Name: 加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ 加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素上皮病変の評価・定量化プロトコル。光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡を用いた定量的アセスメントにより、RPEの健康状態を統計的に比較解析する手法を解説します。

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著者らは、木下聡とウィスコンシン大学(UW)の病理学研究所(TRIP)におけるトランスレーショナルリサーチイニシアチブが、光学顕微鏡用に組織を調製してくれたことに感謝したいと思います。このコアは、ウィスコンシン大学炭素がんセンターのUW病理学および検査医学部門(P30 CA014520)、およびNIH所長室(S10OD023526)によってサポートされています。共焦点顕微鏡は、UW生化学基金の支援を受けて設立されたUW生化学光学コアで実施されました。この研究は、国立眼科研究所からの助成金によっても支援されました(R01EY022086から池田敦;R01EY031748からC.ボウズリックマンへ。P30EY016665をUWの眼科および視覚科学科に。デュークアイセンターへのP30EY005722。NIH T32EY027721からM.ランドウスキーへ。F32EY032766からM.ランドウスキーへ)、ティモシーウィリアムトラウト会長(池田A)、FFBフリーファミリーAMDアワード(C.ボウズリックマン);失明を防ぐための研究(デュークアイセンター)からの無制限の助成金。

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このプロトコルの著者には、開示や利益相反はありません。

本稿では、マウスモデルの構造的RPE病理を評価するための表現型プロトコールについて紹介しました。光、透過電子、共焦点顕微鏡など、さまざまなイメージング技術のために眼を処理するために必要な手順と、これらのイメージング方法で観察される典型的な病状の定量について説明しました。Tmem135 TGおよび24ヶ月齢のWTマウスはRPE病理30,31,32を示すため、RPE表現型プロトコルの有効性を証明した。このプロトコルは、BLamDs 6,7と同様に、RPEの菲薄化、空胞化、遊走、異形症などのRPE病理を有する可能性のある遺伝子組み換えまたは薬理学的に治療されたマウスに適用できます。Tmem135 TGおよび24ヶ月齢のWTマウスで観察されたRPE病理は他のAMDマウスモデル<sup class="xref"...

