Name: 短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析法。短いビオチン化RNAオリゴヌクレオチドを用いてHEK 293T細胞からタンパク質複合体を温和な条件下で抽出し、質量分析で相互作用を同定します。

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著者らは、タルタリア教授とクオモ博士の研究グループが提供する支援に感謝したいと思います。E.Z.は、マリー・スクロドフスカ・キュリー助成金契約第754490号に基づき、欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラムのMINDEDフェローシップから資金提供を受けました。

<ol><li>Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+in+human+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins in human genetic disease.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).</li>
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<li>Graindorge, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+identification+and+measurement+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions.</a> Nature Communications. 10 (1), 5317(2019).</li>
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<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CLIP+and+iCLIP+methods+for+nucleotide-resolution+studies+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions.</a> Genome Biology. 13 (8), (2012).</li>
<li>Bayat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX+methods+on+the+road+to+protein+targeting+with+nucleic+acid+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers.</a> Biochimie. 154, 132-155 (2018).</li>
<li>Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatRAPID+omics+v2.0%3A+Going+deeper+and+wider+in+the+prediction+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).</li>
<li>Agostini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CatRAPID+omics%3A+A+web+server+for+large-scale+prediction+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions.</a> Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).</li>
<li>Zacco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+TDP-43+condensation+using+an+in+silico+designed+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer.</a> Nature Communications. 13 (1), 3306(2022).</li>
<li>Leppek, K., Stoecklin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+streptavidin-binding+RNA+aptamer+for+purification+of+ribonucleoprotein+complexes+identifies+novel+ARE-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42 (2), 13(2014).</li>
<li>Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+aptamer+discovery+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in aptamer discovery and applications.</a> Molecules. 24 (5), 941(2019).</li>
