Name: オープンソースのデジタル画像相関 による 腱の局所組織ひずみの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぼう、オープンソースのデジタル画像相関法を用いて腱の局所組織ひずみを測定する手法です。アキレス腱を用いたこの計算手法は、腱の機械的挙動と細胞のリモデリングを理解する上で有用です。

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この研究は、国立衛生研究所(R21 AR079095)と国立科学財団(2142627)によって資金提供されました。

この研究は、ペンシルベニア州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.ティッシュの準備
<ol><li>このプロトコルでは、生後2〜4か月のオスのC57BL / 6マウスからアキレス腱を採取します。 注:マウスや他の小動物とは異なる腱や靭帯を使用することもできます。<ol><li>アキレス腱の表在性皮膚を切開して、足底腱と周囲の結合組織を露出させます。次に、外科用ブレードを使用してそれらを取り外します。</li>
		<li>露出したヒラメ筋と腓腹筋を後肢から分離し、手術用ブレードでアキレス腱から慎重にこすり落とします</li>
		<li>回転工具のカッティングホイールアタッチメントを使用して、踵骨を足の残りの部分から分離します。</li>
	</ol></li>
	<li>5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン(DTAF)と0.1 M重炭酸ナトリウムバッファーの5 μg/mL溶液1.5 mLで、室温の回転ミキサーで20分間組織を染色します。この溶液は、組織内のタンパク質(例えば、細胞外マトリックス)を染色する。 注: この 20 分間の間に、手順 1.3 を完了する必要があります。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のDRAQ5の1:1,000溶液を調製して、核を染色します。ボルテックスミキサーを使用して溶液を均質化します。</li>
	<li>ステップ1.2の20分間のインキュベーション期間の後、組織をDTAF溶液からDRAQ5溶液に移し、暗所で室温で10分間インキュベートします。</li>
</ol>2. 腱負荷と画像取得
注:このプロトコルには、共焦点顕微鏡の上に取り付けることができる引張装置が必要です。この研究では、PetersonとSzczesny13 によって記述された微小引張装置が使用されました。
<ol><li>腱を引張荷重装置のグリップに配置します。グリップをローディングデバイスに取り付ける前に、デジタルキャリパーを使用して、踵骨アタッチメントと反対側のグリップの間の距離を測定します。この距離が腱ゲージ長です。<ol><li>または、腱を挿入する前にグリップをローディングデバイスに取り付け、接触させてゼロ変位モーターの位置を定義します。腱を挿入した後のモーターの変位は、潜在的により正確なグリップツーグリップゲージ長を提供する可能性があります。</li>
	</ol></li>
	<li>組織の水分補給を維持するためにPBSを含むローディングデバイスにグリップを取り付けます。アルゴリズムのx系統とyひずみの出力が腱の軸と一致するように、腱を顕微鏡画像のx軸またはy軸のいずれかにできるだけ合わせます。 注:この研究では、腱はx軸に整列していました。腱を画像軸と完全に整列させることが不可能な場合は、標準ひずみ変換式14を使用して、アルゴリズムのxひずみおよびyひずみ出力を腱の縦軸/垂直軸に整列するように変換できます。</li>
	<li>腱に1 gの張力をかけ、必要に応じて周期的な負荷を加えてサンプルを事前調整します。このプロトコルでは、研究の目的は組織材料特性を測定するのではなく、測定された局所組織株を検証することであったため、事前調整は使用されていません。荷重履歴に依存するマクロスケールの材料特性の測定に関心がある場合は、事前調整をお勧めします。プレコンディショニングと回復に続いて、1gのプリロードを再適用します。</li>
