Name: パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶ パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養法。イオンチャネルと神経伝達物質受容体の電気生理学的特性を解析し、聴覚と平衡機能の神経機構を解明する。

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Jing Bing Xue博士とRuth Anne Eatock博士には、これらの方法への初期の貢献に感謝します。この研究は、NIH NIDCD R03 DC012652とNIH NIDCD DC012653S、R01 DC0155512 から RK に、T32 DC009975 から DB、NN、および KR の支援を受けました。

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<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+recordings+at+afferent+dendrites+contacting+cochlear+inner+hair+cells%3A+Monitoring+multivesicular+release+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2442(2010).</li>
<li>Bronson, D., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+acetylcholine+receptors+modulate+HCN+channel+properties+in+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+membrane+conductance+in+the+giant+axon+of+Loligo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo.</a> The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).</li>
<li>Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+sodium+currents+in+acutely+isolated+mouse+vestibular+ganglion+17eurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons.</a> Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).</li>
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<li>Risner, J. R., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+potassium+conductances+contribute+to+the+diverse+firing+properties+of+postnatal+mouse+vestibular+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).</li>
<li>Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-voltage-activated+potassium+channels+underlie+the+regulation+of+intrinsic+firing+properties+of+rat+vestibular+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).</li>
<li>Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+expression+and+functional+role+of+the+sodium-activated+potassium+current+in+vestibular+ganglion+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons.</a> Neuroscience. 240, 163-175 (2013).</li>
<li>Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+cation+channels%3A+From+genes+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function.</a> Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).</li>
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<li>Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+Kcnq4+in+vestibular+neurons+and+neurosensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia.</a> Brain Research. 1139, 117-125 (2007).</li>
<li>Meredith, F. L., Rennie, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+variations+in+K%2B+currents+in+vestibular+crista+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Cai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+activity+of+primary+auditory+neurons+in+the+presence+of+neurotrophins+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics.</a> Hearing Research. 350, 122-132 (2017).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li>
<li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li>
<li>Liu, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion%3A+NaV1.5%2C+NaV1.8%2C+and+tetrodotoxin-sensitive+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

ここで紹介する方法は、単離されたニューロンからの記録に固有のものです。これまでの研究では、半無傷の調製物における軸索終末からの記録に焦点が当てられてきた。既存の端子記録技術と比較すると、絶縁記録は優れたスペースクランプと等電位挙動を提供します。さらに、このプロトコルは、萼軸受の亜集団のみが前庭上皮の半無傷の記録でアクセス可能であるため、ニューロンのより広いサンプルへのアクセスを提供します。最後に、単離された記録では、破裂パッチ記録における細胞内溶液と細胞質の間の透析によってしばしば中断される細胞内環境の破壊を防ぐ穿孔パッチ技術の使用が可能になります。
録音の成功は、まず単離され培養されたソマタの品質にかかっています。細胞の生存における重要なステップは、単離されたニューロンを生成するためにトリチュレーション中に必要な力です。細胞の生存には、優しい手が不可欠です。トリチュレーションピペットは、L-15溶液の気泡の高い位置に置き、ニューロンが皿の底に強制的に排出されるのを防ぐ必要があります。細胞の生存に問題が発生した場合は、気泡の形成や溶液の気泡の破壊を防ぎ、解離した細胞がカバーガラスに...