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<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+protein+associations+with+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Predicting protein associations with long noncoding RNAs.</a> Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).</li>
<li>Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+background+subtraction+method+for+Western+blot+densitometry+band+quantification+through+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).</li>
<li>Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+proximity+labeling%3A+A+new+detection+tool+for+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions.</a> Molecules. 26 (8), 2270(2021).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+DNA+aptamers+using+cell-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Development of DNA aptamers using cell-SELEX.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li>
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著者には、競合する金銭的利益やその他の利益相反はありません。

この研究では、ビオチン化RNAオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質相互作用因子を捕捉するために実行されたPDプロトコルの最適化について報告しています。ここで説明するプロトコルは、実行が簡単で、材料がほとんど必要なく、信頼性の高い結果が得られます。重要なことに、このプロトコルの最も新しい側面は、完全に インシリコで 設計され、タンパク質標的に特異的なRNAベイトの使用と、ストレプトアビジンをビオチンから解離させて高温処理するのではなく、高塩溶液との相互作用を直接破壊することによってRNAベイトに結合したすべてのタンパク質を溶出することです。
このプロトコルは、ビオチンとストレプトアビジン29,30との間の結合の強さを利用する。選択したストレプトアビジンビーズによると、ビオチン化RNAの負荷は、先に進む前にテストおよび定量する必要があります。また、RNAの三次元フォールディングは、ストレプトアビジンへのビオチンの曝露を制限する可能性があるため、ビーズへのローディング効率に影響を与える可能性があります。非ビオチン化tRNAでビーズをブロックすると、ビーズとの非特異的相互作用が制限されるため、結果の清浄度が向上します。ローディングバッファーと溶出バッファーは、ダウンストリームアプリケーションに応じて選択する必要があります。ここでは、大部分の用途に適し、潜在的なタンパク質複合体を保存するために開発された非常に穏やかな条件が提案されました。ただし、この方法は適応性が高いです。ユーザーは任意の細胞株と任意のRNAサイズを選択でき、RNAの折り畳み/折り畳み後にプロトコルを繰り返して、結合特性に対する構造の影響を決定することができます。
このプロトコルの別のオリジナルの態様は、結果の正確性を確実にするための インシリコ 予測ツールの使用である20。どのタンパク質を目的のRNAの相互作用物質として同定すべきかを事前に知ることは、プロトコルの技術的側面を検証するという前例のない利点をもたらします。例えば、単純なWB分析を使用して、MS分析を進める前に、プロトコルのさまざまなステップに由来するサンプル中の既知のタンパク質ターゲットの存在を確認することができますが、これは特殊な機器を必要とし、よりコストがかかります。さらに、社内のタンパク質-RNA予測アルゴリズムである catRAPID20を使用して、標的タンパク質に特異的 なde novo RNAを設計する方法が最近報告されました。最近まで、標的タンパク質のDNA/RNAアプタマーを設計するための唯一の利用可能なパイプラインは、SELEX(指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化)アプローチでした31。 インシリコ 法は、RNAアプタマーのはるかに迅速で費用対効果の高い設計を可能にします。
この方法の主な制限は、ヌクレアーゼフリーのバッファーおよびツールで作業する必要性に関連しています。さらに、de novo設計したRNAと標的タンパク質との結合をPD前にin vitroで確認する必要があると考えられる場合は、タンパク質を産生および精製し、生物物理学的アプローチで結合を決定する必要があります。これは、モノクローナル抗体の産生と共有される制限です。
これらの小さな問題にもかかわらず、ここで紹介するようなRNAとタンパク質の相互作用をマッピングする信頼性の高い方法は、科学者を高分子ネットワークと、癌、心筋症、糖尿病、微生物感染症、遺伝性および神経変性疾患に関与するものなど、多くの生理学的および病理学的メカニズムの複雑な主役を明らかにすることに近づけることができます。

