Name: 尿由来の霊長類人工多能性幹細胞の作製と維持 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶ尿由来細胞から霊長類iPSCを作製・維持する方法。Sendaiウイルスを用いた非侵襲的リプログラミングとfeeder-free培養により、多能性幹細胞研究と再生医療への応用を推進する革新的プロトコルです。

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この作業は、DFG EN 1093 / 5-1(プロジェクト番号458247426)によってサポートされました。M.O.は日本学術振興会海外特別研究員の助成を受けました。すべての図は BioRender.com で作成されました。フローサイトメトリーは、ミュンヘン生物医学センターのコアファシリティフローサイトメトリーの助けを借りて実施されました。京都大学ASHBiの志田誠さんと武藤知世さん、映像撮影のサポートに感謝いたします。

著者は開示する利益相反を持っていません。

iPS細胞は、他の方法ではアクセスできない細胞型を in vitroで生成できるため、貴重な細胞型です。リプログラミングの出発物質として、例えば、線維芽細胞はすべての霊長類種から容易に入手できるわけではないが、本論文は尿由来細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを提示する。これらの細胞は、非滅菌霊長類の尿サンプルからでも、広域スペクトルの抗生物質を培地に補給することにより、非侵襲的な方法で得ることができます。
プロトコルのいくつかの重要なステップは、いくつかの追加の議論の価値があります。まず、非滅菌尿から細胞を単離する場合、汚染のリスクを減らすために、広域スペクトルの抗菌試薬を培地に補給することが重要です。抗生物質の使用にもかかわらず微生物汚染の成長が明らかになった場合は、培養物を廃棄してその領域を消毒することをお勧めします。さらに、私たちの経験では、培養を継続しても、健康に成長する尿細胞は生成されません。第二に、細胞の再プログラムを開始する際には、過剰コンフルエントによるすべての細胞の剥離のリスクを回避し、iPS細胞獲得の可能性を高めるために、異なる数のS...

