一本鎖DNA免疫蛍光法を用いた卵巣癌細胞の複製ストレスの定量化(英語)
2023年2月10日
ここでは、細胞内の一本鎖DNAのレベルを定量するための免疫蛍光ベースの方法について説明します。この効率的で再現性のある方法は、いくつかの卵巣癌に共通する特徴である複製ストレスを調べるために利用できます。さらに、このアッセイは自動分析パイプラインと互換性があり、効率がさらに向上します。
私たちのプロトコルは、さまざまな細胞株における複製ストレスのマーカーである一本鎖DNAを定量するための非常に効率的で再現性のある方法を提供します。さらに、そのシンプルさにより、高スループットのアプリケーションと画面が可能になります。特に、この方法は、いくつかの卵巣癌の特徴である複製ストレスの迅速な定量化を可能にする。
また、ホストの自動分析ソフトウェアにも適しており、効率をさらに向上させます。一本鎖DNAは現在、DNA修復経路を標的とする化学療法への応答のバイオマーカーとして積極的に検討されています。したがって、この方法はそのシナリオに非常に適しています。
複製ストレスは、卵巣癌の文脈またはBRCA1、BRCA2欠損癌を超えて存在します。したがって、この方法は、他の幅広い細胞型または疾患の状況に適用することができる。まず、直径12mmのオートクレーブ処理したカバースリップとポリリジン溶液を50ミリリットルのコニカルチューブに加えてポリリジンコーティングされたカバースリップを作り、ロッカーに15分間置きます。
組織培養フード上で溶液を吸引する。滅菌水を加えてカバースリップを洗い、カバースリップが入っているチューブをロッカーに5分間戻します。カバースリップを3回洗浄した後、チューブから水を吸引し、カバースリップを滅菌皿に広げます。
残りの水を吸引し、組織培養フード内で1時間、または水滴がなくなるまで乾燥させます。乾いたら、皿をパラフィルムで密封し、摂氏4度に置きます。抽出前ステップ中にカバースリップから細胞が剥離するのを防ぐために、ポリリジンコーティングされたカバースリップを24ウェルプレートの各ウェルに1つずつ配置します。
OVCAR3細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、プレートから培地を吸引し、5〜7ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。プレートからPBSを吸引します。PBSを吸引した後、1ミリリットルの0.25%トリプシンを加え、摂氏37度のインキュベーターに8〜10分間、または細胞がプレートの底から浮き上がるまで皿を置きます。
5〜10ミリリットルの培地で細胞を収集し、細胞懸濁液を円錐形のチューブに加えます。標準的な手順を使用して、血球計算盤で手動で細胞を数えます。次に、細胞懸濁液を希釈し、3つの集団の後に70〜80%のコンフルエント性をもたらす数を得る。
24ウェルプレートのウェルに入れたポリリジンカバースリップに1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、標準条件下で培養液中で細胞を増殖させます。1つの集団倍増後、プレートから既存の培地を吸引し、その後の2つの集団倍増のために10マイクロモルIdUで細胞をパルスします。細胞を回収するには、氷上で5分間、氷冷した0.5%PBSTxで培地を交換します。
細胞を固定するには、PBSTxを吸引し、室温で3%パラホルムアルデヒドで細胞を15分間インキュベートします。PBSで3〜4回洗浄した後、さらに使用するまで固定セルを摂氏4度に保ちます。固定後、氷上で0.5%PBSTxを5分間使用して細胞を透過し、カバースリップ全体を確実に覆います。
室温で1ミリリットルの0.2%PBSTで細胞を3〜4回洗浄した後、PBSTを吸引し、PBS製の5%BSAを使用して室温で30分間サンプルをブロックします。免疫染色のために、平らな底のタッパーウェアの上に濡れたペーパータオルを置くことによって統一された部屋を準備してください。24ウェルプレートの蓋をパラフィルムで覆います。
加湿チャンバーに入れ、プレートの蓋にカバースリップを置きます。カバースリップの上部に60マイクロリットルの希釈抗BrdU一次マウス抗体を追加します。あるいは、抗体の乾燥を減らし、使用量を減らすには、希釈した抗体を一滴パラフィルムの上に置き、カバースリップをその上にひっくり返します。
その後、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、一次抗体を吸引します。カバースリップを24ウェルプレートに戻し、0.2%PBSTで4回洗浄します。
前述のようにカバースリップに希釈した二次抗体を加え、室温で暗所で1時間インキュベートします。顕微鏡スライドにラベルを付け、DAPI封入剤でスライドにカバースリップを取り付けます。封入剤を硬化または硬化させる必要がある場合は、スライドを室温で暗所に24時間保管してください。
0.5ミリモルのヒドロキシ尿素で未処理および処理した細胞に由来する核を染色し、DAPIおよびIdUチャネルで識別できるようにしました。これらの画像の分析は、各核の病巣の数を定量化することからなる。病巣の数は、複製ストレスの程度に比例する。
IdUパルスの時間は、より長いまたはより短い倍加期間で変化する可能性があるため、選択した細胞株の倍加時間を考慮することが重要です。あるいは、細胞に複製プロテインAをプローブして結果を確認し、細胞内のさまざまな複製ストレス応答を評価することもできます。この技術は、単一のひずみDNAの蓄積を調べるために、任意のDNA損傷誘発剤と組み合わせて多くの細胞株に使用されます。
したがって、この方法は広くアクセス可能で適用可能です。
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概要
