Name: フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ フローサイトメトリーによる造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価法。単一細胞レベルで細胞運命と分化を高スループットに解析し、がん生物学や免疫学の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

フローサイトメトリー実験のセットアップにご協力いただいたキュリーフローファシリティ研究所のメンバーに感謝します。また、複数の議論の中で、チームペリエの他のメンバーの貢献に感謝したいと思います。ジュリア・マルキンゴ博士とフィル・ホジキン教授(ウォルターエンドエリザホール医学研究所)がリンパ球上の細胞分裂色素のマルチプレックスのプロトコルを共有してくれたことに感謝します。このプロトコルの開発に必要な生物学的資源を提供してくれたセントルイス病院の臍帯血バイオバンクに感謝します。この研究は、CNRSおよびBettencourt-Schueller FoundationからのATIP-Avenir助成金(L.P.へ)、 Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038)(L.P.およびA.D.へ)、Idex Paris-Science-Lettres Program(ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)(L.P.へ)、Canceropole INCA Emergeation(2021-1-EMERG-54b-ICR-1、L.P.へ)、ITMO MIIC助成金(21CM044、L.P.へ)によって支援された。欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラムERC StG 758170-Microbar(LPへ)の下での欧州研究会議(ERC)からの資金提供に加えて、ADはフランス財団からのフェローシップによって支援されました。

以下のプロトコルでは、匿名化された臍帯血をHSPCソースとして使用し、サンルイ病院臍帯血バイオバンク(承認AC-2016-2759)およびヘルシンキ宣言によって定義されたガイドラインに従って収集されました。
注意: 開始する前に、 材料の表 に記載され、プロトコルに記載されているように、このプロトコルに必要なすべての試薬と機器が利用可能であることを確認してください。関連する試薬を新鮮に準備し、明示的に言及されていない限り、保管しないでください。
1. 細胞色素染色
注:このセクションでは、CFSEとバイオレット染料(CTV)細胞分裂染料の4つの組み合わせによる染色について説明します。細胞色素溶液を添加しなくても、すべてのチューブを同時に処理します。全ての工程は、以下の細胞培養工程を可能にするために無菌条件下で行われる。所要時間:約100分
<ol><li>磁気選別プロトコル29に従って臍帯血ユニットを処理する。大きなCD34- 画分と小さいCD34+ 画分の2つの画分が利用可能であることを確認してください。両方のチューブを300 x gで5分間回転させます。ペレットを乱すことなく上清を吸引する。</li>
	<li>CD34+ 画分については、ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)1 mLに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞密度は、3 x 106 細胞/ mLを超えてはなりません。この場合は、それに応じて音量を調整してください。CD34- 画分については、FBSなしでDMEMに再懸濁し、容量を最大6 x 106 細胞/ mLに調整します。</li>
	<li>250 μLのCD34+画分を4本の15 mLポリプロピレンチューブに分注します。チューブに次のようにラベルを付けます:CD34 + / CF(CFSE_only)、CD34 + / CV(CFSE_high CTV_low)、CD34 + / VC(CFSE_low CTV_high)、およびCD34 + / VI(CTV_high)。250 μLのCD34-画分を別の4本の15 mLポリプロピレンチューブに分注します。チューブに次のようにラベルを付けます:CD34-/ CF(CFSE_only)、CD34-/ CV(CFSE_high CTV_low)、CD34-/ VC(CFSE_low CTV_high)、およびCD34-/ VI(CTV_high)。CD34-画分由来の残りの細胞は廃棄することができる。</li>
	<li>CFSE_high と CFSE_low という名前の 2 つの CFSE ソリューションを準備します。CFSE_high(10 μM)の場合、FBSなしのDMEM1.1 mLとCFSEストック(5 mM)溶液2.2 μLを混合します。CFSE_low (5 μM) の場合は、FBS なしの DMEM 550 μL と CFSE ストック (5 mM) 溶液 0.55 μL を混合します。</li>
	<li>CFチューブとCVチューブに250 μLのCFSE_high溶液、VCチューブに250 μLのCFSE_low溶液、FBSなしのDMEM250 μLをVIチューブに加えます。細胞懸濁液と細胞色素を効率的に混合するには、チューブをほぼ90度傾け、CFSE溶液をチューブ壁に堆積させます。次に、チューブを垂直に保持して2つの溶液を混合し、ピペットを3〜4回使用して、CFSE溶液と再懸濁された細胞との迅速な混合を確保します。37°Cで正確に8分間インキュベートします。</li>
	<li><li></li><li><li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li><li></li><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Table_1.xlsx" target="_blank"></a><ol><li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li> </li><li></li><li></li><li> </li><li></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Table_2.xlsx" target="_blank"></a><ol><li><li><li><li><li></li><li></li></ol><ol><li><li></li><li></li><li><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Table_3.xlsx" target="_blank"></a><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64918/64918eq1v2.png" style="margin: auto;"> </li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li> </li><li></li><li> </li><li></li></ol><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/Table_4.xlsx" target="_blank"></a><ol><li></li><li></li><li><li> </li><li></li><li></li><li><li> </li><li></ol>

