全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

イオンチャネルは生体膜では静的ではありません。ここでは、側方膜拡散とイオンチャネル機能の間のリンクを解明するための単一分子光学的アプローチを紹介します。他の方法に対するこの技術の主な利点は、それらの側方運動および機能を妨げる可能性のあるタンパク質の蛍光標識が不要であることである。

この方法は、自由拡散または制限拡散が組織化および機能にとって重要なあらゆる膜タンパク質チャネルに適用できます。まず、380マイクロリットルのDPhPCストック溶液をガラスバイアルに移し、脂質ストック溶液をアルゴンまたは窒素ガスで覆い、脂質酸化を防ぎます。脂質が溶解している有機溶媒の蒸発、またはバイアルからの溶媒スプレーの飛散を避けるために、可能な限り低いガス流量を使用してください。

脂質サンプルを窒素気流下で乾燥させ、オイルフリー真空ポンプを使用して真空下で脂質サンプルから残りの有機溶媒を一晩除去します。1ミリリットルのピペットを使用して等量のヘキサデカンとシリコーンオイルを1ミリリットルあたり9.5ミリグラムの最終脂質濃度まで添加することにより、脂質フィルムをヘキサデカンシリコーンオイル溶液に溶解します。ガラス製のカバースリップホルダーに入れ、ガラスビーカーで超音波洗浄機のアセトンで約10分間洗浄します。

カバーガラスを二重脱イオン水ですすぎ、窒素の流れの下で乾燥させます。さらに、カバーガラスをプラズマクリーナーで酸素で5分間洗浄して親水性にします。プラズマ処理されたカバーガラスをスピンコーターに取り付け、140マイクロリットルの加熱した0.75%低融点アガロースを200マイクロリットルのピペットで3, 000 RPMで30秒間ゆっくりと添加することにより、カバーガラスにサブマイクロメートルの厚さのアガロースフィルムをコーティングします。

アガロースヒドロゲルの薄層を含むスピンコーティングされたカバーガラスをPMMAチャンバーの下側に直ちに取り付けます。アガロースヒドロゲルが上を向いていることを確認してください。カバーガラスの端を透明な粘着テープでPMMA微細加工デバイスに固定し、摂氏35度に加熱したホットプレートにデバイスを置きます。

気泡を発生させずに、200マイクロリットルの2.5%アガロース溶液をチャンバーの入口に慎重に注ぎます。PMMAチャンバーのウェルを直ちに約60マイクロリットルの脂質オイル溶液で覆い、アガロースオイル界面で脂質単層形成を開始し、PMMAチャンバーのウェル内のスピンコートアガロースの脱水を回避します。デバイスを摂氏35度のホットプレートに約2時間置きます。

約20マイクロリットルの脂質ヘキサデカンシリコーンオイル溶液を、液滴インキュベーションチャンバー内のいくつかの微細加工ウェルのそれぞれに入れます。垂直または水平のマイクロピペットプーラーを使用して、先端開口部直径が約20マイクロメートルのマイクロキャピラリーガラス針を準備します。8.8ミリモルのHEPES、7マイクロモルの蛍光色素、Fluo-8、400マイクロモルのEDTA、1.32モルの塩化カリウム、30ナノモルのTOMコアコンプレックス、または20ナノモルのOMPFを含む約5マイクロリットルの水性注射液を針に入れます。

ピエゾ駆動のナノインジェクターに水性注入液とともに針を取り付け、ナノインジェクターを使用して脂質ヘキサデカンシリコーンオイル溶液で満たされた液滴インキュベーションチャンバー内のウェルに100〜200ナノリットルの水性液滴を注入します。摂氏35度に加熱されたホットプレート上にPMMAおよび液滴インキュベーションチャンバーを維持することにより、液滴油界面に脂質単層を約2時間形成させる。10マイクロリットルの使い捨てポリプロピレンチップを備えたシングルチャンネルマイクロリットルピペットを使用して、液滴インキュベーションチャンバーのウェルからPMMAチャンバーのウェルに個々の水性液滴を手動で移します。

液滴をヒドロゲル-油界面の脂質単層上に沈め、液滴とアガロースヒドロゲルの間に脂質二重層を形成する。液滴界面二層膜またはDIB膜を備えたPMMAチャンバーを倒立光学顕微鏡のサンプルホルダーに取り付け、10倍ホフマン変調コントラスト対物レンズを使用して膜形成を評価します。DIB膜が形成されている場合は、従来の落射蛍光照明用光源、488ナノメートルレーザー、裏面入射型電子増倍CCDカメラを備えたTIRF顕微鏡のサンプルホルダーにPMMAチャンバーを取り付け、約0.16マイクロメートルのピクセルサイズを実現します。

GFPフィルターセットを使用して、高輝度光源の落射蛍光照明下で、10倍の倍率対物レンズでDIBメンブレンの端に焦点を合わせます。DIB膜の同じエッジを100x NA 1.49アポクロマートオイルTIRF対物レンズで高倍率でファインフォーカスし、GFPフィルターセットを使用して高輝度光源で落射蛍光照明下で再び焦点を合わせます。フィルター設定をGFPからクワッドバンドTIRFフィルターセットに変更し、488ナノメートルレーザーのスイッチを入れ、対物レンズのレーザーの強度を設定します。

単一イオンチャネルを視覚化するには、TIRF角度とEM CCDカメラゲインを調整して、DIBメンブレンの開いたイオンチャネルが暗い背景に高コントラストの蛍光スポットとして表示され、S/バックグラウンド比が最大になるようにします。単一のイオンチャネルを通るカルシウムイオンフラックスに対応するスポットに焦点が合ったままで、中央で高強度の丸い形状を持ち、周辺に向かって徐々に減少することを確認します。蛍光スポットに焦点が合っていることを確認して、イオンチャネルがDIB膜に再構成され、膜面内を横方向に移動していることを確認します。

最後に、位置の適切な追跡と個々のイオンチャネルの開閉状態のモニタリングを可能にする一連の膜画像を記録します。横方向の移動度の種類とチャネル活動の状態を判断するには、十分に長く、十分にサンプリングされた軌道を取得します。ニューロスポラ・クラッサTOM-CCのクライオEM構造を以下に示す。

6-Hisタグを有するTOM 22を含むN.crassa染色由来のミトコンドリアをDDMに可溶化し、ニッケルNTAアフィニティークロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。ここでは、単離されたTOM-CC結晶構造のSDS-PAGEと、比較に用いた精製大腸菌OMPFのSDS-PAGEを示します。TOM-CCの対応する軌跡における蛍光振幅トレースは、TOM-CCの開-閉チャネル活性が複合体の側方膜移動度と相関していることを示している。

振幅トレースには、移動チャネルに対応する全開状態、中間透磁率状態、非移動チャネルに対応する閉チャネル状態の3つの透磁率状態が表示されます。中間状態のTOM-CCは、その平均位置の周りで約プラスマイナス60ナノメートルぐらつきます。OMPFの対応する軌跡における蛍光振幅トレースをここに示します。

OMPFは、動いているか閉じ込められているかに関係なく、TOM-CCと比較して1つの強度レベルのみを明らかにします。トラップされた分子の期間に対応する軌道セグメントは灰色でマークされています。注意すべき重要なことの1つは、この方法が無傷の膜環境で単一膜タンパク質を分析することです。

膜タンパク質のダイナミクスは、近い将来、科学的研究の地平線であり続けるでしょう。本手法がこの分野に大きく貢献することを期待しています。