本記事では、さまざまな細胞株における複製ストレスのマーカーである一本鎖DNAを定量するための、極めて効率的で再現性の高い手法を紹介します。この手法は特に卵巣がんの研究に適しており、ハイスループットなアプリケーションにも対応しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- がん研究
背景
- 一本鎖DNAは複製ストレスのマーカーである。
- 複製ストレスは、いくつかの卵巣癌に共通して見られる特徴である。
- 本手法により、複製ストレスの迅速な定量が可能となる。
- 一本鎖DNAは、化学療法の奏効を予測するバイオマーカーとして研究されている。
研究の目的
- 一本鎖DNAを定量化する方法を提供すること。
- がん研究における複製ストレスの解析を容易にすること。
- ハイスループットアプリケーションにおける効率を向上させること。
使用方法
- 免疫蛍光法に基づく定量化。
- 自動解析ソフトウェアとの互換性。
- さまざまな細胞株への適用。
- ハイスループットスクリーニング能。
主な結果
- 本手法は効率的であり、再現性が高い。
- 複製ストレスの迅速な定量が可能である。
- 自動解析パイプラインとの互換性がある。
- 一本鎖DNAは、化学療法への反応を示す有望なバイオマーカーである。
結論
- この手法は癌研究において非常に有用です。
- 卵巣癌における複製ストレスの研究を支援します。
- このアプローチにより、DNA定量アッセイの効率が向上します。
よくある質問
産業界への適用可能性
免疫蛍光法を用いて一本鎖DNA（ssDNA）を定量することで、卵巣がんやその他の癌における重要な脆弱性である複製ストレスを、堅牢かつ再現性のあるリードアウトとして得ることができます。この手法により、DNA損傷応答の迅速かつハイスループットな評価が可能となり、初期探索およびトランスレーショナルリサーチにおける予測の信頼性が向上します。また、自動解析パイプラインとの互換性があるため、ポートフォリオ全体でのターゲット検証やメカニズムのデリスキングに向けた、拡張性のあるアセットとして活用できます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 複製ストレスマーカーを直接定量化することで、機能的ターゲットのバリデーションを可能にします。
- 疾患関連モデルにおけるDNA損傷応答経路を明確にすることで、メカニズム面でのリスク低減をサポートします。
- ssDNAの蓄積と治療仮説を関連付ける際の予測的信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- DNA修復を標的としたハイスループットな薬剤および遺伝子スクリーニングのための、バリデート済み細胞ベースシステムの作製。
- 信頼性の高い化合物評価に不可欠な、標準化された定量的なssDNAリードアウトの提供。
- 自動イメージングおよび解析プラットフォームと互換性のある、再現性の高いアッセイワークフローの実現。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ssDNA定量法を、化学療法反応における最新のトランスレーショナルバイオマーカーと整合させます。
- 多様な細胞および疾患モデルにおける、探索から前臨床検証までの継続性をサポートします。
- DNA修復を標的とした治療プログラムを推進するための、リスク調整済みデータを提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この免疫蛍光法を用いたssDNA定量法は、初期の探索からリード化合物の同定、および前臨床研究に至るまで統合的に活用でき、仮説検証とトランスレーショナルなバイオマーカー開発の両方を支援します。
- 探索生物学：レプリケーションストレスおよびDNA修復機構の仮説駆動型の解析を可能にします。
- スクリーニング：スケーラブルなスクリーニングキャンペーンに向けた、定量的で再現性のあるssDNA測定を提供します。
- 分析：客観的でハイスループットなデータ生成のための、自動画像解析パイプラインをサポートします。
- トランスレーショナルリサーチ：探索的な知見を、腫瘍学における前臨床バイオマーカー戦略へと結びつけます。
- 企業の再利用：多様な細胞型やDNA損傷条件下で幅広く適用可能な、標準化されたワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： DNA損傷応答研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： R&Dチーム全体で標準化され、拡張可能かつ再現性のあるssDNA定量法を提供します。
- 戦略的価値： 強固なターゲットおよびバイオマーカーのバリデーションを可能にし、go/no-go判断と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： DNA修復をターゲットとした資産およびトランスレーショナルプログラムのリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 細胞培養、免疫蛍光染色、および定量的画像解析の専門知識が必要です。
- 蛍光顕微鏡および互換性のある自動解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- アッセイ条件とデータ解釈について、チーム間での標準化が求められます。
- 細胞の倍加時間に留意することで、さまざまな細胞株やDNA損傷剤に適応可能です。
- 再現性のある結果を得るには、強固な抗体バリデーションと画質が不可欠です。
