短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

このプロトコルは、ビオチン化RNAオリゴヌクレオチドを用いて細胞抽出物からそれらを引き下げることにより、既知のRNA配列のタンパク質結合パートナーの同定を可能にする。RNAからタンパク質を剥離するために界面活性剤または高温を必要とする方法と比較して、これらのプロトコルは代わりに、潜在的なタンパク質複合体を保存することを可能にする非常に穏やかな条件を使用します。手順を実演するのは、私の規定の下で博士課程の学生であるヤコブ・ルパートです。

HEK 293T細胞プレートのウェルから培地を取り出して総タンパク質の採取を開始し、6つのウェルプレートのウェルを1ミリリットルのPBSで洗浄します。PBSを廃棄し、プレートを氷に移してから、各ウェルに200マイクロリットルの溶解バッファーを加えます。セルスクレーパーを使用して細胞を剥離および破壊してから、2つのウェルに由来する細胞抽出物を同じ1.5ミリリットルのチューブに移します。

氷上で30分間インキュベートし、遠心分離した後、上清を予冷したチューブに移します。次に、1.5ミリグラムのタンパク質に相当するタンパク質抽出物の量を計算します。次に、溶解バッファーを使用して、すべてのサンプルを最終容量600マイクロリットルにします。

使用するまでサンプルを氷上に保管してください。ビーズを調製するには、チューブをフリックして保存バッファーでビーズを混合します。サンプルあたり100マイクロリットルのスラリー媒体を計算した後、スラリーの計算された体積を磁気ラックに入れます。

ビーズを洗浄するには、保存溶液を除去し、1ミリリットルの溶解バッファーを加えて手動で反転させてビーズを洗浄します。次に、磁気ラックを使用してバッファーを取り外し、洗浄手順を繰り返します。ビーズに、スラリー培地の初期容量に等しい量の溶解バッファーを加え、チューブをフリックして混合してから、サンプルとして1.5ミリリットルのチューブに培地を均一に分注します。

ビーズブロッキングのために、磁気ラックを使用してバッファーを取り外し、溶解バッファーで調製した酵母TRNA溶液1ミリリットルあたり600マイクロリットルの0.25ミリグラムを追加します。回転するホイール上で室温で1時間インキュベートします。600マイクロリットルの溶解バッファーを加える前に磁気ラックを使用してTRNA溶液を除去し、手動で混合して洗浄します。

洗浄ステップを繰り返し、バッファーを廃棄します。初期100マイクロリットルのスラリー培地を含む各チューブについて、600マイクロリットルの溶解バッファー中に200マイクログラムのRNAオリゴヌクレオチドを調製します。オリゴをビーズに加え、回転させながら室温で1時間インキュベートします。

ビーズから溶液を取り除き、室温でそれぞれ5分間チューブを回転させて、600マイクロリットルの溶解バッファーで2回洗浄します。バッファーを破棄します。ビーズにタンパク質を結合させるには、600マイクロリットルのタンパク質溶液から5%または30マイクロリットルの容量を分離し、さらなる分析のために入力またはINとして保持します。

残りのタンパク質ミックスをロードされたビーズの各チューブに加え、摂氏4度で一晩ゆっくりと回転させてインキュベートします。磁気ラックを使用して、未結合のタンパク質画分をビーズから取り出します。その体積の5%または30マイクロリットルを節約し、フロースルーまたはFTにラベルを付けます。ビーズに1ミリリットルの洗浄バッファー1を加え、摂氏4度で5分間回転させます。

バッファーを廃棄し、この洗浄を1回繰り返します。1ミリリットルの洗浄バッファー2をビーズに加える。そして、ローテーター上で摂氏4度で5分間インキュベートした後、上清を捨てます。

特定のバインダーを溶出させるため、100マイクロリットルの溶出バッファー1をビーズに加える。フリックして手動で混合した後、室温で5分間インキュベートします。チューブをサーマルミキサーに入れ、摂氏95度で5分間激しく振とうします。

次に、チューブを磁気ラックに入れ、溶出した画分をきれいなチューブに集めます。完了したら、ベンチ遠心分離機でビーズをすばやく回転させ、溶出液の回収率を最大化します。また、さらなる分析のために、総溶出液またはEL量の5%または5マイクロリットルを節約します。

溶出したタンパク質を質量分析により同定した。有意に濃縮されたタンパク質を火山プロットにプロットすると、総タンパク質含量とRNAから溶出される濃縮タンパク質がRNAよりも有意に高いことが明らかになり、RNAがより多くの特異的相互作用を確立できることが示唆されました。予測結果と得られた結果の一致の例として、プラスRNAとマイナスRNAとヒトプロテオーム由来のタンパク質との相互作用スコアは、HNRNPH3がプラスRNAと選択的に結合し、PCBP2がRNAと特異的に相互作用すると予測されたことを示した。

さらに、RBM41タンパク質は、両方のRNAオリゴヌクレオチドに対して無差別であると予測された。タンパク質プルダウンアッセイサンプルの質量分析分析により、RNAにHNRNPH3、マイナスRNAにPCBP2が存在することが確認されました。一方、RBM41は両方と相互作用することが判明しました。

ウェスタンブロットは、最適化ステップの結果およびプロトコルにおけるTDP−43の存在を検出するために使用された。RNAでは、入力サンプルと溶出液にTDP-43が観察され、最初からその存在を示しています。TDP-43は、洗浄ステップ中にRNAによって保持され、最後に高塩緩衝液で溶出された。

タンパク質のRNA相互作用をマッピングすることにより、この方法は多くの生理学的経路の背後にある高分子ネットワークを明らかにすることができます。例えば、転写調節または癌および神経変性を含む病理学的メカニズム。