前庭蝸牛神経の双極ニューロンは、内耳の感覚有毛細胞を脳幹に接続します。それらは、音と頭の動きに関する情報の主要な担い手です。これらの重要な細胞の損傷は、難聴や平衡障害につながります。神経の前庭部分と聴覚部分は、それぞれ形態学的および機能的に多様な異なる細胞タイプで構成されています1,2。前庭系では、2つの求心性亜集団が規則的または不規則な間隔で自発的に発火する2。求心性スパイクのタイミングは、イオンチャネル組成の根本的な多様性を反映していると考えられている3,4。聴覚系には、らせん神経節ニューロン(SGN)の2つの主要な亜集団があります。一方、I型SGNは個々の内有毛細胞に接触し5、II型SGNは複数の外有毛細胞5に接触する。セミインタクト培養および器官型培養からのin vitro記録は、I型SGNとII型SGNの膜特性の違いを示唆しています6,7。
これらのニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルと神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。そのため、単離された前庭およびらせん神経節体細胞の培養を in vitro で研究して、イオンチャネルと神経伝達物質受容体がこれらのニューロンの応答にどのように寄与するかを理解することができます。単離された細胞体のコンパクトな形態により、電位依存性イオンチャネルや神経伝達物質受容体の詳細な特性評価に適した高品質の電気記録が可能になります。代表的なニューロンサブタイプに簡単にアクセスできるため、細胞多様性のハイスループット解析が可能です。
本稿では、ラットの出生後(P)9〜P20に、前庭神経節の上層部から解離した神経節細胞体を単離して培養する方法を紹介します。また、神経節細胞の抽出、解離、およびプレーティングを成功させるために必要なステップに加えて、これらの方法をらせん状神経節に拡張するための提案も提供されています。これらの方法は、さまざまな研究所の出版物で考案された方法の進化形です8,9,10。また、この論文には、パッチクランプ記録用の健康な細胞を選択するためのガイダンスも含まれています。
最後に、プロトコルは、穿孔パッチ構成11を使用したパッチクランプ記録の手順を概説する。穿孔パッチ構成は、より一般的な破裂パッチ構成よりも時間がかかり、技術的にも困難ですが、細胞質環境を維持するのに優れているため、長時間安定した記録セッションが可能です。この記録構成の利点は、破裂パッチ記録と比較して、穴あきパッチの過分極活性化カチオン電流の安定性が向上することで示されています。
このプロトコルは 5 つのセクションに分かれています。セクション 1 から 3 では、事前に準備して保存できるソリューションとツールについて説明します。セクション4では、前庭およびSGNを解剖およびプレーティングするステップについて説明し、セクション5では、培養期間後のニューロンから記録するステップを説明します。私たちの手では、セクション4とセクション5は2日間連続して実行されます。