加齢黄斑変性症(AMD)は、55歳以上の人々に影響を与える一般的な失明性疾患です1。多くの研究者は、網膜色素上皮(RPE)内の機能不全は、AMD2の早期かつ重要な病態学的事象であると考えています。RPEは、隣接する視受容体と脈絡膜血管の恒常性を維持する役割を負った偏光細胞の単層です3。RPE内の疾患関連メカニズムを調べるために、細胞培養モデル4、5、マウス6、7、8など、さまざまなモデルが存在します。最近の報告では、RPE細胞培養モデル4の標準化されたプロトコルと品質管理基準が記載されているが、マウスモデルにおけるRPEの表現型を標準化しようとした報告はない。実際、AMDのマウスモデルに関する多くの出版物には、RPEの完全な説明やRPEの病状の定量化が欠けています。このプロトコルの全体的な目標は、AMDマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を備えた標準的なRPE表現型分析法を提示することです。
以前の出版物は、3つの画像技術を通じてマウスにおけるいくつかのRPE病理の存在を指摘している。たとえば、光学顕微鏡法により、研究者はマウス網膜の肉眼的形態を観察し(図1A)、RPEの菲薄化、空胞化、移動などのRPEの病状を検出できます。AMDマウスモデルにおけるRPEの薄化は、それぞれのコントロールからのRPEの高さの偏差によって例示されます(図1B)。RPE空胞化は、微小液胞化(図1C)とマクロ液胞化(図1D)の2つのカテゴリーに分けることができます。RPE微小液胞化は、その全体の高さに影響を及ぼさないRPE内の液胞の存在によって要約されるが、マクロ液胞化は、光受容体の外側セグメントに突出する液胞の存在によって示される。RPEの移動は、網膜断面におけるRPE単層上の色素の焦点集合体によって区別されます(図1E)。AMDドナーの眼における遊走性RPE細胞は、分化クラスター68(CD68)9などの免疫細胞マーカーに対して免疫反応性を示し、RPE破片または分化形質転換を受けているRPEを巻き込む免疫細胞を表す可能性があることに注意する必要があります9。透過型電子顕微鏡と呼ばれる別のイメージング技術により、研究者はRPEとその基底膜の微細構造を視覚化することができます(図2A)。この手法により、基底層流沈着(BLamD)として知られるマウスの優勢なサブRPE沈着物を特定することができます(図2B)10。最後に、共焦点顕微鏡は、RPEフラットマウントのイメージングを通じてRPE細胞の構造を明らかにすることができます(図3A)。この方法により、RPE異形症、つまりRPEの古典的なハニカム形状からの偏差を明らかにすることができます(図3B)。また、RPE細胞内に3つ以上の核が存在するRPE多核化を検出することもできます(図3C)。現在のAMDマウスモデルに存在するRPE病理の種類の要約については、文献6,7からこれらのレビューを参照します。
AMDを研究している研究者は、表現型プロトコルの前にマウスを使用してRPEの病状を調査することの長所と短所を知っておく必要があります。マウスは、それらの比較的短い寿命および費用対効果、ならびにそれらの遺伝的および薬理学的操作性のために有利である。マウスはまた、RPE遊走、異形症、および多核形成を含むRPE変性変化を示し、AMDドナー眼で観察される11、12、13、14、15、16、17;これは、同様のメカニズムがマウスとヒトにおけるこれらのRPE病状の発症の根底にある可能性があることを示唆しています。ただし、マウス研究のヒトAMDへの翻訳可能性を制限する重要な違いがあります。第一に、マウスには、AMDで優先的に影響を受ける視力に必要な人間の網膜の解剖学的に異なる領域である黄斑がありません。第二に、RPEの菲薄化や空胞化など、マウスの一部のRPE病理は、通常、AMDドナーの目には見られません18。第三に、マウスはAMD病理の特徴であるドルーゼンを発症しません19。ドルーゼンは脂質およびタンパク質を含む沈着物であり、RPE基底膜とブルッフ膜(BrM)の内側コラーゲン層との間に形成される基底膜タンパク質はほとんどありません19。ドルーゼンは、マウスの一般的なサブRPE沈着物であるBLamDとは、その組成と解剖学的位置の両方が異なります。BLamDは、BrMのRPE基底膜とRPE20の基底折り畳みとの間に形成される、年齢およびストレス依存性の細胞外マトリックスに富む異常です。興味深いことに、BLamDはマウスとヒトの両方で同様のタンパク質組成と外観を持っています6、10、21。最近の研究は、BLamDがAMDの後期段階への進行に影響を与えることによってAMDの病態生物学において作用する可能性があることを示唆しています18,22;したがって、これらの沈着物は、マウス網膜における罹患RPEを表し得る。これらの利点と限界に関する知識は、マウス研究の結果をAMDに変換することに関心のある研究者にとって重要です。
このプロトコルでは、RPEの病状を視覚化するために、光、透過電子、および共焦点顕微鏡のために目を準備する方法について説明します。また、統計的検定のためにRPEの病状を偏りのない方法で定量化する方法についても説明します。概念実証として、RPE表現型プロトコルを利用して、膜貫通タンパク質135-(Tmem135)過剰発現マウスおよび老化野生型(WT)C57BL/6Jマウスで観察された構造的RPE病理を調査します。要約すると、現在利用可能な標準プロトコルがないため、AMDマウスモデルでRPEを特徴付けるための表現型決定方法論を説明することを目的としています。AMDマウスモデルでも影響を受ける光受容体または脈絡膜の病状の調査と定量化に関心のある研究者は、このプロトコルが研究に役立たない可能性があります。

