Name: zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶzSpRY-ABE8eを用いたPAMレスアデニンベース編集法。Danio rerioで単一塩基変異によるヒト遺伝病モデルを構築し、Diamond-Blackfan貧血の病態メカニズムと治療薬スクリーニング研究に応用する革新的アプローチです。

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この原稿の草稿の英語テキストを編集してくれたLiwen Bianji(Edanz)のBarbara Garbers博士に感謝します。この研究は、広東省の主要地域研究開発プログラム(2019B030335001)、中国の国家重点研究開発プログラム(2019YFE0106700)、中国国家自然科学財団(32070819、31970782)、および広東省の水生経済動物の病原生物学および疫学の主要研究所の研究基金プログラム(PBEA2020YB05)によってサポートされました。

この研究は、華南師範大学のケアアンドユース委員会のガイドラインに厳密に準拠して実施されました。
1. 合成修飾gRNAおよびzSpRY-ABE8e mRNAの調製
<ol><li>以前の文献37、38に従ってgRNAを設計する。<ol><li>zSpRY-ABE8eはNYN PAMよりもNRN PAMの選好が高いため、PAM配列としてNRNを優先的に選択します(RはAまたはG、YはCまたはT)18。ターゲットのアデニンヌクレオチドが高活性編集ウィンドウ(プロトスペーサーに沿った3番目から9番目のヌクレオチド)にあることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>両端に2'-O-メチル-3′-ホスホロチオエート(MS)で修飾したイージーエディットsgRNA(EE gRNA)を注文してください(図1)。 注:EE gRNAはRNaseフリーの水に溶解し、-80°Cで保存する必要があります。</li>
	<li>zSpRY-ABE8eプラスミド18を線形化します。<ol><li>プラスミド6 μgを XbaI 酵素(材料表)で37°Cの金属浴中で3時間直線化します。</li>
		<li>DNA精製キット( 材料表を参照)を使用して、製造元の指示に従って直鎖状化プラスミドを精製します。</li>
	</ol></li>
	<li>in vitro転写キット(材料表)を用いてmRNAを転写します。<ol><li>zSpRY-ABE8e mRNAを、直鎖状化プラスミドを鋳型として、製造元の指示に従って転写します。 注:mRNAおよびgRNAを含むすべての操作では、RNaseフリーの実験用品を使用する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA精製キット(材料表)を使用して、製造元の指示に従ってmRNAを精製します。 注:溶出する前に、細胞毒性を避けるためにエタノールを乾燥させ、すぐに使用しない場合はmRNAを-80°Cで保存する必要があります。</li>
</ol>2.マイクロインジェクションガラスキャピラリーの準備
<ol><li>マイクロピペットプーラーシステムをセットアップし、少なくとも30分間予熱します。</li>
	<li>ランプテストを実行して、製造元の指示に従って、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1 mm、内径0.58 mm)を溶かすのに必要な熱値を決定します。</li>
	<li>プログラムを選択し、キーボードの数字をクリックしてパラメータ値を入力します。ガラスキャピラリーを引っ張るには、熱=ランプテスト値、引っ張り= 50、速度= 100、時間= 50、圧力= 30のパラメータを設定します。</li>
	<li>キャピラリーチューブを取り付け、溝にあることを確認します。 プルスタート/ストップ を押してプログラムを実行します。</li>
	<li>引っ張られた毛細血管を隙間のあるフォームに挿入し、針を吊り下げたまま保存します。</li>
</ol>3. ゼブラフィッシュ胚へのzSpRY-ABE8e mRNAおよびEE gRNA混合物のマイクロインジェクション
<ol><li>注射の前夜に繁殖タンクを設置します。仕切りを挿入し、各タンクに2匹のメスと1匹のオスのAB系統ゼブラフィッシュ(3〜18ヶ月)を入れ、蓋をします。性別の区別については、以前の出版物を参照してください39。 注:より多くの胚を取得するには、少なくとも1週間繁殖していない魚を選択してください。</li>
	<li>注射の翌朝、zSpRY-ABE8e mRNAとEE gRNAを氷上で解凍します。mRNAとgRNAをそれぞれ400 ng/μLと200 ng/μLの最終濃度に混合します。<ol><li>RNaseフリーのチップとチューブを使用して氷上で手順全体を実行し、手袋で取り扱います。</li>
	</ol></li>
	<li>空気圧マイクロインジェクターを構成します。エアポンプの分圧バルブを閉じて、最初にメインバルブを開き、ガスボンベのネジを外し、分圧バルブの圧力を0.2MPa / 29psiに調整します。<ol><li>空気圧マイクロインジェクターの電源を入れ、モードをTIMERに設定し、初期パラメータ圧力値を20.0psiに、TIMER値を0.040秒に調整します。</li>
	</ol></li>
	<li>細かい鉗子を使用して、実体顕微鏡下で引っ張られたガラス毛細血管の針を注意深く壊し、絨毛膜と卵子の穴開けを容易にするために針が斜めに切断されていることを確認します。 注意: 針のブレークポイントは適切な場所にあり、卵を突き刺すのに十分な強度がありながら、卵への損傷を最小限に抑えるのに十分な厚さである必要があります。</li>
	<li>マイクロローダーピペットチップを使用して、zSpRY-ABE8e mRNAとgRNAの混合物をガラスキャピラリーの先端に加え、キャピラリー内の気泡を避けます。ニードルをマイクロマニピュレーターに取り付け、インジェクターの圧力とTIMER値を設定して、マイクロキャップを使用して注入ごとに2nLの混合物が生成されるようにします。</li>
	<li>繁殖タンクの仕切りのプラグを抜き、魚を10〜15分間繁殖させます。ストレーナーを使用して卵を採取し、実体顕微鏡で卵の細胞病期と品質を調べます。単細胞状態の卵を注入対象として選択し、編集効率を向上させます。</li>