<table><tbody><tr><td>アンホテリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4888-100MG</td><td>穴あきパッチ録音用。</td></tr><tr><td>ATP二ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>内部溶液への添加剤</td></tr><tr><td>B27サプリメント(50x)、無血清</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>の17504044</td><td>培地への添加剤、SGN</td></tr><tr><td>ビーカー(1000、100、10)ミリリットル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離機</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td></td><td></td><td></td>用</tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td>内部溶液への添加物</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5318</td><td>組織を消化する酵素</td></tr><tr><td>カバーガラス、長方形、#1 厚さ、22x40&nbsp;</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0707</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I,牛の膵臓から</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>組織を消化するための 3 つの酵素のうちの 1</td></tr> つ <tr><td>デュモン #3 鉗子 (鈍器)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子 (ファイン)</td> ファイン <td>サイエンス ツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #55 鉗子 (Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>内部溶液への添加剤</td></tr><tr><td>電極プーラー</td><td>習志毛</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>落射照明光源&nbsp;</td><td>ツァイス&nbsp;</td><td>CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコン ラボ</td><td>2716</td><td>ヘッドと解剖ベンチの周りを掃除する</td></tr><tr><td>電極用フィラメントホウケイ酸キャピラリー</td><td>サッター機器</td><td>BF140-117-10</td><td></td></tr><tr><td>ファインエッジ解剖ブレード</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>トリチュレーションピペットを引っ張る</td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16140063培養</td><td>培地への添加物</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>プロトコルのすべての溶液をpH緩衝用</td></tr><tr><td>ホットプレート/マグネチックスターラー&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76549-914</td><td></td></tr><tr><td>すべてのサンプルと溶液を冷たく保つための</td>氷<td></td><td></td><td>で満たされた断熱バケツ</td></tr><tr><td>K2SO4、硫酸カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9458-250G</td><td>内部溶液への添加剤</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P93333</td><td>内部溶液</td></tr><tr><td>への添加剤 KOH (1 M)</td><td>Honeywell</td><td>319376-500ML</td><td>内部溶液を所望のpH。</td></tr><tr><td>大型スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14133-13</td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツミディアム&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td>解剖および入浴ソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>培養皿用の薄型バス録音室</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0236</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ、</td><td>L-15 / HEPES / HEPES溶液を描画するための</td>30mlBD <td></td><td>302832</td>。</tr><tr><td>MEM + Glutamax Supplement</td><td>Fisher Scientific</td><td>41-090-101</td><td>培養培地の塩基</td></tr><tr><td>MgCl2-Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット充填用内部溶液microFil針への添加物 - 34ゲージ&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフォージ</td><td>習重</td><td>MF-90</td><td>電極研磨用。</td></tr><tr><td>N2サプリメント (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>Additiive to culture medium, for SGN</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Additive to internal solution</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>Thomas Scientific</td><td>319511-500ML</td><td>for t滴定 pH</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Advanced Instruments Inc.</td><td>3320</td><td></td></tr><tr><td>酸素、医療グレード、適切なレギュレーターおよびチューブ付き</td><td>USC材料管理</td><td>MEDOX200(識別子:00015)</td>解<td>剖および入浴液に溶解するための</td></tr>パラ<tr><td>フィルム</td><td>ビーミス</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペットバルブ(3 ml)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-448-25</td><td>トリチュレーションピペット用バルブペ</td></tr><tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>培養培地</td></tr>ペン<tr><td>トバルビタールベースの安楽死溶液(例:Fatal Plus.50 &ndash; 60 mg / kg投与)の</td>汚染を防ぐための科学的な15140122添加剤&nbsp;<td>安楽死</td>PES膜フィルターのための<td>MWIアニマルヘルス</td><td>15199</td></tr><tr><td>、&nbsp; 0.2マイクロメートル&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>566-0020</td><td>ろ過液用</td></tr><tr><td>PES メンブレン滅菌シリンジフィルター、0.22 um、30 mm&nbsp;</td><td>CELLTREAT</td><td>229747</td> シ<td>リンジに引き込まれた溶液をろ過するための</td></tr><tr><td>ペトリ皿、35 x 10 mm</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-103</td><td>マイクロ解剖用、穴あきパッチ構成のチップディップ溶液を保持するため</td></tr><tr><td>ペトリ皿、60 x 15 mm</td><td>ミッドランドサイエンティフィック</td><td>P7455</td><td>肉眼解剖用</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラー・トレド</td><td>モデル S20</td><td></td></tr><tr><td>ピペッター (1000、200、10) マイクロリットル</td><td>米国科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-d-リジンコーティング ガラス底 培養皿</td><td>Mattek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>培養用プレートニューロンへ</td></tr><tr><td>クイックチェンジプラットフォーム、加熱ベース、35 mm 培養皿用</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>参照セル</td><td>ワールド精密計器</td><td>RC1T</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>ミルテックス</td><td>4-315</td><td></td></tr><tr><td>メスのハンドル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>サイエンティフィックスケール</td><td>メトラートレド</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット(10、25)ミリリットル</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック<tr><td>シリコーングリースキット(カバーガラスとチャンバーのシーリング用)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0378</td><td></td></tr><tr><td>小動物ギロチン</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>小動物ギロチン</td><td>ケントサイエンティフィ</td>ック<td>DCAP</td><td>は、P15より古いラットを解剖する場合の斬首用です。</td></tr><tr><td>実体解剖顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>ステミ2000</td><td></td></tr><tr><td>ストレート外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ(3、10、30)ミリリットル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T1426</td>組織を<td>消化する3つの酵素のうちの1</td></tr>つツ<tr><td>ベルクリンシリンジ&nbsp;</td><td>腹腔内注射による安楽死溶液の送達のための</td><td>Covidien</td><td>8881500105</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>容積フラスコ, 1000 milliliter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>945300</td><td></td></tr><tr><td>水, 滅菌 u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (例: ミリポアシグマ浄水器でろ過システム)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CDUFBI001</td><td></td></tr></tbody></table>