RNA結合タンパク質(RBP)は、mRNAスプライシング、RNA細胞局在、翻訳、修飾、分解などのプロセスに関与しているため、転写および転写後遺伝子の制御における重要なプレーヤーとして浮上しています1,2,3。2つの高分子間のこのような相互作用は、高度に調整され、正確にバランスが取れており、機能ハブとプロセシングハブの形成に不可欠です。これらのハブ内の変異または調節不全は、細かく調節されたタンパク質-RNAネットワークを破壊する可能性があり、癌4,5および神経変性疾患6,7,8を含むさまざまなヒト疾患とますます関連しています。RNA分子とそのタンパク質結合パートナーとの間の相互作用は、安定していて実験的に検証しやすい場合もあれば、非常に動的で一過性で特性評価が難しい場合もあります。
近年、これらの相互作用を理解するための集中的な努力が行われています。最も確立された方法の中で、タンパク質プルダウンアッセイ(PD)は、リボ核タンパク質(RNP)複合体および他のタンパク質-RNA相互作用ネットワークを構成する主要なプレーヤーを解明するためにおそらく最も高く評価され、一般的に使用されるアプローチです3,9,10。PDには、目的のRNA(RIP)11,12またはタンパク質(CLIP)13,14のいずれかの免疫沈降など、幅広い有益な技術が含まれます。これらのRNA-PDプロトコルのいくつかは、タンパク質15の餌として既知のRNAを採用し、ほとんどの場合、ビオチンなどの高親和性タグを利用します。この場合、ビオチン化RNAの相互作用パートナーは、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズにRNAを固定することで検出でき、RNPの効率的な単離を可能にします。これらのアプローチの主な制限は、通常、ビオチン化プローブの設計と、標的タンパク質に結合する能力のテストです。この目的のために、標的タンパク質との相互作用のピークに対応する短いRNA領域を高精度で明らかにするので、利用可能な場合、関心のあるタンパク質の公開されたCLIPデータに頼ることは有用であり得る13,16。これらの同じ領域を使用して、PD用のプローブを開発できます。このようなRNAベイトを設計する別の方法は、指数関数的濃縮(SELEX)17によるリガンドの系統的進化であり、包括的なランダム化ライブラリから始まり、一連のPCR駆動の最適化サイクルを介して、in vitro選択を通じてアプタマーの設計を可能にします。ただし、SELEXは複雑で時間がかかり、最終結果は初期ライブラリに大きく依存します。ここに提示されたプロトコルで使用するRNAベイトを選択するために、特定のRNA配列に対する所与のタンパク質の優先的結合を予測するアルゴリズムcatRAPIDの計算能力によってde novoで設計されたRNAベイトを使用することからなるさらに別のアプローチが利用された18、19、20。
ここで紹介するプロトコルは、界面活性剤、変性剤、または高温を使用せずに、生理学的に近い条件で特定のタンパク質パートナーを溶出するように最適化されたRNA-PDのバージョンです。これは、高度に精製されたストレプトアビジンで共有結合でコーティングされたナノ超常磁性ビーズと、餌としての特定の インシリコ 設計ビオチン化RNAの使用に依存しています。このプロトコルは、ビオチン化RNA分子の結合パートナーをネイティブ条件で分離するための迅速かつ効率的な方法を提供し、幅広いダウンストリームアプリケーションの可能性を提供します。このプロトコルを試験するために、タンパク質TAR DNA結合タンパク質43(TDP-43)を高い親和性および特異性で結合するように予め設計された10ヌクレオチド一本鎖RNAアプタマー配列を20使用した。HEK 293T細胞溶解物から始めて、ビオチン化RNAアプタマーの相互作用因子を、高張緩衝液を用いてRNA餌から剥離したサンプルに対して実施した質量分析によって同定した。この分析により、好ましい結合剤としてのTDP-43の同定および定量化が成功したことが確認された。
このプロトコルにより、短いin vitro合成RNAオリゴヌクレオチドのみを使用してタンパク質相互作用因子を同定することができます。さらに、PDプローブ21,22としてインシリコ設計RNAアプタマーを使用することで、大幅に削減されたコストでターゲットに対する特異性が保証されます。

<table><tbody><tr><td>6ウェル組織培養プレート&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10861-554</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>BIOSIGMA&nbsp;</td><td>10153</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;s ミディアム&nbsp;(DMEMの)</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>11995065</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定済み、熱不活化、ブラジル</td><td>Thermo Fisher Scientfic 10500064</td><td></td><td>CELLS</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、マサチューセッツ州ウォルサム)</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>14190169</td><td>CELLS</td></tr><tr><td>トリプシン (0.25%)、フェノールレッド</td><td>Thermo Fisher Scientfic 