パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

聴覚および前庭求心性ニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルおよび神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。単離された細胞体の培養をin vitroで研究することで、これらのイオンチャネルと受容体がニューロンの応答にどのように影響するかを理解することができます。細胞体のコンパクトな形態により、イオンチャネルと神経伝達物質受容体の電位依存性特性を特徴付けるための高品質の電気記録が可能になります。

さらに、多種多様な細胞タイプに容易にアクセスできるため、細胞の多様性を物理的に分析することでハイスループットが可能になります。この手順は、大学院生のキャサリン・レガラドと、私の研究室のポスドク研究員であるダニエル・ブロンソン博士とナサニエル・ノワク博士によって実演されます。まず、ガラス製の牧草地ピペットをブンゼンバーナーの炎にかざし、細胞解離用のトリトレーションピペットを調製します。

ガラスの先端が溶け始めたら、ガラスを希望の先端の直径まで伸ばします。ピペットの片方の端を炎から引き離し、小さな曲がりを作ります。曲がったピペットを顕微鏡の下に置きます。

スコアリングタイルを使用して、希望の直径でガラスに切り込みを入れて割ります。ピペットチップをバーナーの炎の上に通します。これにより、先端付近の粗いエッジをすばやく磨きます。

安楽死させたマウスの脳を、閉じた手術用ハサミですくい取ります。脳神経を切断して除去し、頭蓋骨から脳を完全に切り離します。後頭部から始めて、透明な膜状の材料を鉗子で引き剥がし、外科用ハサミを使用して頭蓋骨の上部を切り取ります。

頭頸部の後ろから余分な組織を取り除き、解剖領域と耳嚢をきれいにし、アクセスしやすくします。新鮮なL-15溶液を入れた2番目のペトリ皿に組織を移します。次に、耳嚢と聴覚、上前庭神経、前庭神経、下前庭神経を見つけます。

小さなスプリングハサミで上神経節と下神経節を分離し、聴覚神経を切り取ります。メスを使用して、骨の隆起をそっと剃り落とし、神経が骨嚢に潜る骨の領域を弱めます。メスで破片を慎重に取り除き、神経節の腫れた部分全体を露出させます。

細いスプリングハサミを使用して、卵形嚢に向かって潜っている末梢神経枝から神経節を切断して分離します。細かい鉗子を使用して上神経節を切除し、新鮮なL-15溶液を入れた35ミリメートルのペトリ皿に移します。酵素溶液を予熱した後、酵素混合物を35ミリメートルのシャーレに注ぎ、摂氏37度のインキュベーターに10〜15分間入れます。

細かい鉗子と小さなスプリングハサミを使用して、骨、余分な組織、神経線維、およびその他の余分な構造を取り除き、神経節をきれいにします。神経節組織の除去を最小限に抑えるように注意してください。洗浄した神経節を予熱した酵素溶液に移し、インキュベーターに10〜40分間戻します。

次に、神経節を新鮮なL-15溶液を入れた35ミリメートルのシャーレに移します。2〜3分後、神経節をろ過した培地で満たされた別の35ミリメートルのシャーレに移します。約150マイクロリットルのろ過した培地を、コーティングされたガラス底のディッシュに移します。

次に、必要な数の神経節をカバースリップに移します。培養皿から少量の培地を取り出し、トリトレーションピペットを培地ですすぎ、組織がガラスピペットの側面にくっつかないようにします。神経節が十分に解離するまで、組織をピペットに穏やかに繰り返し通すことにより、粉砕します。

5分後、光学顕微鏡で細胞がカバースリップに沈殿しているかどうかを確認します。培養皿を摂氏37度のインキュベーターに12〜24時間慎重に入れます。次に、頭を二等分した後、耳嚢を見つけ、鉗子を使用して端を削って頭蓋骨から抽出します。

耳嚢のらせん状の部分には、コルチの器官を備えた蝸牛があります。骨を削り取り、骨のカーブに平行な細い鉗子で蝸牛ターンを覆います。小さなスプリングハサミを使用して、蝸牛の基部にあるモディオルスを切断し、耳嚢の残りの部分から解放します。

コルティの器官を小さなバネハサミを使って平らになるように2〜3回転に切り、各回転からモディオルスを切除します。細い鉗子で基部の線条をつまんで、線条血管を取り除きます。螺旋の周りを巻き、頂点まで巻き戻して、コルティの器官から剥がします。

らせん神経節ニューロン線維路が有毛細胞に向かって突出する場所の端を切断してらせん神経節を取り除き、前述のように神経節をきれいにします。らせん状神経節を酵素的に処理した後、N2およびB27を添加した培地中でらせん状神経節をトリトレートします。解離した神経節を含む培養皿を摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターに12〜24時間置きます。

ピペットの先端を培養皿の清浄液に浸し、アムホテリシンを含まない清浄な溶液で満たします。ピペットの背面にアムホテリシンを含む内部溶液を入れます。ピペットの先端を培養皿の清浄な溶液に戻し、アムホテリシンがピペットの背面からゆっくりと先端に入ります。

次に、ピペットの3分の2までのアムホテリシン溶液をピペットに充填し終えます。ピペットを記録チャンバーの槽に下ろし、ピペットチップを視野の中央に配置します。先端に気泡やその他の破片がないことを確認してください。

ピペットをメンブレンの近くに置き、細胞の中心にしっかりと着地させます。シリンジまたはマウスピペットを使用して陰圧または吸引を加えます。マイナス60ミリボルトの保持電位をオンにします。

シール抵抗は、ギガオームを通過するまで増加する必要があります。ギガオームのシールが形成されたら、負圧を解放します。チロシンが働き始める前に、入力抵抗はゆっくりと減少し、5ミリボルトの電圧ステップに応答して流れる電流は、アムホテリシンが膜に入るにつれて徐々に増加します。

前庭神経節ニューロンから誘発される全細胞電流の代表例をこの図に示します。ここでは、正味の内向きのナトリウム電流が、その過渡的な活性化と不活性化によって識別されます。正味の外向きの電流は、主にカリウムイオンによって運ばれ、ナトリウム電流よりもはるかに遅い活性化および不活性化速度論を持っています。

過分極活性化サイクリックヌクレオチドゲート電流(HCN電流)は、長時間の過分極電圧のファミリーによって活性化されます。この図は、記録中のさまざまな時点での穿孔パッチのイオンチャネル特性評価の安定性を示しています。HCN電流の電圧依存性活性化曲線は、穴の開いたパッチ構成で測定されました。

曲線はシグモイド形状をしており、長時間の録音中も安定していました。破裂パッチモードの相対的な不安定性は、異なる時点からの重なり合わないシグモイド曲線によって示されます。破裂パッチ構成中のHCN電流の活性化曲線をここに示します。

ここでは、5つの前庭神経節ソマラ、5つの螺旋神経節ニューロンの発火パターンと、対応する現在のステップを示します。この発火パターンの不均一性は、前庭神経節ニューロンと螺旋神経節ニューロンの両方における基礎となるナトリウムチャネルとカリウムチャネルの組成の基本的な多様性を反映しています。この手順で細胞の生存率を最大限に高めるには、気泡の形成を避け、組織を酷使せず、細胞が沈降するのを待ってからサンプルをインキュベーターに入れてください。

穴あきパッチクランプは、神経節ニューロンに対する遠心性神経伝達物質の影響を調査するために重要な、細胞質セカンドメッセンジャーによって調節されるイオンチャネルの研究を可能にします。これらの双極ニューロンのパッチクランプ記録は、生物物理学的多様性が感覚ニューロンの機能的多様性にどのように寄与するかを明らかにするのに役立っています。