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

単離および培養された内耳神経節ニューロンのコンパクトな形態により、この集団全体の細胞の多様性に寄与するイオンチャネルと神経伝達物質受容体の詳細な特性評価が可能になります。このプロトコルはパッチクランプ記録の為に内耳の両極ニューロンの体細胞の巧妙な解剖、解離および短期培養に必要なステップを概説する。前庭神経節ニューロンを調製するための詳細な指示は、らせん神経節ニューロンをプレーティングするために必要な修正とともに提供される。このプロトコルには、穴あきパッチ構成で全セルパッチクランプ記録を実行するための手順が含まれています。過分極活性化環状ヌクレオチド(HCN)媒介電流の電圧クランプ記録を特徴付ける結果の例は、より標準的な破裂パッチ構成と比較して、穴あきパッチ記録構成の安定性を強調しています。単離体細胞と穿孔パッチクランプ記録というこれらの方法の組み合わせは、Gタンパク質共役受容体を介したシグナル伝達など、長く安定した記録や細胞内環境の保存を必要とする細胞プロセスの研究に使用できます。

電圧ステップのファミリを印加して電圧クランププロトコルを実行すると、さまざまな電流ファミリの電圧依存的なアクティブ化が明らかになります。VGNから誘発され、公開された記録13から適応された全セル電流の代表例を図1A、Bに示す。脱分極電圧(図1B)を印加すると、非常に急速に活性化および不活性化する内向き電流(慣例により負)が活性化されます(図1A)。これは、主に活動電位16,17の上昇ストロークを駆動するナトリウムチャネル14,15の電位依存性特性のステレオタイプである。また、脱分極は、活動電位のダウンストロークを駆動する、長時間持続し、比較的ゆっく...

ここでは、内耳の前庭神経節および螺旋神経節ニューロンからの解剖、解離、培養、およびパッチクランプ記録の詳細な手順を提供する方法を示します。

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

聴覚および前庭求心性ニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルおよび神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。単離された細胞体の培養をin vitroで研究することで、これらのイオンチャネルと受容体がニューロンの応答にどのように影響するかを理解することができます。細胞体のコンパクトな形態により、イオンチャネルと神経伝達物質受容体の電位依存性特性を特徴付けるための高品質の電気記録が可能になります。さらに、多種多様な細胞タイプに容易にアクセスできるため、細胞の多様性を物理的に分析することでハイスループットが可能になります。この手順は、大学院生のキャサリン・レガラドと、私の研究室のポスドク研究員であるダニエル・ブロンソン博士とナサニエル・ノワク博士によって実演されます。まず、ガラス製の牧草地ピペットをブンゼンバーナーの炎にかざし、細胞解離用のトリトレーションピペットを調製します。ガラスの先端が溶け始めたら、ガラスを希望の先端の直径まで伸ばします。ピペットの片方の端を炎から引き離し、小さな曲がりを作ります。曲がったピペットを顕微鏡の下に置きます。スコアリングタイルを使用して、希望の直径でガラスに切り込みを入れて割ります。ピペットチップをバーナーの炎の上に通します。これにより、先端付近の粗いエッジをすばやく磨きます。安楽死させたマウスの脳を、閉じた手術用ハサミですくい取ります。脳神経を切断して除去し、頭蓋骨から脳を完全に切り離します。後頭部から始めて、透明な膜状の材料を鉗子で引き剥がし、外科用ハサミを使用して頭蓋骨の上部を切り取ります。頭頸部の後ろから余分な組織を取り除き、解剖領域と耳嚢をきれいにし、アクセスしやすくします。新鮮なL-15溶液を入れた2番目のペトリ皿に組織を移します。次に、耳嚢と聴覚、上前庭神経、前庭神経、下前庭神経を見つけます。小さなスプリングハサミで上神経節と下神経節を分離し、聴覚神経を切り取ります。メスを使用して、骨の隆起をそっと剃り落とし、神経が骨嚢に潜る骨の領域を弱めます。メスで破片を慎重に取り除き、神経節の腫れた部分全体を露出させます。細いスプリングハサミを使用して、卵形嚢に向かって潜っている末梢神経枝から神経節を切断して分離します。細かい鉗子を使用して上神経節を切除し、新鮮なL-15溶液を入れた35ミリメートルのペトリ皿に移します。酵素溶液を予熱した後、酵素混合物を35ミリメートルのシャーレに注ぎ、摂氏37度のインキュベーターに10〜15分間入れます。細かい鉗子と小さなスプリングハサミを使用して、骨、余分な組織、神経線維、およびその他の余分な構造を取り除き、神経節をきれいにします。神経節組織の除去を最小限に抑えるように注意してください。洗浄した神経節を予熱した酵素溶液に移し、インキュベーターに10〜40分間戻します。次に、神

