zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集
2023年2月17日
このプロトコルは、zSpRY-ABE8eを使用して正確なゼブラフィッシュ病モデルを構築するために、PAMの制限なしに効率的なアデニン塩基編集を実行する方法について説明します。
このプロトコルにより、研究者は、疾患に関連する一塩基変異体のこれまで利用できなかった多くのゼブラフィッシュモデルを構築することができます。PAMの制限は正確な動物モデルを作成する上で大きな障害であり、zSpRY-ABE8eは、低い相互変異と緩和されたPAN制限により、効率的なアデニンからグアニンへの塩基変換を可能にします。このツールは、一塩基海兵隊に関連する病原性疾患メカニズムを研究するための正確なゼブラフィッシュモデルの構築、およびこの病気の薬物スクリーニングに使用できます。
まず、マイクロピペットプーラーシステムをセットアップし、少なくとも30分間予熱します。ガラスキャピラリーを引っ張るには、プログラムを選択し、ランプテスト値を熱、50を引っ張り、速度を100、時間を50、圧力を30に設定します。次に、キャピラリーチューブが溝にあることを確認します。
プルスタート/ストップを押してプログラムを実行します。引っ張られた毛細血管を保存するには、針を吊り下げたまま隙間のあるフォームに挿入します。実験には、原稿に記載されているzSpRY-ABE8e mRNAを使用し、両末端を2'O-メチルホスホロチオエートで修飾したsgRNAを簡単に編集します。
gRNAデザインでは、zSpRY-ABE8eはNYN PAMよりもNRN PAMに対する高い選好性を示すため、PAM配列としてNRNを優先的に選択します。 ターゲットアデニンヌクレオチドは、プロトスペーサーに沿って3番目から9番目のヌクレオチドまで高活性編集ウィンドウに入る。注射の前夜に繁殖タンクを設置します。
仕切りを挿入し、各タンクに2匹のメスと1匹のオスのゼブラフィッシュを配置します。各タンクに蓋をします。翌朝、RNaseフリーのチップ、チューブ、手袋を使用して、解凍したmRNAとEEgRNAを氷上で混合し、それぞれマイクロリットルあたり400ナノグラムと200ナノグラムの最終濃度にします。
空気圧マイクロインジェクターを構成するには、まず、エアポンプの分圧バルブを閉じます。次に、メインバルブを開き、ガスボンベのネジを外し、分圧バルブの圧力を0.2メガパスカルに調整します。次に、マイクロインジェクターの電源を入れ、モードをタイマーに設定します。
パラメータ圧力バルブを20ポンド/平方インチに調整し、タイマー値を0.040秒に調整します。細かい鉗子を使用して、実体顕微鏡下で引っ張られたガラス毛細血管の針を角度を付けて壊します。マイクロローダーピペットチップを使用して、mRNA/gRNA混合物をガラスキャピラリーの先端に加え、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。
マイクロキャップを使用して注入ごとに2ナノリットルの混合物を生成するように圧力とタイマーの値を構成します。魚を10〜15分間飼育した後、卵をこしで集めます。実体顕微鏡で細胞の病期と卵の質を調べます。
単細胞卵を注入して編集効率を向上させます。卵を1.5%アガロース注射プレートに並べ、顕微鏡を使用して2ナノリットルのRNA混合物を胚の細胞に注入します。E3バッファーでペトリ皿に卵を集め、摂氏28度でインキュベートします。
死んだ卵を取り除き、受精後48時間、12時間ごとに培養バッファーを交換します。受精後48時間後、ランダムに選択された6つの注入胚の3つのプールをPCRチューブに集めます。無作為に選択された6つの対照胚を採取したら、ピペットを使用して残留E3バッファーを吸引します。
40マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを胚に加える。チューブを摂氏95度の金属浴に20分間置き、次に15秒間ボルテックスします。pH 8の1モル塩酸トリスを各チューブに4マイクロリットル加えます。
チューブを2000gで室温で10秒間遠心分離します。上清を新しいPCRチューブに移します。PCRチューブから1マイクロリットルの上清を取り除き、サンガーシーケンシングに使用します。
その後、残りの上清を摂氏20度で保管します。サンガーシーケンシングデータを解析するには、まずシーケンシングファイルをアップロードab1 Fileボックスにアップロードします。20塩基対のgRNA配列を5'〜3'方向のgRNA配列を「gRNAを入力」配列ボックスに入力します。
対応するベース位置を 5'開始ボックスと 3'終了ボックスに入力します。予測編集」をクリックし、シーケンスデータの品質を確認することで、基本的な編集効率を取得します。Tsr2の開始コドンのアデニンをグアニンに変換することにより、ダイヤモンドブラックファン貧血ゼブラフィッシュモデルを構築した。
配列データのEditR解析は、Tsr2開始コドンのアデニン塩基におけるAGオーバーラップを示した。2日齢のTsr2胚の表現型は、対照胚と比較してより小さな目を示した。突然変異胚にも心膜の腫れが観察された。
効率的なベース編集を実現するためには、実験を成功させるための前提条件である前述のガイドライン設計原則に厳密に従ってください。正確なモデルは、一塩基変異関連疾患の研究に不可欠です。SprY-ABE8eの開発は、正確なモデリングのための効果的なツールを提供し、疾患メカニズムと治療法の研究を促進するのに役立ちます。