<table><tbody><tr><td>0.1 M カコジル酸緩衝液 pH7.2</td><td>PolyScientiifc R&D社</td><td>S1619</td><td></td></tr><tr><td>100容量スライドボックス</td><td></td><td></td><td>このプロトコルには2つ必要です(H&E染色スライドとRPEフラットマウント用。</td></tr><tr><td>100%エタノール&nbsp;</td><td>MDS Warehouse</td><td>2292-CASE</td><td>は、このプロトコルで希釈されたエタノール溶液を作るために使用することができます。</td></tr><tr><td>1ウェイストップコック、2メスルアーロック</td><td>Qosina</td><td>11069</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffer Solution (PBS)</td><td></td><td></td><td>このプロトコルでは、既製の1x PBSを使用することができます。&nbsp;</td></tr><tr><td>2.0 mLマイクロチューブ</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-283-LR</td><td></td></tr><tr><td>24キャビティ埋め込みカプセル代替品金型</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70165</td><td></td></tr>ル<tr><td>アーエンド付き24インチPVCチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1376778</td><td></td></tr><tr><td>400メッシュギルダー細いバースクエアメッシュグリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>T400-Cu95</td><td></td></tr><tr><td>%エタノール</td><td>MDSウェアハウス</td><td>2293-CASE</td><td></td></tr><tr><td>防水防湿バリア付き吸収性アンダーパッド(23インチ×24インチ)</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td></td></tr>調節<tr><td>可能な237ml&nbsp;スプレーボトル</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor488共役ロバ抗ウサギIgG&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイ</td><td></td><td></td><td></td></tr>ル <tr><td>BD 精密グライド 19 ゲージ シリンジ ニードル</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z192546</tr><tr><td>ワラビ鉗子;闉;細かいクロスセレーション;長さ4インチ、先端幅1mm</td><td>ロボズ手術器具</td><td>RS-5211</td><td>このプロトコルでは湾曲した鉗子として知られています。</td></tr><tr><td>ラクダの毛のブラシ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>65575-02</td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素安楽死チャンバー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素流量計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素タンクキャ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スタロイプロング延長クランプフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>05-769-7Q</td><td></td></tr><tr><td>鋳鉄製L字型ベースサポートスタンド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>11-474-207</td><td></td></tr><tr><td>Cell Prolifer Program</td><td></td><td></td><td>ダウンロード可能: https://cellprofiler.org/releases</td></tr><tr><td>クリア マニキュア</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Colorfrost 顕微鏡 スライド ラベンダー</td><td>VWR</td><td>10118-956</td><td></td></tr><tr><td>コンピューター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>このプロトコールでは、Milli-Q Purification System からの</td><td>蒸留 H20</td><td></td><td></td> 水を使用しました。</tr><tr><td>デュモンの細い先端ピンセット。パターン #55</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-4984</td><td>このプロトコルでは先端の細い鉗子と呼ばれ、このプロトコルには 3 つ必要です (解剖用に 2 つ、電子顕微鏡処理用に 1 つ)。</td></tr><tr><td>電子顕微鏡 グリッドホルダー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71147-01</td><td></td></tr><tr><td>EPON 815 樹脂</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>14910</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Mark-It 組織マーキング 黄色 染料</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>22050460</td><td>このティッシュマーキング染料を使用する際は、メーカーのプロトコルに従ってください。&nbsp;</td></tr><tr><td>Epredia 封入剤</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-610</td><td>H&Eスライド。&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Mi-150 イルミネーターシリーズ、150 w ハロゲン光源</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Mi-150</td> 顕微鏡<td>解剖用光源。</td></tr><tr><td>Fiji ImageJプログラム</td><td></td><td></td>をダウンロード<td>可能:https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>Flexaframe Castaloy Hook Connector</td><td>Thermo Scientific&nbsp;&nbsp;</td><td>14-666-18Q</td><td></td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド 2.5% リン酸緩衝液中、pH 7.4、32%</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>16537-05</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 透過型電子顕微鏡 (JEOL) ORIUS (1000) CCD カメラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラボ ベンチトップ シェーカー</td><td></td><td></td><td>これらの実験には2つ必要です。1つは室温で、もう1つは摂氏4度の冷蔵室にある必要があります。</td></tr><tr><td>レーザークライオタグラベル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>77564-05</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>ライカ EM UC7ウルトラミクロトーム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカライヒェルトウルトラカット Sミクロトー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ムリフタースリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22X22I24788001LS</td><td>これらのカバーガラスは、エッジが隆起しており、RPEの厚さに対応するため、RPEフラットマウントに使用します。</td></tr><tr><td>メイヤーのヘマトキシリン</td><td>VWR</td><td>100504-406</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas マイクロ解剖スプリングハサミ</td><td>Roboz 手術器具</td><td>RS-5600</td><td>プロトコルではマイクロ解剖ハサミとして知られています。&nbsp;</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td></td><td></td><td>このプロトコルでは、任意のAMDマウスモデルとそれに対応するコントロールが機能します。</td></tr><tr><td>マイクロ解剖はさみ;標準バージョン;闉;シャープポイント;ブレードの長さ24mm;全長4.5インチ</td><td>ロボズ手術器具</td><td>RS-5913</td><td>このプロトコルでは湾曲ハサミとして知られています。</td></tr><tr><td>マイクロソフトエクセル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブラック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン A1RS 共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ロバ 血清</td><td>SouthernBiotech</td><td>0030-01</td><td></td></tr><tr><td>ナンバー 11 滅菌済み 使い捨てメス刃</td><td>VWR</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、32%</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>ペンシル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR&nbsp;</td><td>21909-380</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td>ピ</tr><tr><td>ペット&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナル抗ZO-1抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>プロピレンオキシド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>20412</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>VWR</td><td>10040-386</td><td></td></tr><tr><td>マウス灌流</td><td></td><td></td><td></td>用浅皿</tr><tr><td>シャンドン エオシン Y アルコール</td><td>VWR</td><td>89370-828</td><td></td></tr><tr><td>シャーピー超極細チップブラック油性マーカー</td><td>ステープル</td><td>642736</td><td></td></tr><tr><td>染色用スライドラック</td><td>グレイン</td><td>ジャー49WF31</td><td></td></tr><tr><td>スクエアカバーガラススリップフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr>カバー <td>グレインジャー</td><td>付き染色皿</td><td>49WF30</td><td>H& に 15 が必要E染色手順。</td></tr><tr><td>ターゲットオールプラスチックディスポーザブルルアースリップ50mLシリンジ&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>S7510-50</td>シ<td>リンジバレルのみを使用してください。</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher</td><td>1464917</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>真空オーブン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>RPEフラットマウントの取り付けに使用。&nbsp;</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22050283 Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope</td><td></td><td></td><td>この顕微鏡は、ステッチされた20倍の画像を生成する能力を持っています。光学顕微鏡にこの容量がない場合は、わずかに重なり合っている網膜全体の画像を撮影します。Adobe Photoshopを使用して、これらの画像をつなぎ合わせます。画像のスティッチングについては、Adobe Photoshopプログラムのマニュアルを参照してください。&nbsp;</td></tr><tr><td>ツァイスステミ2000解剖顕微鏡</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>65575-02</td><td></td></tr></tbody></table>