	<li>必要に応じて、組織の中央領域で80μm間隔で4本のラインのセットを光退色します(詳細については、Peterson and Szczesny13 を参照してください)。 注:フォトブリーチラインは、ALDICアルゴリズムの測定を検証するために使用され、ALDIC自体を実行するためには必要ありません。線の数と間隔は調整でき、線の位置を選択して、線の明瞭さを低下させるサンプル内のアーティファクトを回避する必要があります。</li>
	<li>グリップの近くの組織の左右の端で光退色手順を繰り返します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡を使用して、1 gのプリロードでDTAFおよびDRAQ5蛍光の体積画像(x、y:1.25 μm/ピクセル、z:2.5 μm/ピクセル)を取得します。</li>
	<li>0.5%/sから2%のひずみでひずみランプを実行します。ひずみ速度と増分ひずみの大きさは調整できることに注意してください。</li>
	<li>組織を10分間リラックスさせます。 注意: 応力緩和の持続時間は、画像取得中にサンプルがほぼ準静的な負荷を受けるように選択する必要があります。応力緩和期間が許容範囲内かどうかを判断するには、応力緩和の最後の1分間の力-時間曲線の傾きを決定し(補足図1)、この傾きに合計イメージング時間を掛けます。この研究では、最大ひずみ増分で加えられた力は5%を超えて変化することはありませんでした。</li>
	<li>変形後の組織の別の体積画像を撮影します。</li>
	<li>目的の最終ひずみに達するまで、手順2.7〜2.9を繰り返します。この論文では、12%の最終ひずみ値を選択しました。</li>
</ol>3. 画像処理
<ol><li>ImageJ またはフィジーを使用して、DRAQ5 (核) チャネルの各体積イメージの最大 Z 投影を作成します。これは、ALDICの2D斑点画像として機能します。</li>
	<li>最大強度の Z 投影を.tiffファイルとして保存し、次の命名規則に従って名前を付けます。<ol><li>イメージ名の最初の文字として数字を使用します。</li>
		<li>この番号は、ひずみ解析中に画像が考慮される順序に対応させます。たとえば、最初の画像は 1 で始まり、2 番目の画像は 2 で始まる必要があります。異なる数値を選択できますが、順番に増やす必要があります。命名規則の例は、"0_Experiment1_MaxZProjection" です。</li>
	</ol></li>
	<li>名前を変更したすべての最大強度 Z 投影法をフォルダーに保存します。</li>
</ol>4. 光漂白ライン解析コードのインストールと応用
注:これらの手順は、フォトブリーチラインを使用してALDICアルゴリズムの精度を確認する場合にのみ必要です。このコードは、局所組織ひずみを、フォトブリーチされたラインセット内の各フォトブリーチライン間の距離の平均正規化変化として計算します。この研究では、次に、すべての光退色ラインセット(つまり、中央と左/右端)の平均局所値を平均して、各サンプルの単一の平均局所組織ひずみ値を決定しました。次に、この値を使用してALDICアルゴリズムの精度を推定しました。
<ol><li>GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) から "PBL コード" フォルダーをダウンロードし、すべてのコンテンツを MATLAB の作業ディレクトリに移動します。</li>
	<li>"Micro_Mech_Template.m" MATLAB スクリプトを開きます。<ol><li>[実行]を押して、ボリューメトリック画像を含む画像ファイルの1つを選択します。ボリューメトリック イメージは、.lsm、.tiff、.nd2 のいずれかのファイル形式にすることができます。</li>
		<li>ソフトウェアは自動的にフォルダ内のすべての画像をロードし、基準体積画像の投影画像を表示します。プロンプトが表示されたら、左 クリックして 、サンプルの左端と右端をトレースするマルチポイントラインを作成します。 右クリック して行を終了します。入力が処理され、エッジが正しい場合は、[ OK] を押して結果を受け入れます。</li>
		<li>プロンプトが表示されたら、サンプルを横切るランダムな対角線を参照線として描画します。</li>
		<li>作成したフォトブリーチングラインの数を入力し、マルチポイントラインでフォトブリーチングラインをトレースします。</li>