15050065</td><td></td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG セイヨウワサビペルオキシダーゼ (HRP)</td><td>Cellsignal</td><td>7070</td><td>PD</td></tr><tr><td>ビオチン化 RNA</td><td>ユーロフィン</td><td>カスタム RNA オリゴヌクレオチド</td><td>PD</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td>PD</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml</td><td>Biorad</td><td>1705061</td><td>PD</td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Merck - Sigma Aldrich</td><td>5056489001</td><td>PD</td></tr><tr><td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>PD</td></tr><tr><td>Recombinant anti-TDP43 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab109535</td><td>PD</td></tr><tr><td>Ribonucleic acid, パン酵母からの転写 (S.&nbsp;cerevisiae)</td><td>メルク - シグマアルドリッチ</td><td>R5636-1ML</td><td>PD</td></tr><tr><td>ストレプトアビジンマグセファロー</td>ス <td>メルク - シグマアルドリッチ</td><td>GE28-9857-99</td><td>PD</td></tr><tr><td>トランスブロットターボRTAミニ0.2 &マイクロ;m PVDF トランスファー キット</td><td>Biorad</td><td>1704272</td><td>PD</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>サーモフィッシャー サイエントフィック</td><td>022928.K2</td><td>MS</td></tr><tr><td>C18 カートリッジ</td><td>サーモフィッシャー サイエントフィック</td><td>13-110-018</td><td>MS</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール&nbsp;(DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientfic</td><td>20290</td><td>MS</td></tr><tr><td>EASY-Spray HPLC カラム</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES902</td><td>MS</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド (IAA)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ S.r.l.</td><td>I6125</td><td>MS</td></tr><tr><td>Lys-C/トリプシン</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td>MS</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>サーモフィッシャーサイエントフィック</td><td>28904</td><td>MS</td></tr><tr><td>尿素</td>サー<td>モフィッシャーサイエントフィック</td><td>J75826.A7</td><td>MS</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc イメージングシステム</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Dyna Mag -2 , 磁気ラック</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CELLS</td></tr><tr><td>Forma Series 3 ウォータージャケット C02 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>PROTEAN II xi cell , PAGE アプリケーション用電源</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>回転ホイール、ローテーター SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>ウォーターバスは 37 °に設定されています。C</td><td>VWR</td><td></td><td>PD</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell 電気泳動システム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>MS</td></tr><tr><td>Easy-nLC 1200 UHPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>MS</td></tr><tr><td>Q exactive 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>MS</td></tr><tr><td>Software</td><td>Version</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>2.0.3.0</td><td></td><td>MS</td></tr><tr><td>ペルセウス</td><td>1.6.14.0</td><td></td><td>MS</td></tr></tbody></table>

