Name: 好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ マウス・ヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を代謝エクストラセルラーフラックスアナライザーでリアルタイム測定する手法。薬剤や疾患条件下でのミトコンドリア機能評価に有用です。

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UConn Healthの免疫学部のAnthony T. Vella博士とFederica Aglianoin博士の代謝細胞外フラックス分析装置の使用に関するトレーニング、およびUConn Healthの免疫学部のLynn Puddington博士の機器のサポートに感謝します。UConn医学部のジュネーブ・ハーギス博士が、この原稿の科学的執筆と編集に協力してくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所、国立心臓肺血液研究所(R01HL145454)、国立総合医学研究所(R35GM147713およびP20GM139763)、UConn Healthのスタートアップファンド、および米国免疫学会のキャリア再エントリーフェローシップからの助成金によってサポートされました。

ヘパリン処理全血サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってUConn Healthの治験審査委員会によって承認されたように、インフォームドコンセントを取得した後、健康なヒトドナーから取得されました。すべての動物実験は、UConn Health施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従い、げっ歯類の使用の承認は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている基準に従って、UConn Health IACUCから取得されました。この研究では、6週齢の雄C57BL / 6マウスを使用しました。
1. 代謝細胞外フラックスアッセイ用の96ウェルプレートの調製
<ol><li>センサーカートリッジは、代謝細胞外フラックスアッセイ用に特別に設計された96ウェルプレートの上にパッケージされています。カートリッジを慎重に持ち上げて水和し、200 μL/ウェルの校正培地を下になるプレートの各ウェルに入れます。キャリブラント付きのプレート上にカートリッジを置き、非CO2、加湿、37°Cインキュベーター内で一晩水和する。</li>
	<li>細胞の種類に応じて、培養プレートに特定のコーティングを使用して細胞の接着を確保します。ヒト好中球-未分化および分化したHL60細胞の場合、5 μLの5 μg/mL精製マウス抗ヒトCD18抗体(クローンTS1/18)50 μLを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で96ウェルプレートを4°Cで一晩コーティングします。マウス好中球の場合は、96 ウェルプレートに25 μLの22.4 μg/mL Cell TakをpH 8.0、0.1 M NaHCO3 中、室温(RT)で20分間コーティングします。</li>
	<li>プレートを200 μLの滅菌PBSで2回洗浄します。</li>
	<li>播種中に細胞培養プレート内のバックグラウンド補正のために、細胞培養プレート(細胞なし)のコーナーウェル(A1、A12、H1、およびH12)に完全な培地を追加します。 注意: コーティングおよびキャリブレーション中の蒸発は、キャリブレーションメディアの量と正規化に影響を与える可能性があります。滅菌水濡れティッシュの入ったトレイまたはチャンバーを使用し、蒸発を防ぐためにその上にキャリブラントを付けたプレートを置きます。</li>
</ol>2.細胞の調製と播種
<ol><li>アッセイ培地の調製<ol><li>1 mM ピルビン酸、10 mM グルコース、および 2 mM グルタミンをダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) に添加してアッセイ培地を調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>骨髄からのマウス好中球の単離<ol><li>製造元の指示に従って、マウス好中球濃縮キットを使用して骨髄からマウス好中球を分離します。</li>
		<li>ケタミン(125 mg / kg)とキシラジン(12.5 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によってマウスに麻酔をかけ、次に頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。</li>
		<li>前述のように、大腿骨と脛骨を収穫します27。簡単に言うと、筋肉で脚を露出させるために皮膚をカットします。股関節を切断して、脚を体から取り外します。次に、筋肉を取り除き、大腿骨と脛骨を収集します。</li>
		<li>大腿骨と脛骨の小さい方の端を切ります。切断端を下にして、底部に2つの25 Gシリンジニードルパンチ穴がある0.5 mL遠沈管に入れ、0.5 mLチューブを1.5 mL遠沈管に入れます(図1A)。骨髄細胞の乾燥を防ぐために、50 μLのPBSを0.5 mLチューブに加えます。</li>
		<li>RTで5,900 × g で15秒間遠心分離し、1.5 mLチューブの底で骨髄を採取します。骨髄細胞を1 mLのDMEMで再懸濁します。キットからラット血清50 μLを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、細胞懸濁液を5 mLポリスチレン培養試験管に移します。</li>
		<li>マウス好中球濃縮キットから50 μLの濃縮カクテルを加え、RTで15分間インキュベートします。 RTで300 × g で5分間遠心分離します。</li>
		<li>細胞を1 mLのDMEMで再懸濁し、キットから50 μLのビオチン選択カクテルを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、RTで15分間インキュベートします。</li>
