Name: 全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ TIRF顕微鏡を用いた脂質二重膜におけるイオンチャネルの1分子イメージング法。タンパク質の蛍光標識を不要とし、横方向移動度とチャネル活性の関連を解析できる革新的な手法です。

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タンパク質の準備に協力してくれたベアテ・ニッチュケと、洞察に満ちた議論をしてくれたロビン・ゴーシュ、マイケル・シュヴァイケルト(シュトゥットガルト)、マクシミラン・ウルブリッヒ(フライブルク)に感謝します。この研究は、シュトゥットガルト研究センターシステム生物学(SRCSB)とバーデンヴュルテンベルク財団からの助成金(BiofMO-6からSN)の支援を受けました。

利益相反はないと宣言します。

ここで紹介するプロトコルは、単一分子TIRF顕微鏡を使用して、横方向イオンチャネルの動きとチャネル機能の間の相互作用を研究するためのDIBメンブレンの使用の概要を提供します。可能な限り最良のデータを得るためには、十分に分析できる個々の粒子の時系列を得るために、できるだけ多くの十分に分離されたチャネルを有する安定したDIB膜の調製が不可欠です。
最適化すべき重要なパラメータには、脂質の選択、油相中の脂質濃度、水性液滴中のタンパク質および界面活性剤濃度が含まれます。使用される脂質は、低温で明確な相転移を示さないという点で珍しいものです。DPhPCは、安定な膜系40を産生するために一般的に使用される脂質である。原則として、低温で流体環境を維持する脂質は、この用途に適している可能性があります。さらに、脂質は酸化に敏感であってはなりません。液滴中の洗剤濃度は、膜の破裂を避けるためにできるだけ低くする必要があります。膜タンパク質が沈殿しないことを考えると、安定した膜および良好なタンパク質取り込み率は、一般に臨界ミセル濃度(cmc)未満の界面活性剤濃度で達成される。
DIB膜が特定の界面活性剤21,41に耐えられない場合、またはタンパク質が低界面活性剤溶液からDIB膜に統合されない場合、タンパク質チャネルは最初に小さな単層脂質小胞(SUV)に再構成され、次に、大腸菌MscL42で成功裏に示されているように、液滴側からDIB膜に融合されます。.油相の脂質濃度が低すぎるためにDIB膜が形成されない場合があります。DIB膜の破裂を防ぐために、ヒドロゲルと液滴の間の浸透圧は、シスからトランスへのCa2+フラックスに過度に影響を与えることなく正確にバランスが取れていなければならないことにも注意する必要があります。最適化されたアガロースの厚さとメッシュサイズは、膜タンパク質の拡散を観察するために重要であるように思われます。アガロース層の乾燥は避けてください。厚さは、原子間力顕微鏡17を用いて決定することができる。スピンコーティング中のアガロース濃度、体積、回転速度を変えることで、ヒドロゲルのメッシュサイズと厚さを最適化することができます。ただし、ヒドロゲル層の厚さは画像のコントラストに影響することに注意してください。DIB中の膜タンパク質を捕捉するために、アガロースヒドロゲルをカスタム合成された非架橋のNi-NTA修飾低融点アガロースで置き換えて、His-tag17を介してそれらをトラップすることができます。過度に高い蛍光バックグラウンドは、多くの場合、DIB膜の破裂によって引き起こされます。これは、Ca2+感受性色素がヒドロゲルに拡散するため、マルチウェルチャンバーで特に問題になります。この場合、隣接する井戸は避けてください。膜上のCa2+感受性色素の蛍光漂白は、TIRFエバネッセント場の外側の液滴の大部分(図3A)中の非励起色素によって交換されるため、重要な制限因子ではないはずです。タンパク質の局在精度は、スポットのフィッティング精度とピクセルサイズによって決まります。
弱い蛍光シグナルは、チャネルを通る低いCa2+フラックスによって引き起こされる可能性があります。考えられる理由には、(i)不正確なTIRF設定(例えば、レーザー強度)、(ii)膜を横切る浸透圧Ca2+圧力、または(iii)チャネルの固有のCa2+透過性が低すぎることが含まれる。最初の問題に対処するには、レーザー強度、TIRF角度、およびカメラゲインを最適化する必要があります。後者の2つの問題は、膜2、43を横切る電位の印加によって克服することができる。ただし、電気的影響が実際には電圧制御されていないリガンド依存性または機械感受性イオンチャネルのチャネル開口に影響を与える可能性があるため、外部電圧を印加すると結果が歪む可能性があります。このようなチャネルの例は、ミトコンドリアタンパク質トランスロカーゼTOM−CC 27、およびそのチャネル形成サブユニットTom4026、44、45、46である。最後に、所望の機能性を達成するために膜タンパク質を特定の方向にDIB膜に挿入することはトリッキーであり、定量的研究はまれであることに注意すべきである47,48。場合によっては、組み込まれたタンパク質の配向はランダムである。特定の膜タンパク質は膜の片側だけで活性化されるため、これは膜タンパク質の研究にとって深刻な問題です。