<ol><li>Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+immunology%3A+Past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell immunology: Past, present, and future.</a> Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).</li>
<li>Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA-sequencing%3A+A+powerful+yet+still+challenging+technology+to+study+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity.</a> Bioessays. 44 (11), 2200084(2022).</li>
<li>Regev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cell+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The human cell atlas.</a> Elife. 6, 27041(2017).</li>
<li>Laurenti, E., Göttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li>
<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+commitment+of+hematopoietic+stem+cells+and+progenitors%3A+insights+from+recent+single+cell+and+lineage+tracing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies.</a> Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).</li>
<li>Perié, L., Duffy, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retracing+the+in+vivo+haematopoietic+tree+using+single-cell+methods%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods.</a> FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).</li>
<li>Yu, V. W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+underlies+cell-autonomous+heterogeneous+behavior+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells.</a> Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).</li>
<li>Ganuza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+haematopoiesis+is+established+by+hundreds+of+precursors+throughout+mammalian+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny.</a> Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).</li>
<li>Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+barcoding%3A+A+technical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cellular barcoding: A technical appraisal.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).</li>
<li>Quek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+distinct+leukemic+stem+cells+in+human+CD34+%E2%88%92+acute+myeloid+leukemia+are+arrested+at+a+hemopoietic+precursor-like+stage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage.</a> The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).</li>
<li>Karamitros, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+the+continuum+of+human+lympho-myeloid+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells.</a> Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Delaney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-mediated+expansion+of+human+cord+blood+progenitor+cells+capable+of+rapid+myeloid+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution.</a> Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+PPAR-%CE%B3+3+signaling+expands+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+enhancing+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis.</a> Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-booster+nicotinamide+riboside+potently+stimulates+hematopoiesis+through+increased+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nov%2FCCN3+enhances+cord+blood+engraftment+by+rapidly+recruiting+latent+human+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).</li>
<li>Horwitz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omidubicel+vs+standard+myeloablative+umbilical+cord+blood+transplantation%3A+results+of+a+phase+3+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study.</a> Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).</li>
<li>Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+on+transcriptional+landscapes+links+state+to+fate+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation.</a> Science. 367 (6479), 3381(2020).</li>
<li>Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cell+fate+control+by+continuous+single-cell+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification.</a> Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).</li>
<li>Tario, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+staining+and+proliferation+modeling+methods+for+cell+division+monitoring+using+cell+tracking+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4287(2012).</li>
<li>Marchingo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+stimuli+independently+sum+to+regulate+an+inherited+clonal+division+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate.</a> Nature Communications. 7, 13540(2016).</li>
<li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+division+tracking+dyes+for+proliferation-based+clonal+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing.</a> Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).</li>
<li>Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehmann%2C+EL+%22Testing+statistical+hypotheses%22">Testing statistical hypotheses</a>. , Springer. New York. 784(2005).</li>
<li>Tak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSPCs+display+within-family+homogeneity+in+differentiation+and+proliferation+despite+population+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity.</a> Elife. 10, 360624(2021).</li>
<li>Sommerkamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+multipotent+progenitor+5+cells+are+located+at+the+interphase+between+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).</li>
<li>Kato, K., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+from+human+peripheral+blood+by+high-gradient+magnetic+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting.</a> Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Laurenti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK6+levels+regulate+quiescence+exit+in+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+in+patients+with+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Davison, A. C., Hinkley, D. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavison%2C+AC+%22Bootstrap+Methods+and+their+Application%22">Bootstrap Methods and their Application</a>. , Cambridge University Press. (1997).</li>
<li>Horton, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+B+cell+antibody+class+switching+is+stochastic%2C+cell-autonomous%2C+and+tuneable%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable.</a> Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+routes+of+lineage+development+reshape+the+human+blood+hierarchy+across+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116(2016).</li>
<li>Grinenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+can+differentiate+into+restricted+myeloid+progenitors+before+cell+division+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 1898(2018).</li>
<li>Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+flow+cytometry%3A+Helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).</li>
</ol>