		<li>キットから150 μLのボルテックス磁性粒子を添加し、ピペッティングで穏やかに混合し、RTで10分間インキュベートします。</li>
		<li>DMEMを~1.3 mL加え、ピペッティングで穏やかに混合し、チューブを磁石に3分間入れ、精製マウス好中球を含む上清を、元のチューブを磁石と一緒に反転させて、新しい5 mLポリスチレン培養試験管に移します。</li>
		<li>RTで300 × g で5分間遠心分離します。真空吸引により上清を除去した後、細胞を1 mLのアッセイ培地で再懸濁する。</li>
		<li>血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。</li>
		<li>調製した96ウェルプレートにアッセイ培地、マウス好中球懸濁液(2 × 10 5細胞)の播種180 μLを加えて細胞密度を1.1 ×10 6 cells/mLに調整し(ステップ1.2-1.4)、プレートを300 × gでRTで3分間、ブレーキをかけずに遠心分離して、プレート底部の細胞が適切に接着するようにします。</li>
		<li>プレートを非CO2中でインキュベートし、加湿し、37°Cインキュベーター中で1時間、アッセイ培地で細胞を予備平衡化した。 注:好中球の純度は、潜在的なバイアスであるため、アッセイにとって重要です。マウス好中球単離の純度は、このプロトコルによって69.9%〜88.7%である。マウス骨髄から好中球を単離するための他の方法、例えば密度勾配遠心分離28がある。好中球に発現しない抗原に対するモノクローナル抗体を使用した負の磁気選択に基づく、他のベンダーからの代替好中球分離キットもあります。</li>
	</ol></li>
	<li>末梢血からのヒト好中球の単離<ol><li>8 mLの多糖類溶液を15 mLの遠沈管に加え、混合せずに多糖類溶液の上に4 mLの末梢血を重ねます。</li>
		<li>550 × g 、20°Cで30分間遠心分離します。ローターを1で減速させます。 注:好中球分離時間はドナーによって異なる場合があります。それは最低30分であり、好中球分離が失敗した場合はさらに10〜20分かかる場合があります。</li>
		<li>図1Bに示すように、遠心分離後の血漿/血小板および単核球の分離を観察します。1 mLピペットを使用して、下部の曇ったバンド(好中球)を乱さずに、上部の上部の黄色の液体(血漿および血小板)と上部の曇ったバンド(単核球)を慎重に取り除きます。</li>
		<li>下の白濁バンドと~3-4 mLの透明な液体を、10 mLのPBSを含む新しい15 mLの遠沈管に集めます。</li>
		<li>400 × g 、20°Cで10分間遠心分離し、真空吸引により上清を除去します。</li>
		<li>細胞を5 mLのPBSで再懸濁し、300 × g 、20°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を除去した後、細胞を1 mLのアッセイ培地で再懸濁します。</li>
		<li>血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。 注:血液中の赤血球にはミトコンドリアがないため、赤血球汚染はミトコンドリアストレステストアッセイに影響を与えず、好中球の活性化/プライミングを防ぎます29,30。赤血球は、正確な好中球濃度を得るために、細胞計数中に溶解する必要があります。10 μLの細胞懸濁液を891 μLの脱イオン水に10〜30秒間加えて赤血球を溶解し、次に99 μLの10x PBSを加えて浸透圧のバランスを取り、好中球の溶解を回避します。</li>
		<li>アッセイ培地を添加して細胞密度を2.2 ×10 6 cells/mLに調整し、調製した96ウェルプレートに1ウェルあたり180 μLのヒト好中球(~4 ×10 5)を播種し、プレートを300 × g でRTで3分間、ブレーキをかけずに遠心分離して、プレート底部の細胞が適切に接着するようにします。</li>
		<li>プレートを非-CO2中でインキュベートし、加湿し、37°Cインキュベーター中で1時間、アッセイ培地で細胞を予備平衡化した。 注:好中球の純度は、潜在的なバイアスであるため、アッセイにとって重要です。ヒト好中球単離の純度は86.6%〜96.8%である。ヒト血液から好中球を単離するための密度勾配遠心分離法には、パーコール単離やフィコール単離とデキストラン沈降の組み合わせなどがあります31。</li>
	</ol></li>
	<li>HL60細胞培養と好中球指向性分化<ol><li>HL60細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、100 μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および250 ng/mLアムホテリシンBを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)-1640培地で37°Cおよび5%CO2で維持します。</li>
		<li>好中球指向性分化のために、HL60細胞(浮遊細胞)をT25フラスコ中で1 ×10</li><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64971/64971fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64971/64971fig01large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol><li> <ol><li> <ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64971/64971fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64971/64971fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li> </li></ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