TIRF顕微鏡は、平面支持膜における単一分子イベントに対処するための強力な方法です49。例としては、α-ヘモリシン50、ペルフリンゴライシンO51、OmpG52などのチャネルタンパク質の組み立ておよび折り畳み経路の解明が含まれます。これらの研究には、追加の技術としてFRETが含まれていました。加えて、機械感受性イオンチャネルMscLの活性化は、電流測定を用いた担持されたDIB二重層42の機械的刺激によって以前に研究されてきた。この研究に基づいて、将来の研究では、ここで説明するプラットフォームを単一分子FRET実験と組み合わせて、光学的に単一分子レベルで機械受容チャネルに対処することができます17。液滴への緩衝液の注入、内部DIB単層の伸張、または下にあるヒドロゲルへの個々のチャネルの標的結合は、MscLおよびMscS、2細孔ドメインK+チャネル、TREK-1、 TREK-2、およびTRAAK、およびPIEZO(レビューについては、53を参照されたい)だけでなく、タッチセンシティブイオンチャネルNOMPC54、55について示されているように、細胞細胞骨格への局所結合も含む。

本プロトコルは、ポリマー支持液滴界面二重層(DIB)膜における膜タンパク質の膜移動度とイオンチャネル透過性との間の相関を研究する方法を説明することを目的とする1,2,3。
この技術は、単一粒子追跡4,5、蛍光相関分光法6,7、高速原子間力顕微鏡8,9,10などの印象的な一連の高度な光学および表面分析ツールを補完します。これらは、膜ベースの反応に影響を与える膜の動的な組成と構造に関する貴重な洞察を提供します11,12,13。タンパク質の移動と横方向の拡散は膜内のタンパク質の局所密度に依存しますが、個々のタンパク質分子は脂質ラフト14およびタンパク質間相互作用15,16によってもトラップできます。膜から細胞外環境または細胞質ゾルに突き出ているタンパク質ドメインに応じて、タンパク質の移動性は、高度に可動性から完全に不動性まで変化し得る。しかしながら、膜およびその周辺構造の複雑さのために、側方移動性の性質とタンパク質機能との間の相互作用を解読することはしばしば困難である17。
DIB膜は、膜タンパク質の生物物理学的単一分子分析のための効率的なプラットフォームであることが証明されています18,19,20,21,22。それらは、脂質/油相中の水性液滴とヒドロゲル担持基質との接触による脂質自己組織化によって形成されます。一般的に使用される支持脂質二重層(SLB)1、23、24、25と同様に、DIBは、適切なリガンドで官能化された場合、ポリマーマトリックスへのタンパク質の一時的または恒久的な結合による横方向の移動性の局所的な調節を可能にする17。後者は、不均一なタンパク質分布を有する細胞膜における生化学的プロセスのモデルシステムとして役立ち得る10。
ここで説明する実験的アプローチは、Tirf顕微鏡を用いてメンブレン2,22に近接した個々のチャネルを通るCa2+イオンフラックスを測定するために、Ca2+感受性色素の蛍光に依存する。この光学的アプローチは、サンプルの照明を膜に近い距離に制限し、エバネッセント励起光の物理的特性により、蛍光バックグラウンドの大幅な減少につながります。後者は、単一分子の検出に高い空間分解能と時間分解能が必要な場合の前提条件です。古典的な電気生理学的方法26,27とは対照的に、個々のチャネルを通るイオンフラックスを研究するために膜電圧は必要ありません。さらに、この方法は、膜中のチャネルの側方移動を妨げる可能性のある蛍光色素または分子による標識を必要としない。
この方法は、古典的な電気生理学を使用せずに、膜に埋め込まれたタンパク質チャネルを単一分子レベルで研究する場合に特に有用です。Neurospora crassa28,29,30のミトコンドリアタンパク質伝導チャネルTOM-CCと、大腸菌17,31の外膜を横切る低分子の親水性分子の拡散をサポートするOmpFを使用して、2つのタンパク質の膜移動度とチャネル活性を研究し、相関させる方法を示します。このアプローチは、TOM-CCおよびOmpFに最適化されていますが、他のタンパク質チャネルにも容易に適用できることを示唆しています。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>100x オイル対物レンズ アポクロマート N.A. 1.49</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>TIRF 顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>10倍ホフマン変調対物レンズ NA 0.25&nbsp;</td>DIB膜形成を評価する<td>ためのニコン</td><td></td><td>顕微鏡&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>10倍対物レンズ N.A. 0.25</td><td>Nikon</td><td>MRL00102</td><td>TIRF顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>40倍ホフマン変調対物レンズNA 0.55</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡でDIB膜形成を評価&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>488 nmレーザー、100 