著者は、この作業に関連する利益相反を宣言しません。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解釈、または出版のために作品を提出する決定において何の役割も果たしていませんでした。

MultiGenアッセイは、リンパ球23,24,35およびマウス造血細胞26,27の研究に役立ってきた、ハイスループットで実行が容易で安価なアッセイです。ここでは、ヒトHSPCコミットメントの初期段階を、短期間培養を用いて単一細胞レベルでex vivoで解読できるアプローチの新しい開発を紹介します(図6)。単一細胞ex vivo培養システムは、通常、成熟細胞へのHSPCの長期的な運命を評価するために使用されますが、一部の運命は他の運命よりも早く発生し36、分析がより少ない運命に偏る可能性があります。さらに、これらの文化システムは通常、運命のコミットメント中に分裂に関する情報を見逃しています。最初のコミットメントステップは、文化の開始時に早くも発生し、時には分割26,37なしで発生することが示されており、早期の運命のコミットメントを研究するには、短期的な文化と追跡部門が不可欠です。運命、分裂、親族関係を同時に追跡することにより、このアッセイは、ヒトHSPCにおける最初の分裂と運命決定の役割を理解することを可能にします。 アッセイを使用すると、コミットメントプロセスがいくつの分裂後に発生するか、それらの初期祖先の自己複製と分化のバランス、およびそれらの特性が世代間でどのように受け継がれるかを推測することができます。私たちの知る限り、これはヒトHSPCのこれらのタイプの測定を単一細胞分解能で可能にする唯一のアッセイです。さらに、細胞分裂色素のさまざまな組み合わせを使用して、分析のスループットを向上させ、このアッセイを大規模なデータセットを迅速に生成するための貴重なツールにしました。色素の組み合わせにより、同じウェル内の複数のファミリーを追跡できるため、短期培養での分析に利用できる細胞の数が増えます。他の色素(黄色色素など)を添加したり、CFSEとCTVの比率を変更したりすることで、組み合わせの数をさらに増やすことができます。ただし、これにより、分析できる他のパラメータの数が減ります。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> 図6:プロトコルの概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
分析を成功させるには、ウェルの数が多く、分析する細胞の数が少ないため、プレートリーダーを備えた分析装置でフローサイトメトリー分析を実行する必要があります。新世代のベンチアナライザーは、細胞損失の割合を減らすためにデッドボリュームが小さいため、このアッセイに特に適しています。これにより、各井戸全体を回収する際のより高い効率が保証され、70%の範囲で推定される効率が促されます26。フローサイトメトリー取得中の細胞損失を推定することは、個々のファミリーの解析に不可欠です。例えば、細胞死がないと仮定して分裂数をカウントし、各科当たりの細胞数を推定することができる。それにもかかわらず、特に試験された培養条件での細胞死の推定および定義された数の細胞を用いて実験的に回収率を測定する場合、いくつかの確認実験を実行することが望ましい。
このプロトコルの重要なステップの1つは、ピーク割り当てです。すでに述べたように、良質のピーク分布は、細胞選別時の非常に狭いピークの単離に強く依存します。それにもかかわらず、分布に基づいて正しい分割数を割り当てることは依然として困難です。セルソーティングとフローサイトメトリー解析は2つの異なるマシンで行われるため、各シグナルの強度を直接比較することはできないため、ヒストグラムの右端に観察された最初のピークがピーク0なのかピーク1なのかを知ることは難しい場合があります。この点で、可能な解決策はほとんどありません。1つの方法は、これらの細胞によって行われる分裂の数を正確に測定するために直交実験を行うことである(例えば、生細胞イメージング)。別の可能性は、フローサイトメトリー分析を実行する前に、倒立明視野顕微鏡下でウェル内の細胞数を単純にカウントすることです。これにより、平均分裂数が推測されます(細胞死がないと仮定します)。最後に、ピーク割り当ての事後ソリューションは、異常な数の「不可能なファミリ」の検出です。これらのファミリーは、世代当たりの細胞数が可能な限り多い(例えば、第2世代に5つの細胞、または第1世代に2つの細胞と第2世代に1つの細胞)で構成される。不可能なファミリーを除外する可能性は、統計分析ステップでコード化され、不可能なファミリーにフラグが立てられます。これらのエラーの発生が高すぎる場合は、ピーク割り当てを修正する必要があると考えるのが妥当です。
このプロトコルでは、大規模なデータセットの生成と解釈において不可欠なステップとなっているため、アッセイのためのデータ表現と分析のいくつかの例を含めました38。最初の例は、分析されたすべてのセルの全体を示すヒートマップで、ファミリごとに整理されています。これは、データの一般的な特性と潜在的な結論を調査するための効率的なツールです:ファミリーは複数の細胞タイプによって構成されていますか、それとも組成が均一である傾向がありますか?家族は複数の世代に分散していますか、それともほとんど同じ回数に分かれていますか?この探索的分析は、より具体的なプロットと統計的検定で補完する必要があります。対称的および非対称的な運命コミットメント、分割なしの分化、自己複製と分化のバランス、および特定のコミットメント運命の分割数を定量的に評価するために使用できます。実験計画では、質問の種類に応じて細胞培養長を設定することが基本です。たとえば、最初の 2 つの質問 (対称/非対称バランスと分割なしの分化) では、非常に短い培養ステップを計画すると、分割を 1 つだけ実行したか、まったく実行していない多数のファミリを分離できます26。逆に、より長い実験では、分化のさまざまな段階でファミリーをサンプリングするため、特定の細胞コミットメントに必要な分裂数を調べることができます。それにもかかわらず、この方法は、細胞色素希釈が7つまたは8つ以上の分裂を正確に追跡することができないので、長期培養(2〜3週間)用に設計されていない22。結果として、このツールは造血前駆細胞の早期関与を研究するためにほとんど適合されており、これらの細胞の長期的な分化特性について確固たる結論を出すようには設計されていません。
統計的枠組みは、このタイプのデータの分析のために特別に開発され、順列26の概念に基づいています。これは、細胞型分布および実施された分裂数に対する家族依存性の観察のために必要であった。言い換えれば、同じファミリーの一部である細胞は、同様の表現型を示し、同じ回数分裂する可能性も高くなります。詳細な分析はこの作業の範囲を超えていますが、さまざまな条件を評価するには、提供されている一連の統計的検定で十分です。
結論として、このプロトコルは、造血幹および前駆細胞の細胞動態を ex vivoで迅速かつ安価な方法で評価するための貴重なツールを構成します。分析するHSPCの種類、培養条件、およびタイプに関する柔軟性と汎用性により、さまざまな実験条件を試験することができます。フローサイトメトリーベースのアッセイとして、ほとんどのラボで実装でき、広範な事前知識を必要としないため、スクリーニングやパイロット実験に適しています。