短いビオチン化rnaを用いたrna結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

タンパク質-RNA相互作用は、転写レベルおよび転写後レベルで遺伝子発現および細胞機能を調節します。このため、目的のRNAの結合パートナーを特定することは、多くの細胞プロセスの背後にあるメカニズムを明らかにするために依然として非常に重要です。ただし、RNA分子は、一部のRNA結合タンパク質(RBP)、特に非標準的なタンパク質と一過性かつ動的に相互作用する可能性があります。したがって、そのようなRBPを分離および同定するための改善された方法が大いに必要とされています。
既知のRNA配列のタンパク質パートナーを効率的かつ定量的に同定するために、細胞総タンパク質抽出物から始めて、相互作用するすべてのタンパク質のプルダウンと特性評価に基づく方法を開発しました。ストレプトアビジンコーティングビーズにプリロードされたビオチン化RNAを使用して、タンパク質プルダウンを最適化しました。概念実証として、神経変性関連タンパク質TDP-43に結合することが知られている短いRNA配列と、異なるヌクレオチド組成が同じ長さのネガティブコントロールを採用しました。酵母tRNAでビーズをブロックした後、ビオチン化RNA配列をストレプトアビジンビーズにロードし、HEK 293T細胞からの総タンパク質抽出物とともにインキュベートしました。インキュベーションと非特異的結合を除去するためのいくつかの洗浄ステップの後、最も一般的に使用されるタンパク質定量試薬および質量分析用のサンプル調製に適合する高塩溶液で相互作用タンパク質を溶出しました。既知のRNA結合剤を用いて行ったプルダウンにおけるTDP-43の濃縮をネガティブコントロールと比較して質量分析法により定量した。同じ手法を使用して、目的のRNAまたはコントロールの一意の結合剤であると計算的に予測される他のタンパク質の選択的相互作用を検証しました。最後に、適切な抗体によるTDP-43の検出 を介して 、ウェスタンブロットによってプロトコルを検証しました。 
このプロトコルにより、生理学的に近い条件で関心のあるRNAのタンパク質パートナーの研究が可能になり、ユニークで予測できないタンパク質-RNA相互作用の発見に役立ちます。

提案されたプロトコルの有効性を検証するために、ここに提示されたPD実験は、TDP-4320に特異的に結合するようにインシリコで設計されたビオチン化RNAアプタマーを用いて実施された。このRNAは、高い結合親和性(Kd = 90 nM)20でタンパク質標的に結合します。ここで、配列5'-CGGUGUUGCU-3'のこのRNAは、「+RNA」という名称で称される。陰性対照として、+RNAの逆相補配列(ここでは「-RNA」と呼ばれる)を用いた。その配列は5'-AGCAACACCG-3'である。-RNAは、TDP-43(Kd = 1.5 μM)に対して有意に低い結合親和性を示します19。本明細書に記載されるプロトコールの目的のために、これらのRNAオリゴヌクレオチドは、ビオチン分子にコンジュゲートして購入され、ストレプトアビジンビーズへの結合を可能にする。+RNAは、ビオチンと核酸のリン酸基の間に15原子のトリエチレングリコールスペーサーを含む3'末端にビオチン-TEGで購入しました。-RNAは代わりに、その5'末端にビオチンを有し、アミノC6リンカーを介して核酸に結合した。しかし、RNAベイトの設計が堅牢であり、リンカーとRNAの間に構造的または化学的干渉がない限り、ビオチン結合のための他の位置および他のリンカー長を採用することができる。
PD後に+RNAプローブに結合したメインタンパク質の同一性を知ることで、質量分析(MS)とウェスタンブロット(WB)の両方を使用して、溶出液中のTDP-43を同定することにより、プロトコルの検証が可能になりました(図1)。
MS分析は、+RNAまたは-RNAのいずれかを用いて実施した4つのPD反復について実施した(図2)。+RNAと-RNAの相互作用の同定はこのプロトコルの範囲を超えていますが、プロトコルの精度を検証するいくつかの結果が報告されています。注目すべきことに、有意に濃縮されたタンパク質を火山プロットにプロットすると、+RNAから溶出された総タンパク質含有量と濃縮タンパク質は、-RNAから回収されたものよりも有意に高いことが明らかになりました(図2)。これは、同じ長さと構造含量(直鎖状)を有するにもかかわらず、+RNAはより多くの特異的相互作用を確立することができ、それらは高塩で溶出ステップまで保持されることを意味します。代わりに、-RNAは、洗浄ステップ中に破壊される非特異的接触の数が多い可能性があります。予想通り、TDP-43は+RNA20のユニークな相互作用因子として同定されました。+RNAで行った4つのPD反復の平均ラベルフリー定量(LFQ)は31.96 ± 0.56ですが、タンパク質は-RNAの相互作用物質の中で同定されていません。さらに、+RNAのすべてのユニークな相互作用物質の中で、TDP-43は最も豊富に濃縮されたタンパク質であることがわかりました。