mW&nbsp;&nbsp;</td><td>Visitron</td><td></td><td>TIRF顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>粘着テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTAピュア&nbsp;&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td>タンパク質精製システム</td></tr><tr><td>Bradford アッセイキット、Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Chelax 100 樹脂</td><td>Biorad</td><td>143-2832</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MC1024452500</td><td></td></tr><tr><td>透析カセット Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87735</td><td></td></tr><tr><td>DIBチャンバー&nbsp;</td><td>DIBメンブレン用の</td><td>カスタムメイド</td><td></td>PMMAチャンバー</tr><tr><td>デジタルパワーメーターとエネルギーコンソール</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>レーザーパワーメーター&nbsp;</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Roth&nbsp;</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>二重蒸留 H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100 ホフマン変調コントラスト顕微鏡&nbsp;</td>DIB膜形成を評価する<td>ためのニコン</td><td></td><td>顕微鏡&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8042.2</td><td></td></tr><tr><td>EMCCDカメラ iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>TIRF顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>固定角ローター Ti70</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8, CalciFluorTM</sup/sup></td><td>Santa Cruz バイオテクノロジー</td><td>SC-362561</td><td>Ca2+感受性色素</td></tr><tr><td>フレンチプレス 細胞破壊ホモジナイザー</td><td>イグ</td><td>ネウス 40000 psi</td><td></td></tr><tr><td>GFP フィルター</td><td>AHF</td><td></td><td>白色光源による落射蛍光によるDIB膜の励起に用いるフィルターシーティング&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラス毛細血管</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td><td>Roth</td><td>1870.2</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Roth</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ 10 mL</td><td>Roth</td><td>X033.1</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ 100 mL</td><td>Roth</td><td>X049.1</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ 500 mL</td><td>ロス</td><td>EY49.1</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブロック&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングプレート</td><td>ミニチューブ&nbsp;</td><td>HT200</td><td></td></tr><tr><td>ヘペス</td><td>・ロス&nbsp;</td><td>9205.3</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサドカン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317</td><td></td></tr><tr><td>His Trap HP 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>29051021</td><td>Ni-NTA カラム</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.04716.