過去10年間は、細胞生物学および分子生物学への単一細胞アプローチの世界的な普及によって特徴づけられました。シングルセルゲノミクス1,2のステップに続いて、今日では、毎年急成長している新しいシングルセルオミクス技術を使用して、単一細胞の多くの成分(DNA、RNA、タンパク質など)を研究することが可能です。これらの技術は、ヒト細胞とモデル生物細胞の両方を使用して、免疫学、神経生物学、腫瘍学などの分野の新旧の質問に光を当てました3。個々の細胞間の違いを強調することにより、シングルセルオミクスは、造血幹細胞と前駆細胞(HSPC)の不均一性を中心に、離散的な均質集団の古典的なモデルから離れて、造血の新しいモデルの定義を促しました4,5。
すべてのオミクス技術のいくつかの欠点の1つは、目的の細胞が破壊され、その機能を評価する可能性を妨げることです。逆に、単一細胞移植アッセイおよび系統追跡技術などの他の単一細胞法は、in vivoで個々の細胞の運命を評価することによって祖先細胞の機能性の読み出しを提供する6,7。系統追跡技術では、目的の細胞を遺伝性遺伝子7または蛍光標識8,9で標識し、複数の単一細胞の運命を同時に追跡できます。しかしながら、出発細胞の特性評価は、典型的には、フローサイトメトリー10によって評価されたいくつかの表面タンパク質の発現など、限られた数のパラメータに制限される。さらに、シングルセル系譜追跡技術では、通常、DNA/RNAシーケンシングまたはイメージングを介して、細胞標識の面倒な検出が必要です。この最後の点は、特に1回の実験でテストできる条件の数を制限します。
単一細胞の機能性を研究するために使用される別のクラスの方法は、単一HSPCのex vivo細胞培養システムである。 実行が容易なこれらのゴールドスタンダードアッセイでは、個々の細胞を96ウェルの細胞培養容器にソーティングし、培養後に、通常はフローサイトメトリーまたは形態素解析によって細胞子孫の表現型を特徴付けます。これらのアッセイは、主にHSPCの成熟細胞への長期分化、典型的には培養2〜3週間後に特徴付けるために使用されてきた11,12。あるいは、それらは、ヒト幹細胞移植に対する医学的利益を約束して、ex vivo HSPCs13、14、15、16、17、18を維持および拡大しようとするために使用されている19。最後に、それらは短期培養20を使用してHSPCの早期コミットメントを研究するために使用されており、この培養で生成される細胞数が少ないことが主な制限要因です。これらの異なる種類のex vivoアッセイの1つの欠点は、それらがin vivoの複雑さを部分的にしか反映していないことです。それでも、それらはヒトHSPC分化を研究するためのまれな方法の1つです。
既存のシングルセル法(シングルセルオミクス、系統追跡、ex vivo培養)から欠落している情報の1つは、HSPCダイナミクスを研究する際に考慮すべき重要なパラメーターである細胞分裂の正確な検出です21。フローサイトメトリーで分割数を評価する簡単な方法は、5-(および6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)22などの可溶性「タンパク質色素」を使用することです。これらの分裂色素は染色された細胞の細胞質内に拡散し、半分に希釈され、細胞分裂ごとに2つの娘細胞に渡され、最大10の分裂を列挙することができます。いくつかの分割色素を組み合わせることで、複数の個体前駆細胞を同じウェルに播種することができ、それぞれの個体色素が異なる子孫の分離を可能にするようにする。これは、マウスリンパ球に最初に導入されたマルチプレックスクローンおよび分裂追跡のための細胞色素の使用の背後にある原理です23,24。
ここでは、マウスおよびヒトのHSPCで使用するためのMultiGenアッセイの開発を紹介します。これにより、多くの単一細胞を同時に試験して、分化、分裂、および親族関係の特性をex vivoでテストできます。このハイスループットで、実行が容易で、安価なアッセイにより、細胞の表現型、実行された分裂数、およびウェル内の他の細胞との細胞の親族関係とクローン関係をすべて同時に測定できます。対称的および非対称的な運命のコミットメント、自己複製と分化のバランス、および特定のコミットメントの運命に必要な分割の数を定量的に評価するために使用できます。このプロトコルには、蛍光活性化セルソーター(FACS)とプレートリーダー付きフローサイトメーターに加えて、細胞培養に必要な機器が必要です。ヒトHSPCでのアッセイを実行するための技術プロトコルに加えて、細胞ファミリー25の概念に関連する細胞特性を評価するために必要な統計的テストを含む詳細な分析フレームワークも提供します。このプロトコルは、マウスHSPCコンパートメント26,27を記述するためにすでに正常に使用されています。
以下のプロトコルは、磁気的に富化されたCD34+ 細胞を出発物質28として使用する。このようにして、異なる血液源(例えば、臍帯血、骨髄、末梢血)からヒトHSPCを効率的に染色および単離することができる。CD34- 画分は、異なるタイプの実験対照を設定するためのプロトコルの一部として使用されるため、廃棄しないことが重要です。上記の細胞量と体積は、実験ワークフローと必要性に応じてスケールアップまたはスケールダウンできます。