Name: ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学ぶショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法サンプル調製プロセス。金属メッシュを用いて試料のカールを防ぎ、超微細構造解析の品質を向上させる革新的な方法です。

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本研究は、中国自然科学基金会(Natural Science Foundation of China Grant 32070811)およびSoutheast University (China) Analysis Test Fund 11240090971の支援を受けて行われました。中国南京の東南大学医学部電子顕微鏡研究所および形態素解析センターに感謝します。

注:この記事で使用した透過型電子顕微鏡サンプル調製法は、以前に報告されています16。サンプルによっては、試薬の選択と投与量の調整が必要であることに注意することが重要です。サンプル調製プロセスで使用される有毒な化学試薬は多数あるため、オペレーターは防護服や手袋の着用、ヒュームフードでの操作など、特定の保護措置を講じる必要があります。
1. 解剖、固定、留置の手順
<ol><li>解剖<ol><li>さまよう後期3年生の幼虫をJan溶液で解剖し、標準的な手順17に基づいて全身壁を取得します。Janの溶液を次のように調製します:128 mM NaCl、2 mM KCl、4 mM MgCl2、35 mMスクロース、5 mM HEPES、pH 7.4 注: ショウジョウバ エの幼虫の体壁は、ショウジョウ バエの幼虫期の外側の覆いまたは外皮を指します。これには、キューティクル、表皮細胞、および幼虫の外骨格を形成するその下にある組織が含まれます。体壁は構造的な支持と保護を提供し、幼虫の体と外部環境との間の障壁として機能する17。</li>
	</ol></li>
	<li>固定<ol><li>解剖室の幼虫の体壁を固定剤で一晩4°Cに固定します。固定液を調製するには、2%グルタルアルデヒドと2%ホルムアルデヒドを0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)に混合します</li>
		<li>サンプルをカコジル酸ナトリウム緩衝液で数回すすぎます。</li>
		<li>カコジル酸緩衝液中に1%OsO4 を調製します。サンプルを1%OsO4 に2時間固定した後、蒸留水で数回すすぎます。 注:アルデヒドとOsO4 による二重固定は、細胞の超微細構造のより良い保護を提供します。さらに、OsO4 はサンプル組織を染色することができ、光とサンプルとの間のコントラストがより明白になることを可能にする18。</li>
		<li>ショウジョウバエの神経筋接合部サンプルを2%飽和酢酸ウラニルで2時間染色した後、脱イオン水で数回すすぎます(図1A)。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルの配置<ol><li>同サイズ(細孔径270μm)の丸い金属メッシュを2枚ハサミで切ります。</li>
		<li>あらかじめ平底ボトルの底に金属メッシュ(270μm)を敷いておきます。</li>
		<li>固定された幼虫サンプルをメッシュに配置し、次に別のメッシュを配置して、サンプルが 2 つのメッシュの間に配置されるようにします。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 脱水症状
注:この論文では、エタノール勾配脱水法を使用しました。
<ol><li>エタノールの濃度勾配を増加させる中で、サンプルを順次(50%、70%、85%、95%各1回、100%2回)、それぞれ4°Cで20分間脱水します。</li>
	<li>サンプルをプロピレンオキシドで室温で毎回5分間2回すすぎます(図1C)。</li>
</ol>3. 潜入
注:浸潤は、TEMサンプル調製に必要なステップの1つです。浸潤は、脱水媒体を試料中の包埋媒体と徐々に置換し、細胞間を包埋媒体19で満たすことを可能にする。
<ol><li>サンプルをプロピレンオキシドとエポキシ樹脂の混合溶液に1:1と1:2の比率でそれぞれ1時間置き、続いて純粋なエポキシ樹脂を室温で2時間置きます。</li>
</ol>4. 埋め込み
<ol><li>ポリエチレンフィルムを準備し、大きな正方形(約5×5 cm)と小さな中空の長方形のサポート(約2 × 2 cm)にカットします。小さな正方形を大きな正方形に接着します。</li>
	<li>大きな正方形の中央に十分なエポキシ樹脂を事前に配置します。</li>
	<li>筋肉側を上に向けて、事前に配置したエポキシ樹脂にサンプルを置きます。ステレオスコープを使用します。</li>
	<li>サンプルに樹脂を数滴加え、PEフィルム(スペーサーより少し大きい)で覆います(図1D-E)。</li>
	<li>サンプルを37°C、42°C、60°Cでそれぞれ24時間重合します(図1F)。</li>
</ol>5. セクショニングの手順
<ol><li>鋭利な刃で幼虫の体壁の余分な部分を取り除き、A2 / A3 セグメントを含む台形を保持します。 注:一番上の線は13番目の 筋肉の近くにあり、ベースラインはサンプルからエポキシ樹脂まで離れている必要があります。トップラインとベースラインの間の高さは約5〜8mmです。</li>
	<li>サンプルの残りの部分から台形を取り除き、A / B接着剤で樹脂を充填したカプセルに接着します。</li>
	<li>光学顕微鏡下でA2およびA3セグメントの6番目と7番目の筋肉の位置を確認し(図1G)、接平面を6番目の筋肉と平行に保ちます。</li>
	<li>A3 セグメントの両側に沿ってサンプルの 5 分の 1 を切り取ります。 注:6番目の 筋肉のほとんどを取り除き、7番目の 筋肉の幅の1/3を保持します。</li>
	<li>極薄ミクロトームを使用して、サンプルの6番目の 筋肉から始まる極薄切片を調製します。 注:各スライスの厚さは約90 nmです。</li>
	<li>各銅メッシュにできるだけ多くのスライスをアタッチします。</li>
	<li>前述の16のように透過型電子顕微鏡法を実施する。</li>
</ol>

