ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部の透過型電子顕微鏡法のためのサンプル調製プロセスの最適化
September 15th, 2023
このレポートは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部を視覚化するための新しいサンプル調製手順を提供します。この方法は、従来の方法と比較してサンプルのカールを防ぐのにより効果的であり、 ショウジョウバエの 神経筋接合部の超微細構造分析に特に有用です。
TEMの拡散分布と限られた視覚範囲は、インフラストラクチャ解析に課題をもたらします。このプロトコールは、従来のアプローチを超える革新的で効率的なサンプル調製法を提供します。この高度なTEMサンプル調製方法は、従来の方法と比較して、その後の脱水中にサンプルを平らに保つことにより、サンプルのカールを防ぐのに効果的です。
試薬の選択や投与量の調整は、サンプルの種類に応じて必要となります。サンプル調製プロセスで使用される多くの有毒な化学試薬があります。手順を実演するのは、Gan Guangming博士の研究室の修士課程の学生であるSheng Qingyuanです。
まず、さまよう後期3齢のショウジョウバエの幼虫をJan溶液で解剖し、標準的な手順に従って全身壁を取得します。幼虫の体壁を解剖室に固定剤で摂氏4度で一晩固定します。翌日、幼虫の体壁を解剖室から1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移し、カコジル酸ナトリウム緩衝液で数回すすぎます。
幼虫の体壁を1%四酸化オスミウムで2時間固定します。固定後、サンプルを蒸留水で数回洗浄します。2%飽和酢酸小便器溶液をチューブに加え、PHI神経筋接合部を染色します。
そして2時間後、サンプルを脱イオン水ですすいでください。次に、はさみを使用して、細孔サイズ270ミクロンの金属メッシュの2つの丸い部分を切り取ります。金属メッシュを平底のボトルの底に置きます。
次に、固定された幼虫をメッシュに配置し、続いて別のメッシュを配置します。サンプルをエタノール濃度の増加中で、摂氏4度でそれぞれ20分間脱水します。次に、サンプルをプロピレンオキシドで室温でそれぞれ5分間2回すすぎます。
次に、サンプルをプロピレンオキシドとエポキシ樹脂溶液に入れ、続いて純粋なエポキシ樹脂を室温で2時間置きます。埋め込むには、ポリエチレンフィルムを大きな正方形と小さな中空の長方形の支柱にカットします。小さな正方形を大きな正方形に接着します。
大きな正方形の中央に十分なエポキシ樹脂を追加します。次に、ステレオスコープをオンにし、筋肉側を上に向けて、事前に配置したエポキシ樹脂にサンプルを配置します。サンプルにエポキシ樹脂を数滴加え、ポリエチレンフィルムで覆います。
重合するサンプルを、それぞれ24時間ずつ昇温させます。重合後、鋭利な刃を使用して、A2およびA3セグメントを含む台形を保持しながら、幼虫の体の余分な部分を取り除きます。残った幼虫の体壁から台形を取り出し、AB接着剤で樹脂充填カプセルに貼り付けます。
光学顕微鏡下で、A2およびA3セグメントの6番目と7番目の筋肉の位置を確認し、接面を6番目の筋肉と平行に保ちます。次に、A3セグメントの両側に沿ってサンプルの5分の1を切り取ります。ミクロトームを使用して、サンプルの6番目の筋肉から始まる極薄切片を調製します。
セクショニング後、各銅メッシュにできるだけ多くのスライスを取り付けます。透過型電子顕微鏡を使用してサンプルを観察します。Lowicryl K4M樹脂とエポキシ樹脂の中で、Lowicryl K4M樹脂はショウジョウバエの体筋のより鮮明で観察しやすい結果を提供しました。
共焦点イメージングは、第6筋と第7筋の間の神経筋接合部の視覚化を強化したことを示しました。透過型電子顕微鏡法により、ビーズ状の神経筋接合部が明らかになり、シナプス構造情報が改善されました。サンプルは、金属メッシュの制限により、脱水プロセス全体を通じて平らのままでした。
また、プラスチック製品間でサンプルを重合させ、サンプルの折り畳みを防いでいます。将来的には、TEMサンプル調製法を脳および腹側神経索のニューロピーに適用できるようになり、それによって超微細構造研究の可能性が向上します。
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概要
このレポートは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部の可視化のための新しいサンプル調製手順を紹介し、超微細構造分析を強化します。この方法は従来の手法と比較してサンプルのカーリングを効果的に防ぎ、神経筋接合部の構造の詳細な観察に有用性を示しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学的イメージング
- 超微細構造分析
背景
- 神経筋接合部の可視化は、サンプルのカーリングによって課題を提示します。
- 透過型電子顕微鏡（TEM）が一般的に使用されていますが、視覚範囲を制限する可能性があります。
- サンプルの安定性と分析品質を向上させるための革新的な方法が必要です。
研究の目的
- サンプルの完全性を維持するサンプル調製方法を開発すること。
- ショウジョウバエの神経筋接合体の可視化を強化すること。
- 他の種類の神経組織に適用可能な超微細構造分析のプロトコルを提供すること。
使用された方法
- イメージングに透過型電子顕微鏡を使用しました。
- 生物学的モデルとしてショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部に焦点を当てました。
- 固定、染色、脱水、埋め込みなどの特定のステップを含みました。
- 脱水中のサンプルカーリングを防ぐために金属メッシュを使用しました。
主な結果
- 新しい方法により、調製と重合中のサンプルが平坦な状態を保つことができました。
- 神経筋接合体の可視化を強化するために共焦点イメージングを使用しました。
- 結果は従来の方法と比較してシナプス構造の可視性が向上していることを示しました。
結論
- この研究は神経筋接合体分析のためのサンプル調製に大きな進歩を提示します。
- この方法論により、神経構造のより良い観察が可能になり、他の神経生物学的研究分野での応用が可能です。
- 結果はショウジョウバエモデルにおけるシナプス構造と機能分析の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust ultrastructural analysis of neuromuscular junctions in Drosophila larvae is critical for early-stage neuroscience target validation and mechanistic de-risking. This optimized TEM sample preparation method enhances morphological fidelity and quantitative imaging, supporting predictive confidence in synaptic biology workflows. Improved sample integrity directly impacts the reliability of downstream discovery and translational research decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution interrogation of synaptic architecture for mechanistic pathway clarification.
- Reduces sample distortion, supporting functional target validation in neuromuscular models.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage in neurobiology programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated, flat biological samples for reproducible imaging workflows.
- Supports quantitative assessment of synapse abundance and morphology for assay standardization.
- Enables reliable comparison of compound effects on neuromuscular junction structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ultrastructural findings with disease-relevant synaptic biomarkers in preclinical models.
- Provides continuity from discovery imaging to translational validation of neural targets.
- De-risks advancement decisions by ensuring morphological endpoints are robust and reproducible.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and preclinical imaging, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Maintains sample flatness for accurate ultrastructural hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables precise measurement of synaptic features, supporting statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery imaging with preclinical biomarker validation in neuromuscular systems.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, scalable protocol adaptable to other neural tissues and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic biology.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neurobiological assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by ensuring robust morphological endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in TEM sample handling and neuromuscular dissection.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of reagent selection and dosage adjustments.
- Adaptable to other neural tissues with consideration of tissue-specific preparation needs.
- Involves handling of toxic reagents, requiring strict adherence to safety protocols.