同様に、このプロトコルは、細胞ソーティングおよびフローサイトメトリーのステップに使用される抗体を改変するだけで、異なるタイプの前駆細胞の研究に適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL ポリプロピレン微量遠心チューブ</td><td>vWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ポリプロピレンチューブ</td><td>vWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレンチューブ</td><td>vWR</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル U 底培養プレート&nbsp;</td><td>ファルコン</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>アンチヒト Lin APC</td><td>サーモフィッシャー</td><td>22-7776-72</td><td>希釈 1/40</td></tr><tr><td>ARIA III</td><td>BD</td><td></td><td>96ウェルプレートの個々の細胞を選別できる任意のFACSソーターと交換可能</td></tr><tr><td>カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル (CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>C34570</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trace Violet (CTV)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>コンペンセーションビーズ&nbsp;</td><td>BD</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ</td><td></td><td>11320033Thermo</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Scientific</td><td>J62948-36</td> 滅菌<td>水で溶液0.5 Mを調製</td></tr><tr><td>FCブロック FCブロック Fc1.3216</td><td>BD</td><td>564220</td><td>希釈 1/50</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ダッチャー</td><td>S1900-500C</td><td>バッチ S00CH</td></tr><tr><td>フロージョ v10.8.1</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD10 PerCP-5.5、クローンHI10a</td><td>Biolegend</td><td>312216</td><td>希釈 1/20</td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD123 BUV395、クローン 7G3</td><td>BD</td><td>564195</td><td>希釈 1/15</td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD34 APC-Cy7、クローン 581</td><td>バイオレジェンド</td><td>343513</td><td>希釈 1/40</td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD38 BV650、クローン HB7</td><td>バイオレジェンド</td><td>356620</td><td>希釈 1/40</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD45RA AF700、クローンHI100</td><td>BD</td><td>560673</td><td>希釈1/20</td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD45RA PE-Cy7、クローンHI100</td><td>BD</td><td>560675</td>希釈<td>1/20</td></tr>マウス<tr><td>抗ヒトCD90 PE、クローン5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>希釈1/20</td></tr>リン酸<tr><td>緩衝生理食塩水(PBS) 1X</td><td>Life Technologies</td><td></td> 10010001 <td></td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌 12x75 mm 円錐形ポリプロピレン チューブ</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZE5&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td></td><td>プレートリーダーを装備した任意のフローサイトメトリーアナライザーと交換できます</td></tr><tr><td>Laboratory prepared</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cell培養培地</td><td></td><td></td><td>特定の実験によって異なります。毎日新鮮なものを準備し、+4°Cで保管します。C 使用まで</td></tr><tr><td>DMEM + 10% FBS</td><td></td><td></td><td>無菌状態で保存可能、 +4 °;Cは1年まで。500mLを調製するには、450mLに50mLのFBSを添加します DMEM</td></tr><tr><td>PBS 1X + EDTA 0.1%</td><td></td><td></td><td>は、室温で無菌状態で最長1年間保存できます。500 mLを調製するには、3.42 mLのEDTA 0.5 Mを500 mL PBS 1X</td></tr><tr><td>染色緩衝液</td><td></td><td></td>に加えて<td>、+4°Cで滅菌状態で保存できます。Cは1年まで。500 mLを調製するには、2 mLのEDTA 0.5 Mと1 mLのFBSを500 mL PBS 1Xに加えます</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