		<li>結果が許容できる場合は、それを受け入れます。結果が誤っている場合は、調整して再処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>すべての画像に対して手順 4.2 を繰り返し、トレースされた線のすべての画像を 1 つのフォルダーに移動します。</li>
	<li>スクリプト "Micro_Mech_Strain.m" を開きます。<ol><li>[実行]を押してコードを実行し、フォトブリーチされた線がトレースされている保存済み画像の1つを選択します。</li>
		<li>画像を選択したら、選択した付随画像が正しいことを確認し、 OKを押します。</li>
	</ol></li>
</ol>5.デジタル変換された画像の作成
注:これらの手順は、デジタル変換された画像を使用してALDICアルゴリズムの精度を確認する場合にのみ必要です。これらの画像は、参照画像を人為的に変換することにより、既知の大きさの均質な2Dひずみ場をシミュレートします。
<ol><li>GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) からコード "Digital_strain.m" をダウンロードします。</li>
	<li>コードを開いて実行します。</li>
	<li>プロンプトが表示されたら、最大適用ひずみ、適用ひずみ増分、およびポアソン比に必要な値を挿入します。 OKを押します。 注:この実験では、最大適用ひずみは0.1(10%)、適用ひずみ増分は0.02(2%)、ポアソン比1を使用し、これは腱引張試験の実験データと一致しています15,16。このコードでは、埋め込まれたMATLAB関数のインワープと入力値(ひずみ増分、ポアソン比など)を使用して、デジタル変換された画像を作成します。</li>
	<li>プロンプトが表示されたら、変形されていない参照イメージを選択します。</li>
	<li>ひずみ増分ごとに、参照画像と変換後の画像のオーバーレイが表示されます。変換された画像は、「デジタル変換X%ひずみ」というタイトルのディレクトリに保存されます(Xはひずみ増分)。</li>
</ol>6. ひずみ計算・検証コードのインストールと応用
<ol><li>GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) から "ひずみ計算と検証コード" フォルダーをダウンロードし、すべての内容を MATLAB 作業ディレクトリに移動します。</li>
	<li>ヤンとバッタチャリヤ12に従ってmex C / C ++コンパイラをインストールします。手順を以下にまとめます。<ol><li>MATLAB コマンド ウィンドウに「mex -setup」と入力して Enter キーを押して、mex C/C++ コンパイラがインストールされているかどうかを確認するために MATLAB をチェックします。</li>
		<li>コンパイラーがサポートされていない、または存在しないことを示すエラーが表示された場合は、ステップ 6.3 およびステップ 6.4 に進みます。</li>
		<li>エラーが存在しない場合は、手順 6.5 に進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>mex C/C++ コンパイラをダウンロードするには、"https:/tdm-gcc.tdragon.net/" にアクセスし、TDM-gcc コンパイラを選択します。</li>
	<li>ダウンロードしたコンパイラを既知の場所にインストールします。</li>
	<li>MATLAB コマンド ウィンドウに戻り、" setenv("MW_MINGW64_LOC","[ここにインストール パスを入力してください]")" と入力します。 たとえば、"setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")" などです。このコマンドが正常に実行されると、mex コンパイラが正しくインストールされます。</li>
	<li>「main_aldic.m」関数スクリプトを入力し、ステップ 6.5 で実行したコマンドと一致するように 22 行目を変更します。</li>
	<li>スクリプト "Strain_calc_and_validate.m" を開きます。</li>
