凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

私たちのプロトコルは、獣医学および生物医学研究のために豚の腸上皮を研究するためのツールを提供します。ブタ由来の腸内オルガノイドは、栄養素輸送、バリア機能、および宿主と微生物の相互作用の研究に使用できます。ブタの腸管上皮陰窩の保存により、後で3Dまたは2D単層でオルガノイドを培養するために使用できる幹細胞の大量のストックを作成することができます。

このプロトコルは空腸について詳述されていますが、十二指腸、回腸、結腸などの他の腸のセグメントにも使用できます。はじめに、900個の凍結した陰窩が入っているバイアルを摂氏37度の水浴中で素早く解凍します。クリプト溶液を15ミリリットルの円錐管に移します。

室温で300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。冷却されたチップで150マイクロリットルの細胞外マトリックスまたはECMを追加して、25マイクロリットルのECMあたり150クリプトの最終濃度を取得します。ピペットを上下に10回使用して、ECM内の陰窩の均質な懸濁液を取得します。

6つのウェルに、ウェルあたり25マイクロリットルの滴下を、事前に温めた48ウェルプレートに播種します。ECMの重合のために摂氏37度と5%二酸化炭素で30分間インキュベートします。室温で培地の培養液1ウェルあたり250マイクロリットルを加え、摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベートします。

2〜3日ごとに培地を交換してください。播種後10日目に凍結陰窩由来の3Dオルガノイドを継代するには、培養液を取り出し、摂氏37度で予熱したPBS250マイクロリットルを加えます。インキュベーション後、PBSを、摂氏37度で10マイクロモルの岩石阻害剤を添加した250マイクロリットルの予め温めた酵素解離試薬と各ウェルに交換します。

P-1000ピペットで削ってECM内のオルガノイドを分離し、5回ピペッティングして慎重にホモジナイズします。摂氏37度と5%の二酸化炭素で5分間インキュベートしてから、10回上下にピペッティングして細胞を解離させます。解離した細胞を含む各ウェルに500マイクロリットルのDMEMcを加え、3ミリリットルのコールドDMEMcを含む15ミリリットルの円錐管で最大12ウェルを引き上げます。

500 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを1ミリリットルの冷DMEMcに再懸濁する。細胞カウンターでトリパンブルーで1〜2倍に希釈した細胞を数えます。

ドームあたり3000個の生細胞を得るために必要な量の細胞溶液を遠心分離します。氷上で3000生細胞あたり17マイクロリットルのコールドDMEMcでペレットを再懸濁します。必要なウェル数に容量を調整します。

3000生細胞あたり33マイクロリットルのコールドECMをゆっくりと加えます。必要なウェル数に容量を調整し、気泡を作らずに均質化します。次に、ウェルあたり50マイクロリットルのECM細胞懸濁液を予め温めた24ウェルプレートでウェルを確認し、ECMの重合のために30分間インキュベートします。

ウェルあたり500マイクロリットルの培養液を追加します。その後、2〜3日ごとに培養液をインキュベートして交換します。培養インサートをコーティングするには、コールドPBSで50マイクログラム/ミリリットルに希釈したコラーゲンIVを含むコーティング溶液を調製します。

150マイクロリットルの希釈コーティング溶液を各細胞培養インサートに加え、一晩または3時間インキュベートします。分割から5日後、オルガノイドをP-1000ピペットでこすってECMで剥離します。培養液中でピペッティングして注意深く均質化し、氷上で5ミリリットルのコールドDMEMcを含む15ミリリットルのコニカルチューブに移します。

採取したオルガノイドを500 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を注意深く吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した1ミリリットルの予め温めた酵素解離試薬に細胞ペレットを再懸濁します。ピペットを上下に10回動かしてオルガノイドの解離を開始します。

酵素消化のために摂氏37度の水浴中で5分間インキュベートします。10回ピペッティングしてオルガノイドを機械的に破壊し、4ミリリットルの氷冷DMEMcを加えます。遠心分離して上清を廃棄してから、オルガノイド細胞ペレットを1ミリリットルのDMEMcに再懸濁します。

細胞カウンターでトリパンブルーの細胞をカウントし、培養インサートごとに10〜5番目の細胞を2.5倍播種するのに必要な量を計算します。培養インサートあたり第5の細胞の2.5倍10個に相当する必要量の細胞懸濁液を遠心分離する。遠心分離中は、培養インサートからコーティング溶液を慎重に吸引し、蓋なしでフードの下で5分間乾燥させます。

遠心分離後、上清を廃棄し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した必要量の2D培地にペレットを再懸濁します。200マイクロリットルの細胞懸濁液をコーティングされた透過性膜上に播種する。10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した500マイクロリットルの2D培地を下部コンパートメントに追加し、インキュベートします。

膜上に高密度の細胞が観察されるべきである。播種の1日後に、エピカル培地と基礎培地をROCK阻害剤を含まない新鮮な2D培地と交換します。メディアは毎日交換してください。

単層は播種後1日でコンフルエントになり、その実験に使用できます。この研究では、ブタの腸から上皮陰窩を採取し、液体窒素中での長期保存のために凍結保存しました。融解後、陰窩幹細胞をECMに播種した。

オルガノイドは3〜4日以内に観察され、急速に成長し、出芽構造を発達させました。解凍後約10日目に、培養を拡大するためにオルガノイドの継代を行った。培養を最適に維持するために、パッケージングに使用されるオルガノイドは、成熟オルガノイドで観察されるような、内腔に黒い破片がなく、明確で空の内腔と明確に定義されたエッジを提示する必要があります。

細胞は1日以内に付着して完全にコンフルエントな単層を形成し、これは約700ドーム平方センチメートルの高い経上皮電気抵抗(TEER)によって確認されます。TEERは3日間高いままです。アクチン染色は、上皮細胞の頂端側が3Dオルガノイドの内腔に向いていることを示す。

培養インサートに播種されたオルガノイド細胞は、頂端側が上部コンパートメントに向けられた上皮細胞のコンフルエントな単層を形成します。オクルージン染色は、3Dオルガノイドおよび細胞単層における上皮細胞の頂端側にタイトジャンクションが存在することを明らかにします。細胞の単層を播種するために使用されるオルガノイドは、死んだ細胞の蓄積に対応する黒い破片のない空の内腔で透明に見えるべきであることを覚えておくことが重要です。

ブタ腸オルガノイドの単分子膜は、機能アッセイ、イメージング、および遺伝子発現解析を使用して、上皮バリア機能に対する代謝産物または微生物の影響を試験するために使用できます。