<ol><li>Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+fat+crystal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Nanostructured fat crystal systems.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Winans, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+investigation+of+ecological+differentiation+between+free-living+and+Drosophila-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria.</a> Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).</li>
<li>Phelps, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+motor+control+circuits+in+adult+Drosophila+using+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy.</a> Cell. 184 (3), 759-774 (2021).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+micro-+and+macroarchitectural+analysis+of+the+Drosophila+brain+by+computer-assisted+serial+section+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy.</a> PLoS Biology. 8 (10), (2010).</li>
<li>Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+demethylase+KDM5+is+required+for+synaptic+structure+and+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Cell Reports. 34 (7), 108753(2021).</li>
<li>Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexin%2C+neuroligin+and+wishful+thinking+coordinate+synaptic+cytoarchitecture+and+growth+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+and+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions.</a> Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).</li>
<li>Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexin+and+neuroligins+maintain+the+balance+of+ghost+and+satellite+boutons+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19(2020).</li>
<li>Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%3A+comparison+of+wild+type+and+mutants+with+increased+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).</li>
<li>Ashley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-like+gag+protein+Arc1+binds+RNA+and+traffics+across+synaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons.</a> Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+glutamate+receptor+field+size+by+nonvesicular+glutamate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release.</a> Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).</li>
<li>Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+Drosophila+melanogaster+display+altered+pre-+and+postsynaptic+ultrastructure+at+adult+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).</li>
<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li>
<li>McCabe, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP+homolog+Gbb+provides+a+retrograde+signal+that+regulates+synaptic+growth+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).</li>
<li>Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+analysis+method+of+neuromuscular+junction+in+Drosophila.+larvae+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Science+International%22%5BJournal%5D)">Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy.</a> Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), e1107(2009).</li>
<li>Lovrić, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+of+chemically+fixed+cells+in+preparation+for+NanoSIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS.</a> Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).</li>
<li>Woods, P. S., Ledbetter, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+organelles+at+uncoated+cryofractured+surfaces+as+viewed+with+the+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope.</a> Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).</li>
<li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).</li>
<li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).</li>
<li>Lloyd, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p150%28Glued%29+CAP-Gly+domain+regulates+initiation+of+retrograde+transport+at+synaptic+termini%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini.</a> Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).</li>
<li>Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+plasticity+of+motor+axons+in+Drosophila+mutants+with+altered+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability.</a> Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+4+regulates+synaptic+growth+via+the+bone+morphogenetic+protein+%28BMP%29+signaling+pathway+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pre-synaptic+function+of+shank+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).</li>
<li>Gan, G., Lv, H., Xie, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+identification+and+development+of+neurite+in+Drosophila+ventral+nerve+cord+neuropil%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil.</a> PLoS One. 9 (8), 105497(2014).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