代謝細胞外フラックス分析装置を使用して好中球のミトコンドリア呼吸を測定する標準的な手順は、細胞数、細胞増殖、生存率などの多くの要因によって制限されます。各化合物濃度は、このアッセイにおける細胞の種類と供給源によって異なります。オリゴマイシンとロテノン/抗マイシンAは、ほとんどの細胞タイプの中で主に同様の濃度で使用されます。ただし、FCCPによって誘発される最大呼吸数は細胞によって異なるため、濃度を最適化するにはFCCPの慎重な滴定が必要です42。また、最適化中にFCCPの順次追加を実行することをお勧めします。代謝細胞外フラックス分析装置は、空気圧43下でプレート内に薬物を注入するが、いくつかのミトコンドリア複合体阻害剤に対する細胞膜の不透過性は、単離されたミトコンドリア44と比較して、無傷の細胞の場合のそれらの使用を制限する。ポートへの積み込みは、相互汚染を避けるために慎重に実行する必要があります。培地中の基質濃度(グルコース、ピルビン酸、グルタミンなど)もミトコンドリア活性に影響を与える可能性...

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化(OXPHOS)によってアデノシン三リン酸(ATP)を生成する細胞の生体エネルギー学において主要な役割を果たしています。これに加えて、ミトコンドリアの役割は、活性酸素種の生成と解毒、細胞質およびミトコンドリアマトリックスカルシウム調節、細胞合成、異化、および細胞内の代謝産物の輸送にまで及びます1。ミトコンドリア呼吸は、その機能不全が心血管疾患3や加齢黄斑変性症4、パーキンソン病およびアルツハイマー病5、シャルコー・マリー・トゥース病2A(CMT2A)6などの多種多様な神経変性疾患を含む代謝障害2を引き起こす可能性があるため、すべての細胞に不可欠です。
好中球に関する電子顕微鏡的研究により、ミトコンドリアは比較的少なく7、ミトコンドリアの呼吸速度は非常に低いため、エネルギー産生を解糖に大きく依存していることが明らかになりました8。ただし、ミトコンドリアは、走化性9やアポトーシス10、11、12などの好中球機能にとって重要です。以前の研究では、膜電位の高いヒト好中球における複雑なミトコンドリアネットワークが明らかになりました。ミトコンドリア膜電位損失は、好中球アポトーシスの早期指標である10。ミトコンドリア脱共役カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)による処理は、ミトコンドリアの形態の変化とともに、走化性の有意な阻害を示しました9,10。
好中球の主要なエネルギー源は解糖系であるが、ミトコンドリアは、プリン作動性シグナル伝達の第1段階に燃料を供給することによって好中球活性化を開始するATPを提供し、これはCa2+シグナル伝達を高め、ミトコンドリアATP産生を増幅し、好中球機能応答を開始する13。ミトコンドリア呼吸鎖の機能不全は、有毒な活性酸素種(ROS)の過剰産生をもたらし、病原性損傷につながります14,15,16。好中球細胞外トラップ(NET)を形成するプロセスであるNETosisは、好中球の重要な特性であり、病原体と戦うのに役立ち17、癌、血栓症、自己免疫疾患などの多くの病理学的状態に寄与します18。ミトコンドリア由来のROSはNETosis19に寄与し、ミトコンドリアDNAはNETs18の構成要素となり得、そして変化したミトコンドリア恒常性はNETosis20,21,22,23,24を損なう。さらに、正常な分化または成熟の間に、好中球代謝リプログラミングは解糖活性を制限することによって逆転し、それらはミトコンドリア呼吸に従事し、細胞内脂質を動員します25,26。
代謝細胞外フラックス分析装置は、生細胞のミトコンドリア呼吸と解糖を継続的に監視および定量することができます。この分析装置は、96ウェルプレートフォーマットのセンサーカートリッジと2つの蛍光色素を使用して、酸素(O2)濃度とpH変化を定量します。センサーカートリッジは、アッセイ中に細胞単層の上にあり、~200 nmの高さのマイクロチャンバーを形成します。分析器内の光ファイバー束は、蛍光色素を励起し、蛍光強度の変化を検出するために使用されます。O2 濃度とpHのリアルタイム変化が自動的に計算され、酸素消費速度(OCR)と細胞外酸性化速度(ECAR)として表示されます。センサーカートリッジには4つのポートがあり、アッセイ測定中に各ウェルに最大4つの化合物をロードできます。このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、ならびに好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。