同じ細胞の表現型と運命を同時に評価できる技術はほとんどありません。表現型を特徴付けるために使用されている現在のプロトコルのほとんどは、大規模なデータセットを生成することはできますが、目的の細胞の破壊を必要とし、その機能的運命を評価することは不可能です。したがって、造血のような不均一な生物学的分化システムは説明が困難です。細胞分裂追跡色素に基づいて、我々はさらに、多くの単一造血前駆細胞の親族関係、分裂数、および分化状態を同時に決定するためのプロトコルを開発しました。このプロトコルは、様々な生物学的供給源から単離されたマウスおよびヒト造血前駆細胞の ex vivo 分化能の評価を可能にする。さらに、フローサイトメトリーと限られた数の試薬に基づいているため、比較的安価な方法で、シングルセルレベルで大量のデータを迅速に生成できます。また、堅牢な統計フレームワークと組み合わせたシングルセル解析用の分析パイプラインも提供しています。このプロトコルは、単一細胞レベルでの細胞分裂と分化のリンクを可能にするため、対称的および非対称的な運命コミットメント、自己複製と分化のバランス、および特定のコミットメント運命の分裂数を定量的に評価するために使用できます。全体として、このプロトコルは、単一細胞の観点から、造血前駆細胞間の生物学的差異を解明することを目的とした実験デザインに使用できます。