	<li>[実行] を押して、画像解析を開始します。</li>
	<li>プロンプトが表示されたら、必要に応じて ALDIC パラメーターの値を変更します。 注: ウィンドウ サイズは、サブセット サイズの 0.25 倍から 1 倍にする必要があります。パラメータの選択の詳細については、オンラインユーザーマニュアルを参照してください:(https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital _Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual)。<ol><li>この研究では、次の値を使用しました。 サブセットサイズ(ピクセル): 20 ウィンドウサイズ(ピクセル): 10 ALDICを解く方法:有限差分(1) 並列計算は使用されなかった (1) 初期推測の計算方法: 画像ピラミッドに基づくマルチグリッド検索 (0)</li>
	</ol></li>
	<li>プロンプトが表示されたら、「はい」チェックボックスを選択すると、アルゴリズムは、目的の変数のコレクション(xひずみ、yひずみ、せん断ひずみ、不良領域など)の平均値、標準偏差、および2Dマップを自動的に保存します。保存する変数を選択し、[ OK]を押します。</li>
	<li>プロンプトが表示されたら、必要に応じてパラメーターを変更します。<ol><li>この実験では、次の値を使用しました。 ひずみを計算するための周辺点(numP):12 不良領域識別の相関係数 (corr_threshold): 0.5 不良領域分析のサブ領域サイズ (ピクセル) (サブサイズ): 32</li>
	</ol></li>
	<li>プロンプトが表示されたら、名前を変更した最大強度 Z 投影を含むフォルダーを選択します。ソフトウェアは自動的にインクリメンタルALDICを実行して、変形画像のひずみ場を決定することに注意してください。すなわち、各変形画像は、次の変形画像の新しい「参照」画像として機能する。これにより、各変形画像が元の(0%ひずみ)参照画像と比較される累積ALDICを実行する場合と比較して、結果の精度が向上します(補足図2)。累積解析を実行するには、画像を読み込みますが、元の参照画像と目的の変形画像のみを選択します。 注: 正規ひずみは λ - 1 として計算されます (λ は組織の伸びです)。組織の伸張は、x方向とy方向にそれぞれN = [1 0]Tまたは[0 1]T、およびC = F F F(FはALDICアルゴリズムによって出力された各データポイントを囲む「numP」ポイントを使用して計算された変形勾配)に従って<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64921/64921eq01.jpg" style="margin: auto;">計算されます。せん断ひずみは次のように<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64921/64921eq02.jpg" style="margin: auto;"><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64921/64921eq03.jpg" style="margin: auto;">計算されます。</li>
	<li>プロンプトが表示されたら、左クリックして 4 点ポリゴンを作成し、ひずみを測定するための関心領域を定義します。左上隅のポイントから始めて、後続のポイントを時計回りに割り当てます。 注: MATLAB ワークスペースに保存されている変数「ストレージ」には、平均 x ひずみ、x ひずみ標準偏差、平均 y ひずみ、y ひずみ標準偏差、平均せん断ひずみ、せん断ひずみ標準偏差、および不良領域の割合のすべての値が含まれています。不良領域は、ステップ6.13で選択された関心領域内の相関係数分析に従って定義されます。フォルダ「NuclearTrackingResults」(555行目と556行目を調整することで名前を変更できます)には、手順6.10で指定されたすべてのプロットが保存されます。このフォルダには、ステップ6.10で指定されたすべての平均と標準偏差を格納する「Results」という名前のスプレッドシートファイルも含まれています。</li>
</ol>