プロトコルをさらに検証するために、社内アルゴリズムcatRAPID18,19を使用して、他のどのタンパク質が+RNAまたは-RNAのいずれかに特異的に結合するかを計算的に予測しました。特に、+RNAおよび-RNAとヒトプロテオームを構成するタンパク質との相互作用スコアは、以前の研究27で定義されているように、catRAPIDの「相互作用傾向」機能を使用して計算されました。高い信頼性でスコアを付けたタンパク質のうち、HNRNPH3は選択的に+RNA(+RNA相互作用スコア= 1.01;-RNA相互作用スコア=0.21)と結合し、PCBP2は-RNAと特異的に相互作用すると予測されました(+RNA相互作用スコア= -0.5;-RNA相互作用スコア= 0.31)(図3A)。さらに、タンパク質RBM41は、両方のRNAオリゴヌクレオチドについて無差別であると予測された(+RNA相互作用スコア= 0.4;-RNA相互作用スコア= 0.39)(図3A)。MS分析では、+RNAと-RNAのPDにそれぞれHNRNPH3とPCBP2が存在することを確認しましたが、RBM41は両方と相互作用していることがわかりました(図3B)。
WBは、結果をさらに確認するためにTDP-43の存在を検出するために使用され、プロトコルの最適化中に使用されました(図4)。ここで説明する手順では、異なるサンプルを異なる段階で収集した。インプットサンプル(IN)は、溶解バッファーで希釈された全タンパク質で構成されていました。フロースルー(FT)は、ビオチン化RNAでプレコーティングされたストレプトアビジンビーズを用いて全タンパク質を一晩インキュベートした後に得られ、RNAに結合しなかったタンパク質の画分を表す。最後に、溶出液(EL)には、FTステップとELステップの間に150 mM塩と0.1%トリトン-Xによる3つの洗浄ステップが最も弱い相互作用が除去されたはずであるため、調査中のRNAを特異的に認識するすべてのタンパク質が含まれていました。
各反復について、同量(5% v/v)のIN、FT、およびELをSDS-PAGE上で並行して実行し、抗TDP-43抗体で染色しました(図4)。+RNAの場合、TDP-43のバンドはINとELで観察され、総タンパク質抽出物の最初から存在するタンパク質は、洗浄ステップ中に+RNAによって保持され、最後に高塩緩衝液でのみ溶出されることを示しています。TDP-43は-RNAのINにも存在していましたが、タンパク質に対応するバンドはFTでも見られ、このRNAがTDP-43に結合しないことを示しています。ELにTDP-43バンドがないことは、この結果を裏付けています。
プロトコルの最適化中、RNA配列に特異的に結合したタンパク質の溶出は、1 M NaClを含む溶出バッファー(EB1)と2 M NaClを含む溶出バッファー(EB2)の両方でプローブされました(図4)。いずれかのEBで得られた溶出液をSDS-PAGE上で比較し、抗TDP-43抗体でブロットした。次いで、得られた画像をImageJ28 で分析し、2つのバッファーで溶出されたTDP-43量の差を定量化した。全体として、有意差は観察されず、これらのアッセイ内では、1 M塩が最も強いタンパク質-RNA相互作用を破壊するのに十分であると結論付けました。
全体として、MSおよびWBについてここで報告された結果は、このプロトコルが特定の方法で特定のRNAのタンパク質相互作用物質を捕捉するのに効率的であり、ダウンストリーム分析と互換性のあるバッファーでの溶出を可能にすることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig01.jpg"> 図1:提案されたプロトコルで使用される実験パイプラインのスケッチ 。 (a)ビオチン化RNAオリゴヌクレオチドを溶解バッファー中で適切な濃度で調製する。(B)磁気ストレプトアビジンビーズを洗浄し、酵母tRNAでブロックし、ビオチン化RNAを装填する。(C)培養哺乳動物細胞株由来の総タンパク質抽出物をビーズ-RNA混合物に添加する。(D)非特異的相互作用を除去するために複数回の洗浄が行われる。(E)特定のタンパク質相互作用物質を高張溶液でRNAから分離する。(F)相互作用因子の正体は質量分析によって明らかにされ、特定の症例はウェスタンブロットによって検証されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig02.jpg"> 図2:ラベルフリーMSベースのタンパク質定量のための分析戦略 。 (A)溶出したタンパク質を冷アセトン中で一晩沈殿させる。その後、タンパク質を変性させ、溶液中で消化します。タンパク質分解ペプチドは濃縮され、脱塩されます。(B)ペプチドは、「ショットガンアプローチ」を使用してLC-MS/MS を介して 分析されます。(C) 生データの処理と分析は、それぞれMaxQuantとPerseusソフトウェアを使用して実行されます。(D)統計的に有意に濃縮されたタンパク質が火山プロットに表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig03.jpg"> 図3:+RNAおよび-RNAの予測された相互作用傾向と実験的に決定された相互作用との相関。 (A) ネコのRAPID相互作用スコアは、HNRNPH3、PCBP2、およびRBM41と比較して、+RNAに対するHNRNPH3および-RNAに対するPCBP2の優先的な結合を示し、一方、RBM41は両方のRNA配列に無差別に結合すると予測されています。(B)+RNAおよび-RNAで行われたプルダウンからの質量分析によって決定されたラベルフリー定量平均。