加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者における衰弱性網膜障害です。網膜色素上皮(RPE)の機能不全は、AMDの重要な病態学的事象であると広く信じられています。RPE機能障害につながるメカニズムを理解するために、研究者はマウスモデルを利用することができます。以前の研究により、マウスはRPEの病状を発症する可能性があり、その一部はAMDと診断された個人の目に観察されることが確立されています。ここでは、マウスのRPE病態を評価するための表現型プロトコールについて説明します。このプロトコルには、光学顕微鏡と透過型電子顕微鏡を使用した網膜断面の準備と評価、および共焦点顕微鏡によるRPEフラットマウントの標本の作成と評価が含まれます。これらの手法によって観察されるマウスRPEの病状の一般的なタイプと、統計的検定のための偏りのない方法を通じてそれらを定量化する方法について詳しく説明します。概念実証として、このRPE表現型プロトコルを使用して、膜貫通タンパク質135(Tmem135)を過剰発現するマウスおよび野生型C57BL/6Jの老化マウスで観察されたRPEの病状を定量化しました。このプロトコルの主な目的は、AMDのマウスモデルを使用する科学者に、偏りのない定量的評価を伴う標準的なRPE表現型分析法を提示することです。

この記事に記載されているRPE表現型プロトコルの完成により、AMDのマウスモデルで一般的に観察される構造的RPE異常の定量的分析が可能になります。このプロトコルの有効性を確認するために、ニワトリベータアクチンプロモーター(Tmem135 TG)30によって駆動されるWT Tmem135を過剰発現するトランスジェニックマウスや、高齢のC57BL/6Jマウス31,32など、RPEの病状を示すことが知られているマウスで使用しました。これらの実験の目的は、このプロトコルに記載されている方法を使用して得られる代表的な結果を、マウスモデルに不慣れな研究者に示すことです。
プロトコルの ステップ1 の方法に従い、WTおよび Tmem135 TGマウスの眼を処理および評価し、光学顕微鏡を使用してRPEの病状を評価しました。生後4ヶ月の Tm...

マウスモデルは、網膜色素上皮(RPE)の生物学を調べるための有用なツールとなり得る。マウスは一連のRPE病理を発症する可能性があることが確立されています。ここでは、光、透過電子、および共焦点顕微鏡を使用してマウスのRPE病理を解明および定量化するための表現型プロトコルについて説明します。