<ol><li>Devkota, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributing+a+fixed+amount+of+cyclic+loading+to+tendon+explants+over+longer+periods+induces+greater+cellular+and+mechanical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses.</a> Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).</li>
<li>Sun, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycle-dependent+matrix+remodeling+gene+expression+response+in+fatigue-loaded+rat+patellar+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).</li>
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<li>Luyckx, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+correlation+as+a+tool+for+three-dimensional+strain+analysis+in+human+tendon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7(2014).</li>
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<li>Szczesny, S. E., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfibrillar+shear+stress+is+the+loading+mechanism+of+collagen+fibrils+in+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon.</a> Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).</li>
<li>Han, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-+to+microscale+strain+transfer+in+fibrous+tissues+is+heterogeneous+and+tissue-specific%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific.</a> Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).</li>
<li>Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+open-source%2C+low-cost+bioreactor+for+load-controlled+cyclic+loading+of+tendon+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505(2022).</li>
<li>Gatt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Poisson%27s+ratios+in+tendons%3A+An+unexpected+mechanical+response%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response.</a> Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).</li>
</ol>

すべての著者は、開示する利益相反はありません。

この論文の目的は、引張荷重下で腱の2Dひずみ場を測定するためのオープンソースの検証済み方法を提供することでした。ソフトウェアの基礎は、公開されているALDICアルゴリズム12に基づいていました。このアルゴリズムは、インクリメンタル(累積)ひずみ解析の機能が追加され、より大きなMATLABコードに埋め込まれました。次に、この適応アルゴリズムを腱の引張試験に適用し、その精度を2つの異なる技術(すなわち、デジタル変換された画像と光退色の線を使用したひずみ測定)によって評価しました。さらに、真のひずみ値の知識を必要とせずに、任意のサンプルのALDIC測定の精度を評価する機能が追加されました。
デジタル変換された画像の分析により、アルゴリズムは、腱サンプルのひずみの大きさが小さいため、実際のマウスアキレス腱の引張試験では評価できなかった、非常に少ない誤差で最大10%のひずみを正確に測定できることが実証されました。それにもかかわらず、ALDICによってマウスアキレス腱で計算された株と光漂白ラインを使用して測定された株を比較すると、ALDIC技術の...

腱は、機械的負荷に応答して適応および変性する機械感受性組織です1,2,3,4。腱細胞の生物学において機械的刺激が果たす役割のために、腱細胞が負荷中に天然の組織環境で経験する株を理解することに大きな関心があります。腱の局所組織株を測定するために、いくつかの実験的および分析的技術が開発されている。これらには、スペックルパターンまたはフォトブリーチングライン(PBL)のいずれかを使用した表面ひずみの2D/3Dデジタル画像相関(DIC)分析5,6,7,8、組織内の個々の核の重心間距離の変化の測定9,10、および面外運動と3D変形を考慮した最近のフルフィールド3D DIC法が含まれます11.しかし、これらの手法の精度や感度はごくわずかしか報告されておらず、いずれも公開されていないため、普及・活用は困難である。
この研究の目的は、腱外植片の局所組織株を測定するための検証済みの分析ツールを作成することでした。選択された方法は、YangとBhattacharya12によって開発されたMATLABで書かれた公開されている拡張ラグランジュデジタル画像相関(ALDIC)アルゴリズムに基づいています。このアルゴリズムは、腱サンプルの分析に適合し、デジタル変換された画像に適用し、実際の腱サンプルで測定されたひずみを光退色の線から得られた結果と比較することによって検証されました。さらに、既知のひずみ値や二次測定技術がない場合でも、計算された変位場の精度を確認するための追加機能がアルゴリズムに実装されました。したがって、このアルゴリズムは、腱の局所2D組織ひずみを正確に測定するための非常に有用で適応性のあるツールです。

<table><tbody><tr><td>5-DTAF (5-(4,6-ジクロロトリアジニル) アミノフルオレセイン)、単一異性体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>ノギス</td><td>ミツトヨ</td><td>500-196-30</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>A1R HD</td><td></td></tr><tr><td>コーニング LSE ボルテックスミキサー</td><td>コーニング</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 蛍光プローブ溶液 (5 mM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>62554</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2022b</td><td></td></tr><tr><td>引張荷重装置</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Peterson et al, 2020 で説明されている引張荷重装置。(参照13)&nbsp;</td></tr><tr><td>チューブリボルバーローテーター</td><td>ThermoFisher</td><td>88881001</td><td></td></tr></tbody></table>

オープンソースのデジタル画像相関 による 腱の局所組織ひずみの測定

Measuring Local Tissue Strains in Tendons via Open-Source Digital Image Correlation