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

造血前駆細胞の機能性を迅速に評価する方法はほとんどありません。このプロトコルは、最初の細胞分裂が細胞の運命とコミットメントに与える影響を測定します。このプロトコルにより、複雑で広範な操作を必要とせずに、単一細胞レベルで高スループットで分裂と分化を同時に測定できます。この方法は、培養中に維持できるあらゆる造血集団に適しています。そのため、がん生物学、免疫学、発生生物学に簡単に適用できます。まず、250マイクロリットルのCD34+画分を4本の15ミリリットルのポリプロピレンチューブに均等に分注します。テキスト原稿に記載されているようにチューブにラベルを付けます。250マイクロリットルのCD34フラクションを別の4本の15ミリリットルのポリプロピレンチューブに分注し、チューブにラベルを付けます。CFSE高およびCSFE低溶液をテキスト原稿に記載されているように準備します。CFおよびCVチューブに250マイクロリットルのCFSE高溶液、VCチューブに250マイクロリットルのCFSE低溶液を、ウシ胎児血清(FBS)を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)250マイクロリットルをVIチューブに追加します。細胞色素中の細胞懸濁液の効率的な混合を確実にするために、チューブを90度傾け、CFSE溶液をチューブ壁に堆積させます。次に、チューブを垂直に保持し、3〜4回混合して、CFSE溶液と再懸濁された細胞との迅速な混合を確実にします。懸濁液を摂氏37度で8分間インキュベートします。インキュベーション後、10%FBSを含む5ミリリットルのDMEMを加え、チューブを摂氏37度で5分間置きます。チューブを300 Gで5分間回転させます。ペレットを乱すことなく吸引によって上清を除去し、5ミリリットルのPBS、ETDAでペレットを洗浄します。チューブを再度回転させ、上清を廃棄してから、ペレットを40マイクロリットルのPBS、ETDAに再懸濁します。CD34+細胞を染色するには、抗体のマスターミックスを1本の0.5ミリリットルチューブに調製します。抗体マスターミックスから7マイクロリットルを4つのCD34+条件のそれぞれに追加します。CD34+細胞のビーズにはそれぞれ約500マイクロリットル、CD34チューブには1ミリリットルを使用して、細胞を染色バッファーに再懸濁します。セルの並べ替えでは、ドットプロット図を作成してゲーティング戦略を設定します。まず、FSCA対SSCAドットプロットでセルを視覚化し、ポリゴンゲーティングツールをダブルクリックして、側方散乱の低い母集団を選択します。この新しく作成されたゲートに Cells というラベルを付けます。次のドットプロット、FSCA対FSCHで、プロットを右クリックし、ドロップダウンメニューからゲートセルをクリックして選択します。同じゲーティングツールを使用して、2つの軸間の対角線上のタイトな母集団を選択します。このゲートに単一セルというラベルを付けます。3番目のドットプロットでは、APC対FSH-Hは、集団単一細胞を表示し、APC系統の発現に対して陰性の細胞をゲートします。この新しく作成された母集団に [系列] ネガティブというラベルを付けます。4番目のプロットCFSE対CTVでは、母集団系統陰性を表示し、色素の組み合わせごとに1つずつ、合計4つの別々のゲートを作成します。ゲートVIを例として示します。5番目と6番目のプロットを使用して、目的の先祖を特定します。5番目のプロットでCD34 + CD38集団とCD34 + CD38 +を寛大にゲートします。次に、6番目のプロットでCD34+CD38集団を選択し、LMPP、HSC、およびMPPの3つのゲートを描画します。CD34+フラクションを実行し、シングルセルゲートに少なくとも5, 000のイベントを記録します。色素の組み合わせごとにゲートを調整し、均質な集団を選択するためにタイトなゲートを設定します。実験ソートレイアウトを使用してプレートソートテンプレートを準備します。CD34という名前のウェルには、CF、CV、VC、VIゲートでソートされた5, 000〜10, 000個の細胞が含まれています。バルクウェルには、ゲートCD34+CD38でソートされた500個の細胞が含まれています-シングルセルウェルには、ウェルごとに細胞分裂色素の組み合わせごとに1つのイベントしか含まれていないため、ウェルあたり合計4つのイベントが含まれています。次に、CD34-CFを収量純度モードでソートすることから始めます。[取得]ボタンをクリックしてから、[並べ替え]ボタンをクリックします。[取得] をクリックし、[並べ替え] ボタンをクリックして、純度グレードとして 0160 にチェックマークを付けていることを確認します。最後に、目的の細胞をウェルごとに1つのセルを単一細胞の純度でソートし、[インデックスソート]オプションがオンになっていることを確認します。プレートを300 Gで5分間遠心分離し、フードの下でプレートをペーパータオルの上で急速に反転させて上清を取り除きます。8マイクロリットルの静置バッファーをウェルA1からA4に加え、続いて8マイクロリットルの混合物を他のウェルに加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり100マイクロリットルの染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。