isolating-culturing-vestibular-spiral-ganglion-somata-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、内耳から螺旋神経節外植片を分離し、それらを多電極アレイ上でコルチ器官と共培養するプロセスを示しています。螺旋神経節は慎重に抽出され、より小さな組織切片または外植片に切片化されます。これらの外植片は、多電極アレイの活性領域で培養され、ニューロンプロセスの伸長を促進します。...

多電極アレイ上でのマウススパイラル神経節ニューロン外植片の培養

このビデオでは、マウスの子犬の内耳から前庭ニューロンを分離する方法を紹介しています。内耳の解剖、前庭神経節の採取、その後の神経節の解離を単一の細胞にすることに関連する手順を細心の注意を払って概説しています。次に、これらの細胞をガラス底皿で培養して、前庭ニューロン培養を確立します。...

マウスの内耳からの前庭神経節ニューロンの分離

このビデオは、フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプ技術を示しています。電極付きの薄いガラスピペットを使用して、網膜内のスターバーストアマクリン細胞(SAC)にアプローチします。シールを形成した後、吸引を加えてメンブレンを破裂させ、全細胞パッチクランプ構成を形成します。最後に、SACシナプス受容体を通るイオンの流れは、この構成を使用して測定されます。...

フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

このビデオでは、内耳感覚ニューロン細胞体のイオン電流を測定するためのパッチクランプ技術を示しています。アムホテリシンBを含む内部溶液を充填した研磨パッチクランプピペットの調製と使用について詳しく説明します。このピペットは、メンブレンに穴を開けて、細胞内状態を維持しながらイオンを移動できるようにします。電圧パルスは、イオンチャネルの活動をトリガーおよび記録するために印加され、その特性と挙動に関する洞察を提供します。...

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

赤外線神経刺激は、聴覚系に関連するものを含む神経種類の範囲内の電気刺激の代替として提案されている。このプロトコルは一次聴覚神経細胞の培養における赤外線神経刺激のメカニズムを研究するためのパッチクランプ法を説明しています。...

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

前庭有毛細胞機能の解析は頭蓋骨の最も困難な部分の奥深くの位置、側頭骨錐体によって複雑になる。最も機能有毛細胞研究は、急性単離された有毛細胞を使用している。ここでは、電気生理学的および二光子顕微鏡研究のためのマウス前庭上皮の半無傷の準備について説明します。...

電気生理学および高分解能二光子顕微鏡用マウス前庭感覚上皮の切り抜き半無傷準備

我々は、海洋アメフラシの神経系の解剖を説明...

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

この原稿は、パッチクランプ録音のための無傷の後根神経節の準備方法を説明しています。この調製物は、ニューロンおよびサテライトグリア細胞の微小環境を維持し、解離したDRGニューロンを使用して見られる表現型および機能的変化を回避します。...

成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ...

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

ここでは、マウスの血管線条から原発周辺細胞の分離、精製、培養および酸化ストレスおよび細胞老化の in vitro...

新生マウスからの血管条線の一次境界細胞の単離および培養

We present a new dissection method to extract the vestibular ganglion and all five vestibular organs (utricle, saccule, and three cristae: lateral/horizontal, anterior, and posterior) as one whole-mount vestibular complex. Confocal imaging allows visualization of vestibular neuron cell bodies for quantification, as well as neuronal projections to the sensory...

Whole-Mount Dissection of the Vestibular Complex and Quantification of Vestibular Ganglion Neurons in Mice

学ぶ パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養法。イオンチャネルと神経伝達物質受容体の電気生理学的特性を解析し、聴覚と平衡機能の神経機構を解明する。

パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

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