腱細胞がその 場で 経験する株と、これらの株が組織のリモデリングにどのように影響するかを理解することには、かなりの科学的関心があります。この関心に基づいて、負荷中に腱外植片内の局所組織株を測定するためのいくつかの分析技術が開発されてきた。ただし、いくつかのケースでは、これらの手法の精度と感度は報告されておらず、どのアルゴリズムも公開されていません。これにより、腱の外植片における局所組織株のより広範な測定が困難になりました。したがって、この論文の目的は、腱外植片の局所組織株を測定するための検証済みの分析ツールを作成することでした。具体的には、公開されている拡張ラグランジュデジタル画像相関(ALDIC)アルゴリズムを、一軸張力下でマウスアキレス腱内の細胞核の変位を追跡することにより、2D株を測定するために適合されました。さらに、計算されたひずみの精度は、デジタル変換された画像を分析することによって、および株を独立した技術(すなわち、光漂白線)から決定された値と比較することによって検証されました。最後に、計算された変位場を使用して参照画像を再構築する手法がアルゴリズムに組み込まれ、既知のひずみ値がない場合のアルゴリズムの精度を評価するために使用できる、または二次測定技術。このアルゴリズムは、0.00015の精度で最大0.1のひずみを測定できます。再構成された参照画像と実際の参照画像を比較する手法は、誤ったデータを持つサンプルを特定することに成功し、良好なデータを持つサンプルでは、変位場の約85%が正確であることを示しました。最後に、マウスのアキレス腱で測定された株は、以前の文献と一致していました。したがって、このアルゴリズムは、腱の局所組織ひずみを正確に測定するための非常に有用で適応性のあるツールです。

実際の組織サンプルのひずみ場を分析する前に、ALDICプロトコルは、マウスのアキレス腱内の核のデジタルひずみ/変換画像を使用して最初に検証されました。具体的には、画像をデジタル変換して、シミュレートされたポアソン比1 15,16で、x方向に2%、4%、6%、8%、および10%の均一なひずみを生成します。次に、ALDICアルゴリズムの精度は、計算された平均ひずみ値を既知のデジタルひずみと比較することによって評価されました。さらに、ひずみ値の標準偏差を評価して、ひずみ場の不均一性を決定しました。ALDICによって計算されたひずみ(インクリメンタル解析を使用)と、デジタル変換された画像に適用された実際のひずみの違いを図1に示します。ALDICソフトウェアによって計算されたx方向の平均ひずみは、一貫して真の適用ひずみを過小評価しており(図1A)、誤差の大きさは大きな適用ひずみとともに増加しました。ただし、大きさ...

この論文では、腱の外植片内の局所的な2D組織ひずみを測定するためのオープンソースのデジタル画像相関アルゴリズムについて説明します。この手法の精度は、複数の手法を使用して検証されており、一般に利用できます。

There is considerable scientific interest in understanding the strains that tendon cells experience in situ and how these strains influence tissue ...