ヒト霊長類と非ヒト霊長類(NHP)のゲノム比較は、私たちの進化の歴史とヒト特異的形質の進化を理解するために重要です1。さらに、これらの比較は、保存されたDNA配列2を同定することによって、例えば、疾患関連変異体3に優先順位を付けることによって、機能の推論を可能にする。遺伝子発現レベルなどの分子表現型の比較は、ゲノム比較をより適切に解釈し、たとえば細胞表現型の違いを発見するために重要です。さらに、DNAレベルでの比較と同様に、機能的関連性を推測し、したがってヒト内の医学的に関連する変異をより適切に解釈する可能性があります4。これらの比較研究に包括的な分子表現型データを組み込むには、適切な生物学的資源(すなわち、種を超えたオーソログ細胞)が必要です。しかしながら、倫理的および実際的な理由により、特に発生中は、そのような同等の細胞にアクセスすることが困難または不可能である。人工多能性幹細胞(iPSC)は、インビトロでそのようなアクセスできない細胞型の生成を可能にし5、6、実験的にアクセス可能であり、霊長類の比較に使用されている6、7、8、9、10、11、12、13、14。
iPS細胞を作製するには、再プログラムする初代細胞を獲得する必要があります。尿から単離された細胞は、霊長類から非侵襲的にサンプリングでき、おそらく幹細胞のような分子プロファイルのために容易に再プログラムできるという利点があります15。霊長類のiPS細胞を維持するための培養条件は、リプログラミングと同じくらい重要です。古典的に、ヒト多能性幹細胞の培養には、未定義の血清ベースの培地と、胚性幹細胞(ESC)に必須栄養素と足場を提供するマウス胚性線維芽細胞(いわゆるフィーダー細胞)の共培養が必要でした16。化学的に定義されたフィーダーフリー培養システム17,18の開発以来、現在、市販のiPS細胞培養培地およびマトリックスには様々な選択肢がある。ただし、これらの培養条件のほとんどはヒトESCおよびiPS細胞用に最適化されているため、NHP iPS細胞培養ではあまりうまく機能しない可能性があります。このビデオプロトコルでは、尿路細胞培養由来のヒトおよびNHP iPS細胞を生成および維持するための手順を提供します。
2006年に線維芽細胞における定義因子の強制発現によるiPS細胞作製が初めて報告されて以来、本手法は様々な起源の様々な細胞型に適用されている19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 、32。このうち、尿由来の細胞のみが完全に非侵襲的に得ることができる。Zhouら33による前述のプロトコルに基づいて、広域抗生物質15を補充することにより、非滅菌サンプルからでも霊長類の尿から細胞を単離および増殖させることができます。特に、このプロトコルによってサンプリングされた尿由来細胞は、線維芽細胞の従来の再プログラミング(私たちの経験では20〜30日)よりも短い期間(コロニーが5〜15日で見えるようになる)でiPS細胞を産生する可能性が高いことを示し、十分に高い成功率を示します。これらの尿由来細胞は、間葉系幹細胞様細胞と膀胱上皮細胞の混合集団に分類され、高い初期化効率を生じさせた15。
初代細胞のばらつきに加えて、iPS細胞を生成するためのリプログラミング方法も使用目的によって異なります。ヒト体細胞に対する従来のリプログラミング手順は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによるリプログラミング因子の過剰発現によって行われ、これにより、ゲノム5,34,35への外因性DNAの組み込みが可能になりました。生成されたiPS細胞をゲノム的に無傷に保つために、研究者は多種多様な非組み込みシステムを開発しました-切除可能なPiggyBacベクター36,37、エピソームベクター38,39、センダイウイルス40やアデノウイルス41などの非組み込み型ウイルスベクター、mRNAトランスフェクション42、タンパク質トランスフェクション43,44、および化合物処理45.効率と取り扱いの容易さのために、センダイウイルスベースのリプログラミングベクターがこのプロトコルで使用されます。初代細胞の感染は、プレーティング前に5の感染多重度(MOI)で細胞およびウイルスの1時間の浮遊培養で行われる。この修正されたステップは、ウイルスが付着細胞培養物に直接添加される従来の方法と比較して、細胞表面とウイルスとの接触の可能性を高め、したがってより多くのiPS細胞コロニーをもたらす可能性がある15。
ヒトおよびNHP多能性幹細胞の継代は、凝集継代および単一細胞継代によって行うことができる。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)は、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを結合し、カドヘリンとインテグリンの付着活性を防ぐコスト効率の高いキレート剤です。EDTAは、接着分子が異なるため、未分化細胞が分化細胞より先に剥離するため、穏やかな選択的解離試薬としても使用されます。完全な解離は、プロテインキナーゼ(Rho/Rock)を介したミオシンの過活性化を含むRho/Rho関連コイルドコイルを介して霊長類iPS細胞の大量細胞死を誘導します。したがって、培養培地にRho/Rock阻害剤を補充することは、懸濁液中の単一細胞を必要とする実験に不可欠です46,47。このプロトコルでは、ルーチン継代法として凝集継代を推奨し、定義された細胞数の播種が必要な場合やサブクローニング中など、必要な場合にのみシングルセル継代を推奨します。