遠心分離して上清を除去してから、細胞を85マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁します。専用のテンプレートを使用して取得モードでフローサイトメーターの分析を開始し、カスタムをクリックします。リストから目的の蛍光色素を選択したら、少なくとも1つの細胞を含むウェル数に対して補正したプレートテンプレートに従ってプレートセットアップを設定します。[攪拌]オプションにチェックマークを付け、取得量制限として100マイクロリットルを選択します。次に、取得速度を毎秒1マイクロリットルに上回らないように設定し、低速では1ウェルあたりの分析総量が改善されます。代表的なゲーティングの場合は、異なるバルクウェルを1つのファイルに連結します。[母集団の連結]オプションをクリックした後、[パラメータ]メニューから[すべての補正されていないパラメータ]を選択し、[連結]をクリックします。連結されたファイルをワークスペースにアップロードし、ドラッグアンドドロップで補正マトリックスを適用します。CV と VC のセルラベルには、変換された値が必要です。[ツールとパラメータの派生]をクリックして、変換された値を取得します。指定した数式を数式ボックスに貼り付けます。ヒストグラムプロットとして各色に個別にゲーティングを適用します。CF と VI の場合は、それぞれ X 軸に CFSE-A と CTV-A を設定します。CVとVCの場合、X軸に新しく導出されたパラメータを設定し、各ピークに対応するゲートを設定します。個々の単一セルウェルにゲーティングを適用します。解析されたすべてのウェルに派生パラメータを追加してください。各ウェルの各カラーゲートを手動で検証して、特定のピークに誤って割り当てられているイベントを検出します。細胞培養後のフローサイトメトリー解析では、細胞の表現型とともに個々の細胞の親族関係を確立するための正確なゲーティングが必要です。ピークの定義と割り当ては、フローサイトメトリー解析の重要な側面です。ヒストグラムには、複数のピークに広がるファミリーの 2 つの例、2 つの類似した強度ピークの 1 つ、および 2 つの異なる強度ピークを持つファミリの 2 つの例が表示されます。HSCとMPPについて72時間後に実行された2つの別々の実験について、さまざまな種類のデータ表現と統計的検定がここに示されています。条件HSC分化のヒートマップは、細胞運命と細胞分裂の両方において、異なる細胞ファミリーを表します。HSCとMPP由来の細胞ファミリーの運命を比較したヒストグラムを以下に示す。両方の細胞タイプについて、条件GTと条件分化の比較が、MPPに対して実行された統計的検定とともに表示されます。世代ごとの細胞ファミリーの割合と、最初の分裂の運命における対称性または非対称性のタイプを比較するヒストグラムがここに示されています。MPPの世代ごとの運命の分布と条件の差別化を以下に示します。この手順では、適切なゲーティング戦略を設定するために、細胞を一括で分離する必要があります。したがって、少なくとも10, 000個の細胞で染色を開始することをお勧めします。この方法を生細胞が想像するような連続測定と組み合わせることは、2つを組み合わせることで細胞動態の初期の前駆細胞の詳細な説明を提供できるため、非常に強力です。このアプローチは、ホプキンス研究所によってT細胞生物学のために最初に開発されました。血液幹細胞に適応したこのバージョンは、現在、癌および幹細胞生物学に拡大しています。

simultaneous-assessment-kinship-division-number-phenotype-via-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

このプロトコルは、細胞選別による幹細胞の事前精製なしに造血幹細胞/前駆細胞機能を研究するための競争力のあるマウス骨髄移植実験を設定するための段階的なガイドラインを提供します。...

競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。...

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。...

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。...

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC...

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々...

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

学ぶ フローサイトメトリーによる造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価法。単一細胞レベルで細胞運命と分化を高スループットに解析し、がん生物学や免疫学の研究に応用可能です。

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

さらに動画を探す

フローサイトメトリーによる造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価