ショウジョウバエ の幼虫のサンプルは、サンプルが薄いため、脱水中に丸くなる傾向があり、神経筋接合部を正確に特定することが困難になり、サンプル調製の困難さと作業負荷が増加します。従来の改善は、サンプル7を短くすることですが、サンプルはまだ異なる程度にカールしていました。
私たちの方法では、2つの重要なステップがあります:まず、金属メッシュの制限により、サンプルは脱水プロセス全体を通じて平らのままです。また、重合過程では、温度変化による試料の折り畳みを防止するために、プラスチック製品の間に挟み込んで重合させることができるため、試料の観察や光学顕微鏡下での標的筋の位置把握が容易になります。しかし、この方法の欠点は、樹脂とプラスチックが付着するため、サンプルを回収しにくいという点です。
私たちの方法で得られる平らな樹脂シートは、従来の埋め込みブロックよりもトリミングと位置決めに優れています。サンプルの周りの樹脂をできるだけトリミングすることで、作業の難しさと労力を大幅に...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei1 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2 
Sheng Qingyuan3 
Ou Yutong1 
Chen Mei3 
Zhang Chenchen1 
1The School of Medicine, Southeast University, 
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 
3The School of Life Science and Technology, Southeast University 
Corresponding Authors:&#160;Gan Guangming,&#160;Sheng Qingyuan

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64934">Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

電子顕微鏡は、ナノスケールレベル1で細胞の内部構造を視覚的かつ正確に示すことができる、生体材料の超微細構造を研究するための最も理想的な方法の1つです。しかし、サンプル調製プロセスが複雑でコストが高いため、電子顕微鏡は光学顕微鏡ほど普及していません。近年の電子顕微鏡技術の進歩により、画質の大幅な向上がもたらされ、それと同時に関連する作業負荷も大幅に減少しています。そのため、電子顕微鏡は、さまざまな分野で科学知識を進歩させる上で重要な役割を担っています2。
ショウジョウバエは、標的遺伝子の空間的および時間的発現を正確に制御するための遺伝子操作を行うための優れた動物モデルです3。その上、ショウジョウバエには、哺乳類のモデルと比較して成長期間が短く、飼育が容易であるという利点があります。したがって、ショウジョウバエは形態学研究で広く使用されています4,5。
ショウジョウバエの幼虫では、神経筋接合部(NMJ)ブートンは筋肉に広く分布しており6,7、NMJの免疫染色は、シナプスの量と形態に関する情報を容易に提供できる8,9。A2およびA3セグメントの6番目/7番目の筋肉に位置するNMJボタンは、光学顕微鏡を使用した定量的および形態学的研究に適しています。これは、そのサイズと豊富さ10,11のためです。したがって、ショウジョウバエの幼虫のNMJは、神経科学研究の有用なモデルと考えられている12。
しかし、TEMでNMJブートンの超微細構造を観測することは困難です。透過型電子顕微鏡の走査窓が狭いため、広く分布しているNMJボタン13の位置決めが困難である。他の理由は、 ショウジョウバエ の体壁がサンプル調製プロトコル7のアルコール脱水ステップ中にカールしやすいことです。
従来の研究では、通常、A2 と A3 セグメントの 6番目と 7番目の筋肉の間のボタンが、その豊富さとサイズ14,15 のためにサンプル材料として選択されています。A2とA3セグメントの6番目と7番目の筋肉は、他の筋肉よりも大きく、より多くのブートンを含んでいます。しかし、電子顕微鏡用に試料を作製すると、固定された試料は薄くなり、カールしやすくなり、A2およびA3セグメントの6番目と7番目の筋肉の位置が不適切になっていました。
我々はここに、従来のサンプル調製方法と比較して、サンプルのカールを防ぐのにより効果的な新しい処理手順を報告する 7,16、その後の脱水中にサンプルを平らに保つことにより、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部のより良い位置決めを容易にする。