<table><tbody><tr><td>Accumax&trade; 細胞剥離液 (剥離液)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B溶液</td><td>メルク</td><td>A2941-100ML</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト TRA-1-60 マウス抗体&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60064</td><td>希釈率:1/200</td></tr><tr><td>抗ヒト TRA-1-60 PE標識抗体&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-122-965</td>希釈<td>:1/50</td></tr><tr><td>Bambanker&trade;(細胞凍結培地)</td><td>日本ジェネティクス</td><td>BB01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養マルチウェルプレート、12ウェル CELLSTAR</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Countess&trade;II 自動セルカウンター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>クライオキング&reg; 1.5 mL チューブ 2D バーコード付き (Cryotubes)</td><td>Sued-Laborbedarf</td><td>52 95-0213</td> 凍結<td>にはさまざまな種類のクライオチューブを使用できます。2Dバーコードチューブには、サンプル情報を独自のチューブ情報とともにデータベースに保存できるという利点があります。</td></tr><tr><td>CytoTune&trade;EmGFP 仙台蛍光レポーター (GFP 仙台ウイルス)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A16519</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune&trade;-iPS 2.0 仙台リプログラミングキット (仙台ウイルスリプログラミングキット)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Highグルコース</td><td>TH。Geyer</td><td>L0102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 w L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>15373541</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&trade; 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>希釈率: 1/500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&trade; 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21207</td><td>希釈:1/500</td></tr><tr><td>DPBS w/o カルシウム w/o マグネシウム</td><td>TH.Geyer</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit 抗体 (22 HCLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>710524</td><td>希釈率: 1/500</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Carl Roth</td><td>CN06.3</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL 円錐底</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 mL 円錐底</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、熱不活化、ブラジル(FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10.8.2</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>豚の皮からのゼラチン</td>663441 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&trade;LDEVフリー、hESC認定、低成長因子基底膜マトリックス</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade;補足</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>ヘラセル&トレード; 240i CO2 インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16416639</td><td></td></tr><tr><td>ヘレウス ヘラセーフ 安全キャビネット</td><td>ケンドロ</td><td>51017905</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EGF、プレミアムグレード</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>130-097-749</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>フィジー</td><td>バージョン2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必須アミノ酸溶液(100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブPP、1.5 mL</td><td>Nerbe Plus</td><td>04-212-1000</td><td></td></tr>顕微鏡 <tr><td>Nikon eclipse TE2000-S</td><td>Nikon</td><td>TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td><td>R&Dシステム</td><td></td><td>MAB1368希釈:1/100</td></tr><tr><td>マウス抗α-平滑筋アクチン抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB1420</td><td>希釈:1/100</td></tr><tr><td>マウス抗β-IIIチューブリン抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB1195</td><td>Dilution: 1/100</td></tr><tr><td>mTeSR&trade; 1</td><td>STEMCELL Technolgies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4903S</td><td>希釈:1/400</td></tr><tr><td>Normocure&trade;(抗菌試薬)</td><td>Invivogen</td><td>ant-noc</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 ウサギ抗体&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2750S</td><td>希釈:1/400</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10.000 U/ml) (PS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>ペニシリン-ストレプトマイシンミックスには、100 U/mL のペニシリンと 100 & micro;g / mLストレプトマイシン。.</td></tr><tr><td>組換えヒトFGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトPDGF-AB</td><td>PeproTech</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵卓上遠心分離機</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>4-16KS</td><td></td></tr><tr><td>腎上皮細胞基礎培地</td><td></td><td>ATCC PCS-400-030</td><td></td></tr><tr><td>腎上皮細胞増殖キット</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-040</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4900S</td><td>希釈率:1/400</td></tr><tr><td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td><td>NEB</td><td>4755S</td><td>希釈率:1/500</td></tr><tr><td>StemFit&reg;Basic02</td><td>日本遺伝学</td><td>3821.00</td><td>この培地の生産は中止されましたので、ヒト細胞株にはStemFit Basic04CTを、非ヒト霊長類にはStemFit Basic03を使用してください。</td></tr><tr><td>トリトンX-100&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>トリプル&トレード;セレクト酵素(1x)、フェノールレッドなし(解離酵素)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスプレシジョンGP 05</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632、二塩酸塩塩(Rock阻害剤)</td><td>バイオゾール</td><td>BYT-ORB153635</td><td></td></tr><tr><td>抗体希釈バッファー</td><td></td><td></td><td>組成については補足資料を参照してください表 S1</td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td></td><td></td><td>組成については、補足表 S1</td></tr><tr><td>REMC 培地</td><td></td><td></td><td>組成については、補足表 S1</td></tr><tr><td>一次尿培地</td><td></td><td></td><td>組成については、補足表 S1</td></tr><tr><td>PSC 培養培地</td><td></td><td></td>を参照してください 組成<td>については、補足表 S1</td></tr><tr><td>PSC 生成培地</td>を参照してください<td></td><td></td><td>組成については、補足表S1</td></tr>尿<tr><td>洗浄バッファー</td><td></td><td></td>を参照し、<td>組成については補足表S1を参照</td></tr></tbody></table>