<table><tbody><tr><td>37度;C非CO<サブ>2</サブ>&nbsp;インキュベーター</td><td>Precision</td><td>Economy Model 2EG</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Biorender</td><td></td><td></td><td>Software Application</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td><td>Corning</td><td>102416-100</td><td>試薬</td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td>Magnet</td></tr><tr><td>EasySepMouse 好中球濃縮キット</td><td>STEMCELL</td><td>19762A</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 9</td><td></td><td></td><td>ソフトウェア アプリケーション</td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン溶液 (25%)</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ケタミン (VetaKet)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-114-10</td><td>麻酔薬</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>試薬</td></tr><tr><td>プレートバケツ エ</td><td>ッペンドルフ</td><td>UL155</td><td>アクセサリー</td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN</td><td>1895 (旧1114683)</td><td>多糖類溶液</td></tr><tr><td>精製マウス抗ヒト CD18 抗体</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td>クローン TS1/18</td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td>試薬</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ 代謝細胞外フラックス分析装置</td><td>Agilent</td><td>XFe96</td><td>機器</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF セル 水戸ストレステストキット</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>ミトコンドリアストレステストキット</td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>エッペンドルフ</td><td>A-4-62</td><td>ローター</td></tr><tr><td>バキュームトラップ 2 バキュームトラップ</td><td>フォックスライフサイエンス</td><td>3052101-FLS</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Wave</td><td></td><td></td><td>Software Application</td></tr><tr><td>XF 1.0 M グルコース溶液</td><td>Agilent</td><td>103577-100</td><td>試薬</td></tr><tr><td>XF 100 mM ピルビン酸溶液</td><td>Agilent</td><td>103578-100</td><td>試薬</td></tr><tr><td>XF 200 mM グルタミン溶液</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td>試薬</td></tr><tr><td>XF DMEM 中</td>型 <td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>試薬</td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>材料</td></tr><tr><td>Xylazine(AnaSedの注入)</td><td>DAILYMED</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>麻酔薬</td></tr></tbody></table>

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

好中球は防御の最前線であり、ヒトで最も豊富な白血球です。これらのエフェクター細胞は、食作用や酸化バーストなどの機能を果たし、微生物クリアランスのための好中球細胞外トラップ(NET)を作成します。好中球の代謝活動に関する新しい洞察は、好中球が主に解糖に依存しているという初期の概念に挑戦します。代謝活性の正確な測定は、トリカルボン酸(TCA)サイクル(クレブス回路としても知られています)、酸化的リン酸化(OXPHOS)、ペントースリン酸経路(PPP)、および生理学的条件および疾患状態における脂肪酸酸化(FAO)を含む好中球のさまざまな代謝要件を明らかにすることができます。本論文では、代謝細胞外フラックス分析装置による代謝フラックス解析を用いて、マウス骨髄由来好中球、ヒト血液由来好中球、好中球様HL60細胞株のミトコンドリア呼吸の指標として酸素消費率(OCR)を測定するための段階的なプロトコルと前提条件について説明します。この方法は、正常および疾患条件下での好中球のミトコンドリア機能を定量するために使用できます。

マウス好中球(図3A)、ヒト好中球(図3B)、および未分化および分化したHL60細胞(図3C)の混合物であるオリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/抗マイシンA混合物に応答するミトコンドリア呼吸の変化を示す代表的なOCRダイナミクスが示されています。すべての細胞において、オリゴマイシン処理は、ATPシンターゼのプロトンチャネルを阻害することによってOCR値を減少させる。FCCP治療は、電子の流れと酸素消費量を増やして膜電位を維持し、最大の呼吸を達成することにより、OCR値を回復させます。ロテノン/抗マイシンA混合処理は、電子伝達鎖の複合体IおよびIIIをブロックすることにより、ミトコンドリア呼吸を排除します。
好中球指向性分化後、HL60細胞はミトコンドリア呼吸の低下を示すことを観察しました(図3C)。上記の異なる呼吸パラメータを定量した後、分...