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>10314243</td><td></td></tr><tr><td>KLM スピンコーター&nbsp;</td><td>Schaefer Tec</td><td>SCV-10</td><td></td></tr><tr><td>List medical L/M-3P-A 縦型ピペットプーラー</td><td>Artisan Technology Group</td><td>57761-1</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>M8 実体顕微鏡</td><td>Wild</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>マトラブ&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>R2022a</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil ピペットチップ</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>N2 gas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter 2010 インジェクター&nbsp;</td><td>世界の精密機器</td><td>ナノリットル 2010年&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>n-ドデシル-b-D-マルトシド</td><td>グリコン バイオケミカルズ</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTAアガロース、非架橋</td><td>キューブ バイオテック</td><td>124115393</td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>NIS-Elements ARソフトウェア</td><td>ニコン</td><td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>n-オクチル-ポリオキシエチレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40530</td><td></td></tr><tr><td>O2ガス</td><td></td><td></td><td></td></tr>フェ<tr><td>ニルメチルスルホニルフッ化</td>物<td>Roth&nbsp;</td><td>6367.3</td><td></td></tr><tr><td>フォトダイオードセンサー&nbsp;Si、400 - 1100 nm、500 mW</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>レーザーパワーメーター用センサー&nbsp;</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ディーナーエレクトロニクス</td><td>ゼプト</td><td></td></tr><tr><td>分取超遠心機 オプティマ</td><td>・ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クワッドバンドTIRFフィルター 446/523/600/677 HC</td><td>AHF</td><td></td><td>488nmレーザーによるDIB膜の励起に使用されるフィルター設定&nbsp;</td></tr><tr><td>Resource Q 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17117701</td><td>陰イオン交換カラム</td></tr><tr><td>シリコンオイル AR 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>スーパー LoLux カメラ</td><td>JVC</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>サーモシェーカー</td><td>Gerhardt</td><td>THL 500/1</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E 蛍光顕微鏡&nbsp;&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth</td><td>8952.2</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴&nbsp;</td><td>バンデリン ソノレックス</td><td>RK 100</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>真空ブランド</td><td>MD 4C NT</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光照明用白色光源 (100 W)</td><td>ニコン</td><td>MBF72655</td><td>TIRF 顕微鏡&nbsp;</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Roth</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