尿由来の霊長類人工多能性幹細胞の作製と維持

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

霊長類多能性幹細胞とその誘導体を研究する種間アプローチは、疾患、発生、および進化の分子および細胞メカニズムをよりよく理解するために重要です。霊長類人工多能性幹細胞(iPSC)をより利用しやすくするために、本論文では、尿由来細胞からヒトおよび非ヒト霊長類iPS細胞を非侵襲的に生成する方法と、フィーダーフリー培養法によるそれらの維持について紹介する。
尿は、非滅菌環境(動物のケージなど)からサンプリングし、初代細胞培養中に広域抗生物質カクテルで処理して、汚染を効率的に減らすことができます。尿由来細胞の増殖後、市販のセンダイウイルスベクター系の改変形質導入法によりiPS細胞が生成される。最初のiPS細胞コロニーは、5日後にすでに見えている可能性があり、早くても10日後に摘み取ることができます。酵素フリー解離バッファーによるルーチンの凝集継代は、50回以上の継代で生成されたiPS細胞の多能性をサポートします。

ヒトおよびNHP尿から細胞を単離する場合、単離直後に異なる種類の細胞を同定することができる。扁平上皮細胞、およびさまざまな小さな丸い細胞は、尿とともに排泄されます。女性の尿には、男性の尿よりもはるかに多くの扁平上皮細胞が含まれています(図1B-0日目; 補足図S1)。初代尿培地中での5日間の培養後、最初の接着増殖細胞が見られる(図1A、B−5日目)。この時点で、培地の半分は、最初のコロニーが現れるまで、毎日REMC増殖培地に置き換えられる。およそ13日目に、接着細胞は継代可能な大きなコロニーに成長する(図1B〜13日目)。これらのコロニーは、形態学的に異なる2つの細胞型から形成することができます.1つは、細胞が密接に付着して成長する上皮様表現型を持ち、もう1つは、細長い形状とより高い遊走能力を備えたより間葉系のような形態を示します(図1C</stron...

本プロトコルは、ヒトおよび非ヒト霊長類の尿由来細胞を人工多能性幹細胞(iPSC)に単離、増殖、および再プログラムする方法、ならびに新たに生成されたiPS細胞のフィーダーフリー維持のための指示書を記載している。