分析により、HNRNPH3は+RNAのみに結合し、PCBP2は-RNAのみに結合し、RBM41は両方に等しく結合することが確認されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64923/64923fig04.jpg"> 図4:選択したRNA配列の相互作用因子におけるTDP-43の有無のウェスタンブロット検証。 WBメンブレンは抗TDP-43抗体で処理されています。IN = 入力;FT =フロースルー;EL(EB1) = 溶出バッファー1による溶出;EL(EB2) = 溶出バッファー2による溶出;記号「+」は、+RNAで実行されたプルダウンに由来するサンプルを示します。記号「-」は、-RNAを用いて実施したプルダウンに由来するサンプルを示す。レーン1にはタンパク質ラダーが含まれています。TDP-43は矢印で示されています。WBは、TDP-43が+RNAインタラクターの間では見出されるが、-RNA相互作用者の間では見出されないことを示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64923/64923fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">バッファ名</td>
			<td colspan="3">組成</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">10x トランスファーバッファ</td>
			<td colspan="3">250 mMトリス、1.92 Mグリシン、1%SDS、20%メタノール。使用前に10倍に希釈する</td>
			<td rowspan="9">ティッカー</td>
		</tr><tr><td colspan="3">20X MES SDS ランニングバッファ</td>
			<td colspan="3">1 M MES, 1 M トリス, 2% SDS, 20 mM EDTA.pHを7.3に調整します。使用前に20倍に希釈</td>
		</tr><tr><td colspan="3">4xサンプルローディングバッファ</td>
			<td colspan="3">0.25 M トリス塩基、0.28 M SDS、40% グリセロール、20% 2-メルカプトエタノール、4 mg/ml ブロムフェノールブルー</td>
		</tr><tr><td colspan="3">溶出バッファー 1</td>
			<td colspan="3">20 mM リン酸 pH 7.5、1 M NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 % トリトン X-100、1 mM DTT (定量後に添加)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">溶出バッファー 2</td>
			<td colspan="3">20 mM リン酸 pH 7.5、2 M NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 % トリトン X-100、1 mM DTT (定量後に添加)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">溶解バッファー</td>
			<td colspan="3">10 mM トリス塩酸塩 pH 7.4、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、1 mM DTTおよびプロテアーゼ阻害剤</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Tween-20を含むトリス緩衝生理食塩水</td>
			<td colspan="3">1 M トリス塩酸塩 pH 7.4, 3 M NaCl, 2.0% トゥイーン-20</td>
		</tr><tr><td colspan="3">洗浄バッファー 1</td>
			<td colspan="3">10 mM トリス塩酸塩 pH 7.4、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 % トリトン TM X-100、1 mM DTT およびプロテアーゼ阻害剤</td>
		</tr><tr><td colspan="3">洗浄バッファー 2</td>
			<td colspan="3">25 mM Hepes pH 8、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 % Triton X-100、1 mM DTT およびプロテアーゼ阻害剤</td>
		</tr><tr><td colspan="3">バッファ A</td>
			<td colspan="3">0.1%ギ酸</td>
			<td rowspan="3">さん</td>
		</tr><tr><td colspan="3">バッファ B</td>
			<td colspan="3">アセトニトリル60%、ギ酸0.1%</td>
		</tr><tr><td colspan="3">変性バッファー</td>
			<td colspan="3">8M尿素、50 mMトリス塩酸塩</td>
		</tr></tbody></table>表 1: PD および MS バッファー。 プルダウン実験(PD)または質量分析(MS)に使用されるバッファーの名前と組成。

ここでは、ヒト細胞からの総タンパク質抽出物、ビオチン化RNAでコーティングされたストレプトアビジンビーズ、および質量分析を使用して、特定のRNA配列のタンパク質相互作用因子を発見、定量、および検証するための最適化された in vitro メソッドを紹介します。

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