全反射蛍光(tirf)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

高解像度イメージング技術により、多くのイオンチャネルは静的ではなく、細孔形成と補助サブユニットの一時的な会合、横方向拡散、他のタンパク質とのクラスタリングなど、非常に動的なプロセスを受けることが示されています。しかし、横方向の拡散と機能の関係はよくわかっていません。この問題にアプローチするために、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して、支持された脂質膜内の個々のチャネルの横方向の移動度と活性をどのように監視および相関させることができるかについて説明します。膜は、液滴界面二重層(DIB)技術を使用して極薄ヒドロゲル基板上に製造されます。他のタイプのモデルメンブレンと比較して、これらのメンブレンは機械的に堅牢であり、高感度の分析技術に適しているという利点があります。このプロトコルは、膜に近接したCa2+感受性色素の蛍光発光を観察することにより、単一チャネルを通るCa2+イオンフラックスを測定します。従来の単一分子追跡アプローチとは対照的に、膜内のラテラルムーブメントと機能を妨げる可能性のある蛍光融合タンパク質または標識は必要ありません。タンパク質の立体構造変化に関連するイオンフラックスの変化の可能性は、膜内のタンパク質の横方向の動きにのみ起因します。代表的な結果は、ミトコンドリアタンパク質転座チャネルTOM−CCおよび細菌チャネルOmpFを用いて示される。OmpFとは対照的に、TOM-CCのゲーティングは分子の閉じ込めと横方向拡散の性質に非常に敏感です。したがって、支持された液滴界面二重層は、横方向の拡散とイオンチャネルの機能との間のリンクを特徴付けるための強力なツールです。

リアルタイムの電極フリー光学シングルチャンネル記録は、DIB膜におけるタンパク質の横方向の動きと個々のイオンチャネルの機能との間の相互作用を明らかにします。ミトコンドリアTOMコア複合体(図1A)のDIB膜への再構成(図4D)は、横方向の移動度とイオン透過性(図5A)の間の強い時間的相関を示しています。TOM-CCゲーティングは、横方向の動きのモードに敏感であるように見えます17。移動チャネルは、細孔を通るCa2+フラックスと高い蛍光点強度を示します。トラップされた非移動分子は、低および中程度の蛍光強度を示します。ミトコンドリアTOM-CCの一般的なタンパク質輸入孔について、この単一分子アプローチは、横方向の移動度とイオン透過性の間に強い時間的相関を明らかにし、TOM-CCチャネルが機械感受性特性を有することを示唆した17。自由に動くTOM-CC分子の横方向の停止は、TOM-CCチャネルの部分的または完全な閉鎖を伴う。膜にほぼ完全に埋め込まれているOmpF(図1Eおよび図4F)でDIB膜をイメージングすると、ストップアンドゴー効果は見られません(図5B)。OmpFのランダムな停止は、強度の変化、したがってその細孔の閉鎖とは関連していません。蛍光シグナル38に基づいて、個々のチャネルの位置精度を、5〜10nmの範囲で推定することができる。しかしながら、例えば、120nmの二項平均変位を有する中間状態のTOM-CC分子について示されるように、アガロースヒドロゲルとの可動固定のためにチャネルがわずかにぐらつく場合、この精度は達成できないことに注意すべきである(図5A)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> 図1:TOM-CCの分離。 (A)N. crassa TOM-CC30,39のクライオEM構造。6xHisタグを有するTom22を含むN.クラッサ株由来のミトコンドリアをDDMに可溶化し、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー(B)および陰イオン交換クロマトグラフィー(C)に供した。(D) 孤立した TOM-CC の SDS-PAGE(E)精製大腸菌OmpFの結晶構造(PDB、1OPF)および(F)SDS-PAGE。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> 図2:PMMAチャンバーアセンブリのフローチャート。 ステップ1:ガラスカバーガラスをアガロースヒドロゲルでスピンコーティングします。ステップ2:スピンコーティングされたカバーガラスをカスタムメイドのPMMA顕微鏡チャンバーに取り付けます。ステップ3:追加の低溶融アガロースを35°Cのホットプレート上のPMMAチャンバーの入口ポートに追加します。ステップ4:脂質単層は、バッファー/オイル界面(左)およびアガロースヒドロゲル/オイル界面(右)の水性液滴の周りに形成されます。ステップ5:個々の水性液滴をPMMAチャンバーのウェルにピペットで入れ、2つの脂質単層が接触すると脂質二重層を形成します。ステップ6:DIB膜の形成は、ホフマン変調コントラスト顕微鏡によって検証されます。