペットで行います。間質溶液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーに通し、上皮溶液を40マイクロメートルのセルストレーナーに通して新しい1.5ミリメートルのマイクロ遠心チューブに入れます。摂氏4度で300Gで10分間遠心分離し、1ミリリットルのピペットで余分な液体を除去して上清を廃棄します。ペレットを200マイクロリットルの抗体ミックスに再懸濁します。混合物をフローサイトメトリーチューブに移した後、細胞を摂氏4度で30分間インキュベートします。3ミリリットルの1%FBSを加え、再び5分間遠心分離します。次に、細胞を最低200マイクロリットルの1%FBSに再懸濁します。ファックスソーティングの5分前に、1〜10, 000希釈した死細胞染色マーカーを追加して、生細胞を分離します。選別された上皮細胞と線維芽細胞をチューブ内で1対2の比率で混合します。300Gで5分間遠心分離した後、上清を200マイクロリットルのピペットで慎重に取り出して廃棄します。ペレットを冷たい塩基性オルガノイド培地に再懸濁して細胞を1回洗浄し、再度5分間遠心分離します。細胞を氷の上に置き、200マイクロリットルのピペットで慎重に上清を取り除いて上清を捨てます。ドームあたり10マイクロリットルのマトリックスミックスに細胞を再懸濁し、チューブを氷上に戻します。摂氏37度のインキュベーターから予熱した48ウェルプレートを取り出し、ウェルごとに1つのマトリックスドームを作成します。20マイクロリットルのピペットを用いて、オルガノイド共培養を含むマトリックスドームに200マイクロリットルの予め温めたER低培地を加え、上皮オルガノイドのみを含む各マトリックスドームにENR培地を加える。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターに入れます。そして最初の2日間は、培地に10マイクロモルの岩石阻害剤を補給します。オルガノイド培地を除去し、200マイクロリットルの氷冷PBSをマトリックスドームに加えます。プレートを氷上に5〜10分間置いた後、ピペットを上下に動かし、溶液を0.6ミリリットルの非付着チューブに移します。100Gで30〜60秒間遠心分離して、オルガノイドを底に沈降させます。余分な液体を取り除いた後、氷冷PBSをチューブに加え、再び30〜60秒間遠心分離します。前に示したように余分な液体を取り除き、オルガノイドを200マイクロリットルの冷たい4%ホルムアルデヒドでPBS溶液中で氷上で30分間固定します。チューブを直立させてオルガノイドを沈め、ホルムアルデヒドを取り除きます。500マイクロリットルの冷たいPBSを加えて、残りのホルムアルデヒドを洗い流します。余分なPBSを除去した後、500マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。チューブをロッカーシェーカーに室温で60分間置きます。ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体を含む200マイクロリットルのブロッキングバッファーにオルガノイドを再懸濁します。オルガノイドをロッカーシェーカーに再び置き、摂氏4度で一晩置きます。一次抗体ミックスを除去し、500マイクロリットルの0.02%Triton X 100をPBS中で室温で60分間使用してオルガノイドを洗浄します。これを3回繰り返します。同様に、洗浄バッファーを除去し、200マイクロリットルの蛍光標識二次抗体をブロッキングバッファーに摂氏4度で一晩加えます。PBS中の0.02%Triton X 100を使用してオルガノイドを再洗浄し、続いて500マイクロリットルのPBSを使用します。余分な液体をすべて除去した後、10マイクロリットルの透明化溶液をオルガノイドに加え、室温で15分間インキュベートします。0.05ミリメートルの両面粘着性のある4ウェルスペーサーを顕微鏡スライド上に置きます。1つのウェルにオルガノイドを含む10マイクロリットルの透明化溶液を加え、スペーサーの上にカバースリップを置きます。共焦点顕微鏡システムを使用して画像を取得します。食道前駆細胞は、それらの高集積ベータ4およびe-カドヘリン発現に基づいてソートされる。上皮細胞単離の代表的なフローサイトメトリープロットは、すべての単一細胞からの生細胞の割合を示しています。全ての生細胞から単離されたインテグリンベータ4細胞およびe−カドヘリン前駆細胞の割合をここに示す。ここに示すフローサイトメトリープロットは、単離されたDPP4+およびPdgf受容体アルファ陽性線維芽細胞の割合を表しています。Pdgf受容体αH2 BEGFP陽性線維芽細胞と共培養したオルガノイドを用いた明視野画像は、核EGFPシグナルを示す。6日目のマトリックスドーム全体の明視野画像を以下に示します。オルガノイド形成効率は、このグラフィック画像によって示されます。各ドットはマトリックスドームを表し、バーは条件ごとのすべてのドットの平均を表します。Pdgf受容体アルファ陽性線維芽細胞との共培養6日目の明視野および蛍光画像をここに示します。共培養オルガノイドのマウント画像全体は、ビメンチン陽性の線維芽細胞がオルガノイドに巻き付けられ、オルガノイドと密接に接触しているオルガノイドの3D表面を示しています。単培養オルガノイドと共培養オルガノイドとPdgf受容体アルファ陽性線維芽細胞の全体マウント染色により、明確な基底細胞集団と基底上細胞集団が明らかになります。オルガノイド形成効率とオルガノイドサイズは、共培養に含まれる線維芽細胞の影響を受けます。異なる線維芽細胞亜集団を使用する場合、変動と結果が期待されます。同じ戦略を使用して、マウスとヒトの両方における腫瘍関連線維芽細胞を特徴付けることができます。

functional-characterization-visualization-esophageal-fibroblasts

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オルガノイド共培養を用いた食道線維芽細胞の機能特性評価と可視化

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