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、および好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。この方法により、正常および疾患条件下で好中球のミトコンドリア機能を定量化することができます。これは、薬物やあらゆる病状に反応して細胞のミトコンドリア機能に関する洞察を提供できる簡単な手法です。細胞が異なればミトコンドリアの呼吸効率も異なるため、高品質の結果を得るには、細胞播種密度と試薬濃度の最適化を正確に行う必要があります。代謝細胞外フラックスアッセイを開始するには、特別に設計された96ウェルプレート上に充填されたセンサーカートリッジを取り、200マイクロリットルのキャリブレーション培地を下層のプレートの各ウェルに移します。カートリッジとプレートをキャリブラントで慎重に持ち上げ、二酸化炭素を含まない加湿された摂氏37度のインキュベーターに一晩入れて水分補給します。次に、細胞の種類に基づいて、96ウェルプレートを特定のコーティングでコーティングし、細胞接着を確保します。その後、プレートを200マイクロリットルの滅菌PBSで2回洗浄します。1ミリモルのピルビン酸、10ミリモルのグルコース、および2ミリモルのグルタミンを含むDMEM中のアッセイ培地を調製します。マウスとヒトの好中球細胞を、本文原稿に記載されているように調達します。マウスから調達した好中球については、アッセイ培地を添加して細胞密度を10〜6細胞/ミリリットルの1.1倍に調整する。次いで、1ウェルあたり180マイクロリットルのマウス好中球懸濁液を調製した96ウェルプレートに播種する。同様に、アッセイ培地を用いてヒト好中球細胞密度を1ミリリットル当たり10〜6細胞の2.2倍に調整する。アッセイ当日に、血球計算盤を用いて好中球様HL60細胞を手動で計数する。次いで、分化または未分化HL60細胞を300Gで室温で5分間遠心分離する。細胞をDMEMで1回洗浄し、アッセイ培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞の1.39倍の細胞密度を達成します。次に、180マイクロリットルの分化または未分化HL60細胞を、マウスおよびヒト好中球サンプルを含む予め調製された96ウェルプレートに播種する。最後に、播種中のバックグラウンド補正のために、細胞を含まない細胞培養プレートのコーナーウェルに完全な培地を追加します。プレートを室温で300Gで3分間中断することなく遠心分離し、プレートの底部に細胞が適切に付着することを確認します。最後に、プレートを1時間インキュベートして、細胞をアッセイ培地で事前に平衡化します。ミトコンドリアストレステストキットを開き、製造元の指示に従って試薬を準備します。次に、調製したオリゴマイシンをポートAに、FCCPをポートBに、ロテノン/抗マイシンA混合物をポートCに注入するために、試薬をカートリッジにロードします。未使用のポートに20マイクロリットルのアッセイ培地を充填します。アッセイの少なくとも5時間前に、Waveソフトウェアを開き、ヒーターオンタブをクリックして、アッセイシステムを摂氏37度で平衡化します。温度に達すると、Waveソフトウェアの左下隅に準備完了が表示されます。ソフトウェアでミトコンドリアストレスアッセイキットのテンプレートを開きます。左側で注入方法を選択し、[追加]をクリックして、注入条件にヒト好中球またはマウス好中球またはHL60という名前を付けます。ポートAからDをそれぞれクリックして選択し、[化合物の追加]をクリックして、オリゴマイシンまたはFCCPまたはロテノン/抗マイシンAをそれぞれの濃度で入力します。左側で[前処理]を選択し、[追加]をクリックして、CD18とCell Takに別々の名前を付けます。左側のセルタイプを選択します。次に、[追加]をクリックして、ヒト好中球、マウス好中球、およびHL60またはDHL60に名前を付け、必要に応じて摂食密度を付けます。[グループの追加] をクリックしてグループを定義します。次に、下線付きの定義をクリックします。トップメニューのプレートマップをクリックして、左側に定義があり、右側にプレートマップがあるすべてのグループを確認します。ドラッグアンドドロップして、4つのコーナーウェルを背景として維持しながら、各ウェルをグループに追加します。プロトコルを設定するには、トップメニューの[プロトコル]タブを選択し、混合時間を3分、休息時間を0分、測定を7分に設定して、ベースライン、オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、抗マイシンA混合物の3サイクルを定義します。「アッセイの実行」ページに移動し、参照用のプロジェクト・サマリー情報を入力して、「実行の開始」をクリックします。アッセイの完了後にすべての結果が保存されるように、ファイルを保存する場所を指定します。次に、もう一度[実行の開始]をクリックします。アッセイの自動ロード後、トレイが開くのを待って、センサーカートリッジとプレートに200マイクロリットルのキャリブラントを入れます。カートリッジのバーコードの方向を右に向けて設定します。[準備完了] をクリックしてキャリブレーションを実行します。これには約 20 分かかります。キャリブレーション後、Open Trayをクリックし、プレートを細胞播種プレートと交換し、I'm Readyをクリックしてアッセイを続行します。アッセイが完了すると、データは自動的に保存されます。結果をスプレッドシートまたはその他の解析ソフトウェアファイルにエクスポートします。グラフをプロットし、データを分析します。酸素消費速度またはOCRの代表的な動態は、オリゴマイシン、FCCP、およびロテノンと抗マイシンAの混合物に応答して、マウスおよびヒト好中球、ならびに未分化および分化HL60細胞におけるミトコンドリア呼吸の変化を示した。FCCP処理は、電子の流れと酸素消費量を増加させて、OCR値を回復し、最大の呼吸を達成しました。ロテノンと抗マイシンAの混合物は、電子伝達鎖の複合体1および3をブロックし、ミトコンドリア呼吸の排除をもたらす。ミトコンドリア呼吸の低下は、好中球指向性分化後のHL60細胞で観察されました。分化したHL60細胞は、基底ミトコンドリア呼吸、プロトンリーク連鎖呼吸、ATP連鎖呼吸、および非ミトコンドリア呼吸が有意に低いことがわかりました。分化したHL60細胞の最大呼吸の増加は有意ではなかったが、予備の呼吸能力は有意に増加した。OCR値の読み取り中にセンサーカートリッジにフローティングセルによる障害物があってはならないため、セルがプレートの下部にあることを確認してください。この技術は、研究者が好中球関連研究における薬物またはミトコンドリア機能障害の効果を研究するのに役立ちます。