ステップ7:イオンチャネルが挿入されたDIB膜の選択された領域の画像をTIRF顕微鏡で取得します。緑:0.75%アガロース;黄色:Ca2+ イオンを含む2.5%アガロース;マゼンタ:脂質/油相;濃い青:Ca2+感受性色素およびタンパク質を含む水性液滴バッファー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> 図3:実験のセットアップ。 (A)PMMAウェル内のDIB膜の模式図。二層膜は0.75%の極薄アガロースフィルム上に置かれており、トランス中のCa2+感受性蛍光色素(Fluo-8)を使用して、イオンチャネルを通るCa2+フラックスのTIRFイメージングを経時的に行うことができます。(B)Ca2+フラックスは、シスからトランスへの浸透圧によってのみ制御されます。 これにより、膜内の位置の決定とチャネルの開閉状態の両方が可能になります。ここに示すチャネルは、N. crassa ミトコンドリア30のタンパク質伝導性チャネルTOM-CCである。(C) 単一の TOM-CC チャネルの軌跡。緑:移動チャネル。黄色:移動していないチャネル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> 図4:DIBメンブレンにおけるTOM-CCおよびOmpFのイメージング 。 (a)ヒドロゲルと液滴との間の二層接触面積を示すホフマン変調コントラスト顕微鏡により画像化されたDIB膜。(B)(A)のように撮像された壊れたDIB膜。矢印、PMMAチャンバーの端。(C)タンパク質チャネルのないTIRF顕微鏡によって画像化されたDIB膜。(d)再構成されたTOM−CCを有するDIB膜を、TIRF顕微鏡により画像化する。白い四角形は、高強度(SH)、中強度(SI)、および低強度(SL)のスポットを示します。(E)(A)でマークした3つのスポットの蛍光強度プロファイルを2次元ガウス関数に当てはめると、個々のTOM-CCの位置とチャネルを通るCa2+ フラックスが明らかになります。(f)再構成されたOmpFを有するDIB膜。(G)(F)でマークされた蛍光スポットのガウスフィット。2細孔βバレルタンパク質複合体TOM-CCとは対照的に、3細孔βバレルOmpFは1つの透過状態のみを明らかにします。ピクセルサイズ、0.16μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> 図5:チャネル活性はTOM-CCの横方向の移動度と相関 する。 (A)TOM-CCの蛍光振幅トレース(上)と対応する軌跡(下)は、TOM-CCの開閉チャネル活性が複合体の側方膜移動度と相関していることを示しています。軌跡には、3 つの透過性状態が表示されます。緑:完全に開いた状態。黄色:中間透過状態。赤:閉じたチャネル状態。赤い星:中間状態のTOM-CCは、その平均位置の周りで約±60 nmぐらつきます。全開状態および中間状態における蛍光シグナルに基づく位置精度37 は、5nm〜10nmの範囲である。(B)OmpFの蛍光振幅トレース(上)と対応する軌跡(下)。OmpFは、動いているか閉じ込められているかに関係なく、1つの強度レベルのみを明らかにします。トラップされた分子の期間に対応する軌道セグメントは灰色でマークされています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>バッファ </td>
			<td colspan="3">試薬濃度</td>
			<td>容積</td>
		</tr><tr><td>A1*</td>
			<td colspan="3">20 mM トリス塩酸塩 pH 8.5、0.1 % (w/v) n-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM)、10% (v/v) グリセロール、300 mM NaCl、および 1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (PMSF)</td>
			<td>100ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>A2*</td>
			<td colspan="3">20 mM トリス塩酸塩 pH 8.5、0.1% (w/v) DDM、10% (v/v) グリセロール、1 M イミダゾールおよび 1 mM PMSF</td>
			<td>100ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>B1*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 2% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO)</td>
			<td>100ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO)</td>
			<td>100ミリリットル</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* 使用前に0.22μmのフィルターを脱気して通過させてください。</td>
		</tr></tbody></table>表1:TOM-CC分離用のバッファー溶液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>バッファ </td>