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

霊長類IPSCは有用ですが、倫理的および技術的な問題のために入手が困難なことがよくあります。このプロトコルは、霊長類IPSCの生成と維持への最もアクセスしやすいパスを提供します。IPSCの主要な供給源としての尿中細胞の使用は、特別な技術なしで完全に非侵襲的な方法で得ることができるため、大きな利点があります。手順を実演するのは、ヴォルフガングM.S.研究所の博士課程の学生であるジェシカ・ラドマーです。まず、尿を含むチューブを400Gで10分間遠心分離します。次に、上清を注意深く吸引し、チューブ内に約1ミリリットルを残し、ペレットを再懸濁します。アムホテリシンを含む10ミリリットルの尿洗浄バッファーを加えて細胞を洗浄し、血清学的ピペットを使用して懸濁液を注意深く混合します。遠心分離後、上清を注意深く吸引し、チューブ内に約0.2ミリリットル未満を残します。細胞ペレットを、最初に処理された尿50ミリリットルあたりアムホテリシンを含む1ミリリットルの一次尿培地に再懸濁します。ゼラチンを除去し、1ミリリットルの懸濁液をゼラチンコーティングされた12ウェルプレートのウェルに加える。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素でインキュベートします。基底膜マトリックスコーティングされた12穴プレートを調製するために、1ウェルあたり500マイクロリットルの基底膜マトリックスを添加する。プレートを動かして液体を分配し、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、基底膜マトリックスを900マイクロリットルのREMC培地と交換し、使用するまで摂氏37度で保存します。方程式を使用して、5の感染の多重度に必要なセンダイウイルスの量を計算します。仙台再プログラミングキットのコンポーネントを摂氏37度で焼き戻した水浴ですばやく解凍します。合計100マイクロリットルのREMC培地をチューブに入れてから、計算量のセンダイウイルスを加えて混合します。原稿に記載されているように尿中細胞を解離した後、セルカウンターを使用して細胞を数え、所望の数の細胞を1.5ミリリットルのチューブに移します。遠心分離によりペレットを得、調製したセンダイウイルス混合物100マイクロリットルに再懸濁する。懸濁液感染のために摂氏37度で1時間チューブをインキュベートします。インキュベート後、細胞懸濁液を基底膜マトリックスコーティングした12穴プレートに播種する前に合計1ミリリットルとなるようにREMCを添加する。形質導入後、5日目にPSC生成培地に切り替えて人工多能性幹細胞(IPSC)コロニーが発達するまで2日おきに培地を交換する。IPSCコロニーが凝集塊継代に十分な大きさになったら、培養細胞から培地を吸引し、500マイクロリットルのDPBSで細胞を注意深く洗浄します。DPBSを除去した後、500マイクロリットルの0.5ミリモルEDTAをウェルに加え、2〜5分間インキュベートします。コロニーが剥離し始めるまで顕微鏡下で細胞を注意深く観察する。コロニーの端が剥がれ始め、細胞間の隙間が見えたら、EDTAを取り外し、500マイクロリットルのDPBSを慎重に追加します。DPBSを吸引し、P-1000ピペットを使用して500マイクロリットルのPSC培養液でウェルを洗い流します。ピペットを上下に動かして、コロニーを適切なサイズの塊に分散させます。コンフルエント性、播種細胞の所望の密度およびIPSCクローンの好みに応じて、細胞凝集塊懸濁液の1/10〜1/50を新しいウェルに移す。プレートをゆっくりと数回前後に動かして、塊をウェル内に均等に分散させます。プレートを摂氏30度で少なくとも37分間インキュベートして、塊を付着させます。コロニーが継代に十分な大きさになるまで、2〜3日ごとに培地を交換してください。単離後、尿とともに排泄された扁平上皮細胞および様々なより小さな丸い細胞が見られる。最初の接着増殖細胞が見られ、これらの細胞は継代可能な大きなコロニーに成長する。2つの異なる細胞型が見られ、1つは上皮様表現型を有し、もう1つは細長い形状を有するより間葉系様表現型を示す。最初の継代後、尿中細胞は単層として成長します。IPSCの生成中に、いくつかの接着細胞が見られ、これらの細胞は形態学的変化を示し始め、細胞の再プログラミングを示します。さらに、コロニーを形成する細胞は、典型的な胚性幹細胞形態を示す。生成されたすべてのIPSCは、明確なエッジを持つ密集した細胞を特徴とする、典型的な胚性幹細胞様コロニー形態を共有しています。免疫細胞化学は、ゴリラIPSCにおける多能性関連マーカーの発現を試験するために使用されました。さらに、フローサイトメトリー分析は、分析されたオランウータンIPSCがTRA-1-60に対して陽性であることを示しました。さらに、ゴリラIPSCは、内胚葉、中胚葉、外胚葉の系統に分化することができます。分化した細胞数の増加と境界の完全性と均一性の喪失は、IPSC品質が低いことを示しています。対照的に、明確な境界、タイトな細胞パッケージング、および目立つ核小体は、高品質のIPSCを意味します。コロナの変動性のため、霊長類IPSCを健康に保つには、分裂率、継代タイミング、凝集塊サイズなどのクローン固有の条件を最適化する必要があります。確立されたIPSCの品質管理として、マーカー遺伝子発現のチェックに加えて、in vitro EV分化などの直接的または間接的な分化誘導によって効力を検証できます。

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生物学

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