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Research

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大腸菌 は、新生児グラム陰性細菌性髄膜炎の主な原因である。細菌感染の間、好中球によって産生される活性酸素種は主要な殺菌的役割を果たす。ここでは、大...

髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量

代謝適応は、分化、持続性、および細胞毒性を決定するため、T細胞にとって基本的である。ここでは、サイトカイン分化型ヒト初代T細胞の エクスビボ でミトコンドリア呼吸をモニタリングするための最適化されたプロトコールが提示される。...

サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。...

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

ミトコンドリアネットワークは非常に複雑で、解析が非常に困難です。新しいMATLABツールは、タイムラプス画像でライブ共焦点画像化されたミトコンドリアを解析しますが、出力量が大きく、個別の手動操作が必要です。この問題に対処するために、ルーチン最適化が開発され、迅速なファイル分析が可能になりました。...

アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

本稿では、膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせた生細胞解析システムを利用して、好中球細胞外トラップ(NET)を定量する自動化されたハイスループット法を紹介します。...

ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

免疫細胞の生理学的に関連する基質濃度の下でミトコンドリアの生体エネルギーを研究する方法は限られています。私たちは、高分解能蛍光肺活量測定法を使用して、ヒトT細胞、単球、および末梢単核細胞のエネルギー需要に対するミトコンドリア膜電位の応答の変化を評価する詳細なプロトコルを提供します。...

ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

学ぶ マウス・ヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を代謝エクストラセルラーフラックスアナライザーでリアルタイム測定する手法。薬剤や疾患条件下でのミトコンドリア機能評価に有用です。

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

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