			<td colspan="3">試薬濃度</td>
			<td>容積</td>
		</tr><tr><td>ポンド*</td>
			<td colspan="3">1%(w / v)トリプトン、1%(w / v)NaClおよび0.5%(w / v)酵母エキス</td>
			<td>1100ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>C1クラス</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2、および~750ユニットのDNAseおよび50 mM トリス塩酸塩 pH 7.5</td>
			<td>20ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>C2 クラス</td>
			<td colspan="3">50 mM トリス塩酸塩、pH 7.5</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>C3クラス</td>
			<td colspan="3">4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、2 mM β-メルカプトエタノールおよび50 mM トリス塩酸塩 pH 7.5</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>C4クラス</td>
			<td colspan="3">2% (標準/v) SDS、500 mM NaClおよび 50 mM トリス塩酸塩 pH 7.5</td>
			<td>50ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>C5クラス</td>
			<td colspan="3">0.5% (w/v) オクチルポリオキシエチレン (オクチル POE), 1 mM EDTA および 20 mM トリス pH 8.5</td>
			<td>1000ミリリットル</td>
		</tr><tr><td colspan="5">※滅菌してからご使用ください。</td>
		</tr></tbody></table>表2:OmpF単離用のバッファー溶液。

このプロトコルでは、TIRF顕微鏡を使用して個々のイオンチャネルを追跡し、支持された脂質膜におけるそれらの活性を決定し、それによって側方膜の動きとチャネル機能の間の相互作用を定義する方法について説明します。メンブレンの準備、データの記録、および結果の分析方法について説明します。

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

イオンチャネルは生体膜では静的ではありません。ここでは、側方膜拡散とイオンチャネル機能の間のリンクを解明するための単一分子光学的アプローチを紹介します。他の方法に対するこの技術の主な利点は、それらの側方運動および機能を妨げる可能性のあるタンパク質の蛍光標識が不要であることである。この方法は、自由拡散または制限拡散が組織化および機能にとって重要なあらゆる膜タンパク質チャネルに適用できます。まず、380マイクロリットルのDPhPCストック溶液をガラスバイアルに移し、脂質ストック溶液をアルゴンまたは窒素ガスで覆い、脂質酸化を防ぎます。脂質が溶解している有機溶媒の蒸発、またはバイアルからの溶媒スプレーの飛散を避けるために、可能な限り低いガス流量を使用してください。脂質サンプルを窒素気流下で乾燥させ、オイルフリー真空ポンプを使用して真空下で脂質サンプルから残りの有機溶媒を一晩除去します。1ミリリットルのピペットを使用して等量のヘキサデカンとシリコーンオイルを1ミリリットルあたり9.5ミリグラムの最終脂質濃度まで添加することにより、脂質フィルムをヘキサデカンシリコーンオイル溶液に溶解します。ガラス製のカバースリップホルダーに入れ、ガラスビーカーで超音波洗浄機のアセトンで約10分間洗浄します。カバーガラスを二重脱イオン水ですすぎ、窒素の流れの下で乾燥させます。さらに、カバーガラスをプラズマクリーナーで酸素で5分間洗浄して親水性にします。プラズマ処理されたカバーガラスをスピンコーターに取り付け、140マイクロリットルの加熱した0.75%低融点アガロースを200マイクロリットルのピペットで3, 000 RPMで30秒間ゆっくりと添加することにより、カバーガラスにサブマイクロメートルの厚さのアガロースフィルムをコーティングします。アガロースヒドロゲルの薄層を含むスピンコーティングされたカバーガラスをPMMAチャンバーの下側に直ちに取り付けます。アガロースヒドロゲルが上を向いていることを確認してください。カバーガラスの端を透明な粘着テープでPMMA微細加工デバイスに固定し、摂氏35度に加熱したホットプレートにデバイスを置きます。気泡を発生させずに、200マイクロリットルの2.5%アガロース溶液をチャンバーの入口に慎重に注ぎます。PMMAチャンバーのウェルを直ちに約60マイクロリットルの脂質オイル溶液で覆い、アガロースオイル界面で脂質単層形成を開始し、PMMAチャンバーのウェル内のスピンコートアガロースの脱水を回避します。デバイスを摂氏35度のホットプレートに約2時間置きます。