このプロトコルは、ビオチン化RNAオリゴヌクレオチドを用いて細胞抽出物からそれらを引き下げることにより、既知のRNA配列のタンパク質結合パートナーの同定を可能にする。RNAからタンパク質を剥離するために界面活性剤または高温を必要とする方法と比較して、これらのプロトコルは代わりに、潜在的なタンパク質複合体を保存することを可能にする非常に穏やかな条件を使用します。手順を実演するのは、私の規定の下で博士課程の学生であるヤコブ・ルパートです。HEK 293T細胞プレートのウェルから培地を取り出して総タンパク質の採取を開始し、6つのウェルプレートのウェルを1ミリリットルのPBSで洗浄します。PBSを廃棄し、プレートを氷に移してから、各ウェルに200マイクロリットルの溶解バッファーを加えます。セルスクレーパーを使用して細胞を剥離および破壊してから、2つのウェルに由来する細胞抽出物を同じ1.5ミリリットルのチューブに移します。氷上で30分間インキュベートし、遠心分離した後、上清を予冷したチューブに移します。次に、1.5ミリグラムのタンパク質に相当するタンパク質抽出物の量を計算します。次に、溶解バッファーを使用して、すべてのサンプルを最終容量600マイクロリットルにします。使用するまでサンプルを氷上に保管してください。ビーズを調製するには、チューブをフリックして保存バッファーでビーズを混合します。サンプルあたり100マイクロリットルのスラリー媒体を計算した後、スラリーの計算された体積を磁気ラックに入れます。ビーズを洗浄するには、保存溶液を除去し、1ミリリットルの溶解バッファーを加えて手動で反転させてビーズを洗浄します。次に、磁気ラックを使用してバッファーを取り外し、洗浄手順を繰り返します。ビーズに、スラリー培地の初期容量に等しい量の溶解バッファーを加え、チューブをフリックして混合してから、サンプルとして1.5ミリリットルのチューブに培地を均一に分注します。ビーズブロッキングのために、磁気ラックを使用してバッファーを取り外し、溶解バッファーで調製した酵母TRNA溶液1ミリリットルあたり600マイクロリットルの0.25ミリグラムを追加します。回転するホイール上で室温で1時間インキュベートします。600マイクロリットルの溶解バッファーを加える前に磁気ラックを使用してTRNA溶液を除去し、手動で混合して洗浄します。洗浄ステップを繰り返し、バッファーを廃棄します。初期100マイクロリットルのスラリー培地を含む各チューブについて、600マイクロリットルの溶解バッファー中に200マイクログラムのRNAオリゴヌクレオチドを調製します。オリゴをビーズに加え、回転させながら室温で1時間インキュベートします。ビーズから溶液を取り除き、室温でそれぞれ5分間チューブを回転させて、600マイクロリットルの溶解バッファーで2回洗浄します。バッファーを破棄します。ビーズにタンパク質を結合させるには、600マイクロリットルのタンパク質溶液から5%または30マイクロリットルの容量を分離し、さらなる分析のために入力またはINとして保持します。残りのタンパク質ミックスをロードされたビーズの各チューブに加え、摂氏4度で一晩ゆっくりと回転させてインキュベートします。磁気ラックを使用して、未結合のタンパク質画分をビーズから取り出します。その体積の5%または30マイクロリットルを節約し、フロースルーまたはFTにラベルを付けます。ビーズに1ミリリットルの洗浄バッファー1を加え、摂氏4度で5分間回転させます。バッファーを廃棄し、この洗浄を1回繰り返します。1ミリリットルの洗浄バッファー2をビーズに加える。そして、ローテーター上で摂氏4度で5分間インキュベートした後、上清を捨てます。特定のバインダーを溶出させるため、100マイクロリットルの溶出バッファー1をビーズに加える。フリックして手動で混合した後、室温で5分間インキュベートします。チューブをサーマルミキサーに入れ、摂氏95度で5分間激しく振とうします。次に、チューブを磁気ラックに入れ、溶出した画分をきれいなチューブに集めます。完了したら、ベンチ遠心分離機でビーズをすばやく回転させ、溶出液の回収率を最大化します。また、さらなる分析のために、総溶出液またはEL量の5%または5マイクロリットルを節約します。溶出したタンパク質を質量分析により同定した。有意に濃縮されたタンパク質を火山プロットにプロットすると、総タンパク質含量とRNAから溶出される濃縮タンパク質がRNAよりも有意に高いことが明らかになり、RNAがより多くの特異的相互作用を確立できることが示唆されました。予測結果と得られた結果の一致の例として、プラスRNAとマイナスRNAとヒトプロテオーム由来のタンパク質との相互作用スコアは、HNRNPH3がプラスRNAと選択的に結合し、PCBP2がRNAと特異的に相互作用すると予測されたことを示した。さらに、RBM41タンパク質は、両方のRNAオリゴヌクレオチドに対して無差別であると予測された。タンパク質プルダウンアッセイサンプルの質量分析分析により、RNAにHNRNPH3、マイナスRNAにPCBP2が存在することが確認されました。一方、RBM41は両方と相互作用することが判明しました。ウェスタンブロットは、最適化ステップの結果およびプロトコルにおけるTDP−43の存在を検出するために使用された。RNAでは、入力サンプルと溶出液にTDP-43が観察され、最初からその存在を示しています。TDP-43は、洗浄ステップ中にRNAによって保持され、最後に高塩緩衝液で溶出された。タンパク質のRNA相互作用をマッピングすることにより、この方法は多くの生理学的経路の背後にある高分子ネットワークを明らかにすることができます。例えば、転写調節または癌および神経変性を含む病理学的メカニズム。

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