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

このプロトコルは、光透過電子顕微鏡および共焦点顕微鏡を使用してRP病理のマウスサイズを処理および評価する方法を説明する最初のプロトコルです。このプロトコルの主な利点は、統計的比較のためにこれら3つの画像技術を使用して、RP病理の定量的評価を含めることです。このプロトコルに記載されている技術は、RPEの健康に重要な分子経路に関する知識を広げるのにも役立つ可能性があります。以前にマウスのサイズを解剖したことがない人は、このプロトコルに苦労する可能性があります。これらの個人は、このプロトコルで説明されている技術を習得するために、いくつかのマウスで練習することをお勧めします。まず、ドラフト内の心臓灌流用の吸収性アンダーパッドに重力供給灌流システムを準備します。40ミリリットルの新たに調製した固定液緩衝液を灌流システムのシリンジバレルに注ぎます。バルブをチューブラインと平行に回して、バッファーがチューブラインを流れるようにします。すべての気泡がラインから除去されるまで、ラインをフラッシュします。次に、バルブをチューブラインに対して垂直に回して、バッファーがチューブラインに流れ込まないようにします。心臓灌流を行うには、安楽死させたマウスを灌流システムの近くの浅いトレイに移します。腹部を上に向けて。腹部に70%エタノールをスプレーしてから、胸郭の下のマウスの左側の皮膚と腹壁を通して湾曲したハサミと鉗子を使用して5センチの劣った切り込みを作成します。下切り傷の上部にある皮膚と腹壁を通して3センチメートルの内側の切り込みを入れます。胸郭の下のマウスの最も遠い右側の皮膚と腹壁を通る内側の切り込みの端にさらに5センチメートルの劣った切り込みを入れます。湾曲した鉗子で腹部の皮膚皮弁を取り除くためにさらに3センチメートルの内側切開を行います。次に、横隔膜と胸骨を切り開いて心臓を露出させます。ゲージ針を心臓の左心室に挿入し、弁を回します。湾曲したハサミで右心房を切り、血液と固定剤が心臓から出るようにします。10ミリリットルの固定バッファーでマウスを1〜2分間灌流するか、肝臓の色が薄くなり、右心房から血液が流れなくなるまで待ちます。灌流が完了したら、バルブをチューブラインに対して垂直に回して、バッファーの流れを停止します。目を核にするには、浅いトレイからマウスを取り外し、ドラフトの吸収性アンダーパッドに置きます。次に、左目を実験者に向け、右目を視界から外して、マウスの頭を向けます。目の上側に組織マーキング染料で注釈を付けます。眼窩から目の突出のために、親指と人差し指で眼窩の周りをそっと押し下げます。次に、湾曲したハサミを使用して、眼窩から30度の角度で刃で目を持ち、目の周りを切ります。湾曲した鉗子で頭から眼球を取り除き、吸収性のアンダーパッドの上に置きます。11番のメスの刃で角膜をニックし、湾曲した鉗子で2ミリリットルの固定バッファーを含む2ミリリットルのマイクロチューブに目を置きます。両眼を核形成した後、固定バッファー中で4度の部屋でシェーカー上で75rpmの速度で一晩インキュベートします。翌日、固定液バッファーを2ミリリットルのPBSと交換し、室温および75rpmのシェーカー上で10分間インキュベートします。次に、後部セグメントを生成するために、解剖顕微鏡下でPBSで満たされたペトリ皿に眼を置きます。細い先端の鉗子で脂肪や筋肉を眼球からそっと持ち上げます。眼球が均一な青みがかった黒色になるまで、マイクロ解剖ハサミで眼球と平行方向に脂肪と筋肉を慎重にトリミングします角膜穿刺部位に細い先端の鉗子を置き、マイクロ解剖ハサミで穿刺部位から始まる角膜の周囲を切断して、眼球から角膜と虹彩を取り除きます。次に、先端の細い鉗子を使用して、眼球からレンズをそっと取り外して、後部セグメントを生成します。後部セグメントを2ミリリットルのPBSを含むチューブに入れ、使用するまで冷蔵庫で摂氏4度で保管します。PBSを含むペトリ皿に目を移し、示されているように角膜と虹彩を取り除きます。細い先端の鉗子でレンズを引き出します。次に、先端の細い2つの鉗子を使用して、神経網膜を後部セグメントからそっと分離します。後眼カップから取り除くために、視神経乳頭の神経網膜を慎重に切断します。アイカップを5マイクロリットルのPBSを含む2ミリリットルのマイクロチューブに入れます。後眼カップを固定するには、500マイクロリットルのメタノールを組織に加え、シェーカーで75rpmで5分間インキュベートします。メタノール固定を3回繰り返し、最終インキュベーションを2時間行います。固定後、組織をPBSで3回洗浄した後、免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡による可視化に進みます。4ヶ月齢のTMEM 135 TGマウスは、年齢を一致させた野生型マウスと比較して、視神経から600および900マイクロメートル離れた場所で網膜色素上皮またはRPE厚さの有意な減少を示した。325日齢のWTおよびTMEM 135 TGマウスの微小血管形成、大液胞化および遊走を含むRPE病態の発生率を計算した。RPE微小液胞化の平均頻度は、TMEM 135 TGマウスと比較して野生型で低かった。野生型では、TMEM 135 TGマウスで観察された平均値と比較して、RPEマクロ液胞化および遊走は検出されなかった。透過型電子顕微鏡では、24か月齢の網膜には基底層流沈着が観察されましたが、2か月齢の網膜には見られませんでした。基底層状沈着物高さの累積頻度の分析は、24ヶ月齢について線の右側へのシフトを示し、2ヶ月齢と比較して、24ヶ月齢のマウスにおける沈着の増加を実証した。この観察は、生後24か月の網膜の平均身長が高いことによって裏付けられました。4ヶ月齢のTMEM 135 TGマウスにおけるRPEは異形性であった。TMEM 135 TG網膜のRPEは、年齢が一致した野生型網膜よりも大きく、密度が低いです。また、対照と比較して、TG網膜においてより多くの多核RPE細胞が観察された。このプロトコルに従って、研究者はマウスの分子生物学的手法を使用して特定の経路を評価することができ、これらのRP病理がマウスでどのように発生するかの理解に貢献する可能性があります。このプロトコルは、マウスのRP表現型を標準化するのに役立ち、マウス研究の知見を他のAMDモデルに変換し、AMD病態生物学の理解に役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