このプロトコルにより、負荷時に腱内の局所組織株の測定が可能になります。腱が機械的にどのように振る舞い、それらの負荷環境に適応するかを理解することは有用です。この技術の主な利点は、使用されるソフトウェアがオンラインで公開されており、真の組織株が不明な場合でも測定精度に関するフィードバックを提供することです。腱の局所組織ひずみを測定することは、腱の変性と修復中に細胞がどのように組織をリモデリングするかを理解するのに役立ちます。この手順を実演するのは、学部生のスタントン・ゴッドシャルと、私の研究室の博士課程の学生であるクリシュナ・ペダプロルです。採取したアキレス腱をDTAFで染色した後、組織をDTAF溶液からDRAQ5溶液に移し、暗空間で室温で10分間インキュベートします。腱を引張荷重装置のグリップに配置します。グリップをローディングデバイスに取り付ける前に、デジタルノギスを使用して、踵骨アタッチメントと反対側のグリップの間の距離を測定します。グリップをPBSを含むローディングデバイスに取り付けて、組織の水分補給を維持します。アルゴリズムのX株とY株の出力が腱軸と一致するように、腱を顕微鏡画像のx軸またはy軸のいずれかにできるだけ合わせます。腱に1グラムの張力をかけます。必要に応じて、組織の中心領域で80ミクロン間隔で4本の線のセットを光退色し、グリップの近くの左右の両端でこのプロセスを繰り返します。各組織領域の線間の距離の変化は、データを検証するために使用できる局所組織株の二次測定値です。次に、共焦点顕微鏡を使用して、1グラムの予負荷でのDTAFおよびDRAQ5蛍光の体積画像を取得します。毎秒0.5%で2%ひずみまでのひずみランプを実行します。ひずみ速度と増分ひずみの大きさは調整できることに注意してください。組織を10分間ストレスリラックスさせた後、変形後の組織の別の体積画像を撮影します。必要な数のひずみ増分に対してこのプロセスを繰り返します。デジタル変換された画像を作成するには、コード digital_strainをダウンロードします。mはGitHubから。ダウンロード後、コードを開いて実行します。プロンプトが表示されたら、OKを押す前に、最大適用ひずみ、適用ひずみ増分、およびポアソン比に必要な値を挿入します。次に、再度プロンプトが表示されたら、変形していない参照画像を選択します。ひずみ増分ごとに、参照画像と変換後の画像のオーバーレイが表示されます。デジタル変換された画像は、デジタル変換されたXパーセントひずみ(Xはひずみ増分)という名前のディレクトリに保存されます。表示された名前のスクリプトを開き、[実行] をクリックして画像解析を開始します。プロンプトが表示されたら、必要に応じて拡張ラグランジュデジタル画像相関またはALDICパラメータの値を変更します。プロンプトが表示されたら、yesチェックボックスを選択して、目的の変数コレクションの平均値、標準偏差、および2Dマップを自動的に保存します。プロンプトが表示されたら、Xひずみ、Yひずみ、せん断ひずみ、不良領域などの目的の変数を選択し、[OK]を押します。次のプロンプトに従って、名前を変更した最大強度 Z 投影を含むフォルダを選択します。ソフトウェアは自動的にインクリメンタルALDICを実行して、変形画像のひずみ場を決定します。プロンプトが表示されたら、左クリックして 4 点ポリゴンを作成し、ひずみを測定するための関心領域を定義します。フォルダ核追跡結果は、行555と556を調整することによって名前を変更することができ、以前に指定されたすべてのプロットを格納します。このフォルダーには、前に指定したすべての平均と標準偏差を格納する results という名前のスプレッドシートも含まれています。デジタル歪み画像を使用して検証した場合、ALDICアルゴリズムは一貫して平均Xひずみを過小評価し、誤差の大きさは加えられたひずみの増加とともに増加しました。Y株もほとんど過小評価されていました。しかし、いずれの場合も、ひずみ誤差の大きさは非常に小さかった。計算されたXひずみとYひずみの標準偏差は、大きさは低いものの、適用ひずみの増加とともに増加した。不良領域解析の結果、累積法で解析したデジタル変換画像において、ひずみ計算が無効である不良領域の数は、ひずみを6%印加した後も一貫して増加し、増分量は1%のままであった。 外れ値として扱われた4つのサンプルのうち1つでは、最大ひずみ増分で画像のほぼ半分が不良であると識別されました。ALDICによって計算されたX株は、PBLから決定されたものよりも大きく、差は0.005以内であり、これはすべてのサンプルで平均化されたPBLデータの標準偏差と同様でした。引張荷重を受けた腱の局所ひずみの大きさと空間分布を決定すると、すべてのサンプルで、Xひずみは一貫して適用されたひずみを下回っていることが示されました。Y方向の平均ひずみはすべての増分でほぼゼロでしたが、標準偏差は高かったです。平均せん断ひずみは、ひずみ増分全体にわたって着実に増加しました。覚えておくべき最も重要な点は、より大きなひずみを加える前に画像を保存することです。保存しないと、イメージは失われ、復元できません。この技術は、腱内の組織ひずみを測定するために特別に検証されていますが、他の多くの動物および人間の組織の機械的生物学および力学への洞察を提供することができます。

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学ぼう、オープンソースのデジタル画像相関法を用いて腱の局所組織ひずみを測定する手法です。アキレス腱を用いたこの計算手法は、腱の機械的挙動と細胞のリモデリングを理解する上で有用です。

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