約20マイクロリットルの脂質ヘキサデカンシリコーンオイル溶液を、液滴インキュベーションチャンバー内のいくつかの微細加工ウェルのそれぞれに入れます。垂直または水平のマイクロピペットプーラーを使用して、先端開口部直径が約20マイクロメートルのマイクロキャピラリーガラス針を準備します。8.8ミリモルのHEPES、7マイクロモルの蛍光色素、Fluo-8、400マイクロモルのEDTA、1.32モルの塩化カリウム、30ナノモルのTOMコアコンプレックス、または20ナノモルのOMPFを含む約5マイクロリットルの水性注射液を針に入れます。ピエゾ駆動のナノインジェクターに水性注入液とともに針を取り付け、ナノインジェクターを使用して脂質ヘキサデカンシリコーンオイル溶液で満たされた液滴インキュベーションチャンバー内のウェルに100〜200ナノリットルの水性液滴を注入します。摂氏35度に加熱されたホットプレート上にPMMAおよび液滴インキュベーションチャンバーを維持することにより、液滴油界面に脂質単層を約2時間形成させる。10マイクロリットルの使い捨てポリプロピレンチップを備えたシングルチャンネルマイクロリットルピペットを使用して、液滴インキュベーションチャンバーのウェルからPMMAチャンバーのウェルに個々の水性液滴を手動で移します。液滴をヒドロゲル-油界面の脂質単層上に沈め、液滴とアガロースヒドロゲルの間に脂質二重層を形成する。液滴界面二層膜またはDIB膜を備えたPMMAチャンバーを倒立光学顕微鏡のサンプルホルダーに取り付け、10倍ホフマン変調コントラスト対物レンズを使用して膜形成を評価します。DIB膜が形成されている場合は、従来の落射蛍光照明用光源、488ナノメートルレーザー、裏面入射型電子増倍CCDカメラを備えたTIRF顕微鏡のサンプルホルダーにPMMAチャンバーを取り付け、約0.16マイクロメートルのピクセルサイズを実現します。GFPフィルターセットを使用して、高輝度光源の落射蛍光照明下で、10倍の倍率対物レンズでDIBメンブレンの端に焦点を合わせます。DIB膜の同じエッジを100x NA 1.49アポクロマートオイルTIRF対物レンズで高倍率でファインフォーカスし、GFPフィルターセットを使用して高輝度光源で落射蛍光照明下で再び焦点を合わせます。フィルター設定をGFPからクワッドバンドTIRFフィルターセットに変更し、488ナノメートルレーザーのスイッチを入れ、対物レンズのレーザーの強度を設定します。単一イオンチャネルを視覚化するには、TIRF角度とEM CCDカメラゲインを調整して、DIBメンブレンの開いたイオンチャネルが暗い背景に高コントラストの蛍光スポットとして表示され、S/バックグラウンド比が最大になるようにします。単一のイオンチャネルを通るカルシウムイオンフラックスに対応するスポットに焦点が合ったままで、中央で高強度の丸い形状を持ち、周辺に向かって徐々に減少することを確認します。蛍光スポットに焦点が合っていることを確認して、イオンチャネルがDIB膜に再構成され、膜面内を横方向に移動していることを確認します。最後に、位置の適切な追跡と個々のイオンチャネルの開閉状態のモニタリングを可能にする一連の膜画像を記録します。横方向の移動度の種類とチャネル活動の状態を判断するには、十分に長く、十分にサンプリングされた軌道を取得します。ニューロスポラ・クラッサTOM-CCのクライオEM構造を以下に示す。6-Hisタグを有するTOM 22を含むN.crassa染色由来のミトコンドリアをDDMに可溶化し、ニッケルNTAアフィニティークロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。ここでは、単離されたTOM-CC結晶構造のSDS-PAGEと、比較に用いた精製大腸菌OMPFのSDS-PAGEを示します。TOM-CCの対応する軌跡における蛍光振幅トレースは、TOM-CCの開-閉チャネル活性が複合体の側方膜移動度と相関していることを示している。振幅トレースには、移動チャネルに対応する全開状態、中間透磁率状態、非移動チャネルに対応する閉チャネル状態の3つの透磁率状態が表示されます。中間状態のTOM-CCは、その平均位置の周りで約プラスマイナス60ナノメートルぐらつきます。OMPFの対応する軌跡における蛍光振幅トレースをここに示します。OMPFは、動いているか閉じ込められているかに関係なく、TOM-CCと比較して1つの強度レベルのみを明らかにします。トラップされた分子の期間に対応する軌道セグメントは灰色でマークされています。注意すべき重要なことの1つは、この方法が無傷の膜環境で単一膜タンパク質を分析することです。膜タンパク質のダイナミクスは、近い将来、科学的研究の地平線であり続けるでしょう。本手法がこの分野に大きく貢献することを期待しています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。...

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pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

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全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

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