尾静脈注射によって行われるインドシアニングリーン血管造影（またはICGA）は、マウス脈絡膜の異常を特徴付けるために、高品質のICGA経時画像を提供する。...

経時インドシアニングリーン血管造影による加齢黄斑変性症のマウスモデルにおける脈絡膜血管系の異常を検出する

ここでは、2000年代初頭にマルモラシュタイン、ピーチー、および同僚が最初に記述したDC-ERGとして知られている技術を用いて、マウスにおける網膜色素上皮(RPE)の光誘発電気応答を記録する方法を提示する。...

マウス網膜色素上皮の光誘発電気応答を記録するための直接結合電解電解(DC-ERG)

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

このプロトコルは、マウス網膜フラットマウントの調製および免疫蛍光染色および分析のための詳細な方法を記載する。マウスの仔に対するフルオレセイン眼底造影(FFA)の使用および画像処理についても詳細に説明されている。...

酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング

糖尿病性網膜症は、失明の主な原因の1つです。組織学、血液網膜関門破壊アッセイ、および蛍光血管造影は、網膜の病態生理学を理解するための貴重な技術であり、糖尿病性網膜症に対する効率的な薬物スクリーニングをさらに強化することができる。...

ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価

この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。...

不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

この原稿では、網膜色素上皮(RPE)細胞をマウスの目から段階的に単離するための簡略化されたプロトコルについて説明しています。このプロトコルには、マウスの目の除核と解剖、それに続くRPE細胞の単離、播種、培養が含まれます。...

初代マウス網膜色素上皮細胞の単離

ヒトの眼の網膜から網膜色素上皮(RPE)を効率的に分離し、RPEの組織学的および形態学的解析のためにRPE/脈絡膜フラットマウント全体を生成する方法について説明します。...

組織学的分析のためのヒトの眼からの網膜色素上皮/脈絡膜フラットマウントの効率的かつ一貫した生成

網膜色素上皮(RPE)は、脈絡膜と網膜との間の重要な障壁として機能し、光受容体などの網膜細胞タイプの健康と機能を促進します。ここでは、成体マウスRPEを単離および培養するための簡単で効果的なプロトコルについて説明します。...

成体マウスからの網膜色素上皮細胞の単離および培養のための簡易法

タンデムスプライシングイベントは、12ヌクレオチド未満の場所で発生します。このようなスプライスバリアントの比率を定量化することは、絶対定量PCRアプローチを使用して実現可能です。この原稿では、2つのスプライシングイベントがSerine-701の包含/排除およびα/β...

STAT3スプライスバリアント転写産物を定量化するために絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

学ぶ 加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素上皮病変の評価・定量化プロトコル。光学顕微鏡、透過型電子顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡を用いた定量的アセスメントにより、RPEの健康状態を統計的に比較解析する手法を解説します。

加齢黄斑変性症マウスモデルにおける網膜色素性上皮病変を評価および定量化するためのプロトコル

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