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概要
本プロトコルでは、PAMの制限なく効率的なアデニン塩基編集を可能にするzSpRY-ABE8eシステムを利用して、特定のゼブラフィッシュ疾患モデルを作成するための高度な手法を詳説します。この革新的な技術は、単一塩基バリアントに関連する疾患の精密なモデリングにおいて極めて重要です。
研究の主要構成要素
研究分野
- 遺伝学
- 発生生物学
背景
- PAMの制限が、正確な動物モデルの作製を妨げています。
- 単一塩基変異は、疾患メカニズムを理解する上で重要です。
- zSpRY-ABE8eシステムは、これらの制限に対する解決策を提供します。
使用された手法
- zSpRY-ABE8eを用いたアデニンからグアニンへの塩基置換。
- モデル生物としてのゼブラフィッシュ。
- 遺伝子編集のためのマイクロインジェクション技術。
主な結果
- Diamond-Blackfan貧血の成功的なモデルが開発されました。
- 眼の小型化や心嚢の腫脹など、胚における表現型の変化が観察されました。
- 本手法は、単一塩基バリアント関連疾患に関する今後の研究に向けた枠組みを提供するものです。
結論
- 本研究では、ゼブラフィッシュを用いた正確な疾患モデリングへの新しいアプローチを実証しています。
- これらの知見は、遺伝性疾患の研究および治療的介入を前進させる上で重要です。
よくある質問
産業界における重要性
zSpRY-ABE8eを用いたPAM独立的な塩基編集により、従来のCRISPRワークフローでは不可能であったヒトの一塩基変異疾患に対するゼブラフィッシュモデルの作製が可能になります。これにより、疾患のメカニズム研究や初期段階の薬剤スクリーニングにおけるゼブラフィッシュのトランスレーショナルな有用性が拡大します。このアプローチは、遺伝性疾患のパイプラインにおける前臨床モデルの忠実度とターゲット検証における主要なボトルネックを直接的に解消するものです。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期発見および標的バリデーション
- 機能的なターゲット解析のための、疾患関連SNVの精密なモデリングを可能にします。
- ヒトの病原性変異をin vivoで再現することにより、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 遺伝性疾患におけるターゲットと疾患の関連性に対する予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の表現型スクリーニングに向けた、検証済みのゼブラフィッシュモデルの構築を促進します。
- 化合物評価のための、標準化され再現性のある遺伝的背景を提供します。
- 疾患に関連する表現型に対する薬効の定量的な評価を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- ゼブラフィッシュモデルをヒトのSNV駆動型疾患メカニズムと一致させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 遺伝的に正確なシステムにおけるバイオマーカーの探索および検証をサポートします。
- モデルの不適切さに起因する後期の脱落リスクを軽減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
zSpRY-ABE8eプロトコルは、初期探索と前臨床モデル開発の接点に組み込まれており、ターゲット検証と表現型スクリーニングの段階を橋渡しします。
- 発見生物学：生体内におけるSNVの病原性の仮説検証およびパスウェイマッピングを可能にします。
- スクリーニング：堅牢で再現性のあるスクリーニングキャンペーンのための、遺伝学的に定義されたモデルを提供します。
- 分析：比較分析のための、定量的な編集効率および表現型リードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカーの一致を図るため、疾患モデルがヒトの遺伝的構造を反映することを確実にします。
- エンタープライズ再利用：ゼブラフィッシュにおいて、多様なSNV起因の疾患をモデル化するための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：疾患モデリングにおける予測信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：モデルの作成と編集解析を標準化し、拡張可能なワークフローを実現する。
- 戦略的価値：モデルの妥当性を向上させることで、go/no-go判断および資本配分を改善する。
- ポートフォリオへの影響：遺伝性疾患プログラムのリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- ゼブラフィッシュのハンドリング、マイクロインジェクション、およびCRISPRベースエディティング（塩基編集）設計の専門知識が必要です。
- マイクロインジェクション装置、サンガーシーケンシング、および配列解析ツールへのアクセスが必要です。
- gRNA設計および編集解析において、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- 他のモデルシステムに適応させる場合は、プロトコルの最適化が必要になる可能性があります。
- 編集効率およびオフターゲット効果は、各標的部位について実験的に検証する必要があります。