<table><tbody><tr><td>1,2-エポキシプロパン</td><td>上海 凌鳳化学試薬 CO., LTD</td><td>JYJ 037-2015</td><td>浸透剤</td></tr><tr><td>ショウジョウバエ 株式</td><td>ブルーミントン</td><td>なし</td><td>この研究で使用した野生型対照のショウジョウバエ株はすべて W1118 であり、標準的な培養方法に従って飼育されました</td></tr><tr><td>平底ガラス試験管</td><td>Haimen Chenxing Experimental equipment Company&nbsp;</td><td>なし</td><td>平底ガラス試験管(ボトル)スポンジプラグ付(またはボトルストッパー)</td></tr><tr><td>K4M架橋剤</td><td>&nbsp;Agar Scientific</td><td>Cat# 1924B</td><td>埋め込み樹脂は、高度に架橋されたアクリレートとメタクリレートの処方に基づいています&nbsp;</td></tr><tr><td>K4M樹脂(モノマーB)</td><td>&nbsp;寒天科学</td><td>ロット#631557</td><td>樹脂モノマー</td></tr><tr><td>ポリビニルフィルム</td><td>海門晨興実験装置会社&nbsp;</td><td>なし</td><td>透明ポリエチレンフィルムは最高、厚さ約0.2mm</td></tr><tr><td>SPI Chem DDSA</td><td>SPI</td><td>SpI#02827-AF</td><td>ドデセニル無水コハク酸</td></tr><tr><td>SPI-Chem DMP-30 エポキシ</td><td>SPI</td><td>02823-DA</td><td>加速器</td></tr><tr><td>SPI-Chem NMA</td><td>SPI</td><td>SpI#02828-AF</td><td>エポキシ用硬化剤</td></tr><tr><td>SPI-PON 812 エポキシ</td><td>SPI</td><td>SPI#0259-AB</td><td>樹脂モノマー</td></tr><tr><td>スチールメッシュ&nbsp;</td><td>Yuhuiyuan Gardening Store(オンライン)</td><td>なし</td><td>銅またはステンレス鋼ネット</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>Hitachi H-7650</td><td>11416692</td><td>すべてのグリッド(サンプルが収集されたもの)をクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡で観察しました。</td></tr><tr><td>極薄ミクロトーム</td><td>ライカUC7超薄型ミクロトーム</td><td>595915</td><td>ライカUC7超薄型ミクロトームでは、すべての切片作成作業がダイヤモンドナイフを使用して行われます</td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)は、神経科学の分野で貴重なモデルシステムとして浮上しています。ショウジョウバエNMJでの共焦点顕微鏡の適用により、研究者はシナプスの存在量に関する定量的データとそれらの形態に関する詳細な洞察の両方を網羅するシナプス情報を取得することができます。しかし、TEMの拡散分布と限られた視認範囲は、超微細構造解析に課題をもたらします。本研究では、従来のアプローチを凌駕する革新的で効率的なサンプル調製法を紹介します。この手順は、平底のボトルまたは試験管の底に金属メッシュを配置することから始まり、次に固定された幼虫サンプルをメッシュに配置します。追加のメッシュがサンプル上に配置され、サンプルが 2 つのメッシュの間に配置されます。固定されたサンプルは、包埋手順に進む前に、完全に脱水され、浸透されます。その後、サンプルをエポキシ樹脂に平らにシート状に埋め込むことで、筋肉の位置決めや切片作成のための準備が可能になります。これらのステップにより、ショウジョウバエの幼虫のすべての筋肉を光学顕微鏡で視覚化することができ、その後の位置決めと切片作成が容易になります。余分な樹脂は、体節A2とA3の6番目と7番目の筋肉を見つけた後に除去されます。6番目または7番目の筋肉の連続的な超薄切片化が行われます。

ショウジョウバエの幼虫の体壁は、規則的なパターンで配置された30の識別可能な筋線維で構成されており、解剖および固定後の薄いスライスのように見えます21(図1A)。脱水プロセス中、サンプルは金属メッシュの存在により平坦なままです(図1B、C)。幼虫の体の筋肉は、エポキシ樹脂製の薄いプレートに埋もれており(図1D-G)、樹脂充填カプセルに簡単かつ正確に配置され、接着されています(図1H、I)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" s...

このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの 神経筋接合部の超微細構造分析に特に有用です。

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

TEMの拡散分布と限られた視覚範囲は、インフラストラクチャ解析に課題をもたらします。このプロトコールは、従来のアプローチを超える革新的で効率的なサンプル調製法を提供します。この高度なTEMサンプル調製方法は、従来の方法と比較して、その後の脱水中にサンプルを平らに保つことにより、サンプルのカールを防ぐのに効果的です。試薬の選択や投与量の調整は、サンプルの種類に応じて必要となります。サンプル調製プロセスで使用される多くの有毒な化学試薬があります。手順を実演するのは、Gan Guangming博士の研究室の修士課程の学生であるSheng Qingyuanです。まず、さまよう後期3齢のショウジョウバエの幼虫をJan溶液で解剖し、標準的な手順に従って全身壁を取得します。幼虫の体壁を解剖室に固定剤で摂氏4度で一晩固定します。翌日、幼虫の体壁を解剖室から1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移し、カコジル酸ナトリウム緩衝液で数回すすぎます。幼虫の体壁を1%四酸化オスミウムで2時間固定します。固定後、サンプルを蒸留水で数回洗浄します。2%飽和酢酸小便器溶液をチューブに加え、PHI神経筋接合部を染色します。そして2時間後、サンプルを脱イオン水ですすいでください。次に、はさみを使用して、細孔サイズ270ミクロンの金属メッシュの2つの丸い部分を切り取ります。金属メッシュを平底のボトルの底に置きます。次に、固定された幼虫をメッシュに配置し、続いて別のメッシュを配置します。サンプルをエタノール濃度の増加中で、摂氏4度でそれぞれ20分間脱水します。次に、サンプルをプロピレンオキシドで室温でそれぞれ5分間2回すすぎます。次に、サンプルをプロピレンオキシドとエポキシ樹脂溶液に入れ、続いて純粋なエポキシ樹脂を室温で2時間置きます。埋め込むには、ポリエチレンフィルムを大きな正方形と小さな中空の長方形の支柱にカットします。小さな正方形を大きな正方形に接着します。大きな正方形の中央に十分なエポキシ樹脂を追加します。次に、ステレオスコープをオンにし、筋肉側を上に向けて、事前に配置したエポキシ樹脂にサンプルを配置します。サンプルにエポキシ樹脂を数滴加え、ポリエチレンフィルムで覆います。重合するサンプルを、それぞれ24時間ずつ昇温させます。重合後、鋭利な刃を使用して、A2およびA3セグメントを含む台形を保持しながら、幼虫の体の余分な部分を取り除きます。残った幼虫の体壁から台形を取り出し、AB接着剤で樹脂充填カプセルに貼り付けます。光学顕微鏡下で、A2およびA3セグメントの6番目と7番目の筋肉の位置を確認し、接面を6番目の筋肉と平行に保ちます。次に、A3セグメントの両側に沿ってサンプルの5分の1を切り取ります。ミクロトームを使用して、サンプルの6番目の筋肉から始まる極薄切片を調製します。セクショニング後、各銅メッシュにできるだけ多くのスライスを取り付けます。透過型電子顕微鏡を使用してサンプルを観察します。Lowicryl K4M樹脂とエポキシ樹脂の中で、Lowicryl K4M樹脂はショウジョウバエの体筋のより鮮明で観察しやすい結果を提供しました。共焦点イメージングは、第6筋と第7筋の間の神経筋接合部の視覚化を強化したことを示しました。透過型電子顕微鏡法により、ビーズ状の神経筋接合部が明らかになり、シナプス構造情報が改善されました。サンプルは、金属メッシュの制限により、脱水プロセス全体を通じて平らのままでした。また、プラスチック製品間でサンプルを重合させ、サンプルの折り畳みを防いでいます。将来的には、TEMサンプル調製法を脳および腹側神経索のニューロピーに適用できるようになり、それによって超微細構造研究の可能性が向上します。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法サンプル調製プロセス。金属メッシュを用いて試料のカールを防ぎ、超微細構造解析の品質を向上させる革新的な方法です。

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化

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