	<li>卵を1.5%アガロース注射プレートに並べ、顕微鏡下で胚の卵黄ではなく細胞に2 nLの混合物を注入して、編集効率を向上させます。対照群として少なくとも15個の卵を保持します。</li>
	<li>1x E3バッファーを使用してペトリ皿に卵を集め、28°Cのインキュベーターに入れます。 死んだ卵を取り除き、受精後12時間(hpf)まで48時間ごとに培養バッファーを交換します。</li>
</ol>4. EditRによるベース編集の効率分析
<ol><li>48 hpfで、ランダムに選択された6つの注入胚と6つのランダムに選択されたコントロール胚の3つのプールをそれぞれPCRチューブに収集します。ピペットを使用して、残留E3バッファーを吸引します。</li>
	<li>40 μLの50 mM NaOHをPCRチューブに加えます。チューブを95°Cの金属浴に20分間入れ、次に15秒間ボルテックスします。</li>
	<li>4 μLの1 Mトリス·HCl(pH 8.0)を各チューブに挿入し、NaOHを中和した。室温で2,000 x g で10秒間短時間遠心分離し、チューブ壁から液滴を除去します。上清を新しいPCRチューブに回収し、-20°Cで保存します。</li>
	<li>gRNA標的部位の上流および下流に適切なプライマーを設計します。上記の上清1 μLを、50 μL容量のPCR反応の鋳型として使用します。本試験でPCRに用いたプライマーを 別表1に示します。</li>
	<li>DNAアガロースゲル電気泳動を実行して、正確で特異的なバンドを確認し、続いて前述のようにサンガーシーケンシングを行います40。</li>
	<li>サンガーシーケンシングデータをEditR(1.0.10)プログラム41で解析します。<ol><li>シーケンス ファイル (ab1 形式) を [.ab1 ファイルをアップロード] ボックスにアップロードします。</li>
		<li>20 bp gRNA配列を5'-3′方向で「gRNA配列を入力」ボックスに入力します。</li>
		<li>シーケンシングファイル(ab1形式)を開き、20 bp gRNA配列が開始および終了する塩基位置を確認します。「5'開始」ボックスと「3'終了」ボックスに対応するベース位置を入力します。</li>
		<li>[予測編集]をクリックして、基本的な 編集 効率を取得します。gRNAターゲット配列付近のシーケンシングデータの品質をチェックして、無秩序なピークやインデルを回避します。 注:一般に、無秩序なピークは、PCRアニーリング温度を調整することで効果的に除去できます。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423(2018).</li>
<li>Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BE4max+and+AncBE4max+are+efficient+in+germline+conversion+of+C%3AG+to+T%3AA+base+pairs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish.</a> Cells. 9 (7), 1690(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li>
<li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpRY+greatly+expands+the+genome+editing+scope+in+rice+with+highly+flexible+PAM+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition.</a> Genome Biology. 22 (1), 6(2021).</li>
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<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+by+efficient+genome+editing+using+a+near+PAM-less+base+editor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo.</a> Nature Communications. 13, 3435(2022).</li>
<li>Cornean, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+in+vivo+functional+analysis+of+DNA+variants+with+base+editing+using+ACEofBASEs+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction.</a> eLife. 11, 72124(2022).</li>
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<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

このプロトコルは、ベースエディタzSpRY-ABE8eを使用したゼブラフィッシュ病モデルの構築を記述します。塩基置換のための従来のHDR経路と比較して、このプロトコルはより効率的な塩基編集を達成し、インデルの発生を減らすことができます。同時に、このプロトコルには、最近提案されたi-Silence遺伝子ノックアウト戦略をゼブラフィッシュに実装することが含まれます。まとめると、zSpRY-ABE8eは、疾患研究におけるゼブラフィッシュモデルの適用を強化します。
オフターゲット効果は、CRISPR/Cas9システムで一般的な問題です。PAMレスの制限を考慮すると、tsr2ターゲティング18を含む以前の研究で有意なオフターゲットが見つからなかったとしても、zSpRY-ABE8eのオフターゲット効果はより高い可能性があります。幸いなことに、この問題は厳格なgRNA設計基準によって回避でき、1つのゲノム配列のみがgRNAとPAMを正確に一致させ、予測されるオフターゲットサイトの総数を最小限に抑えます。さらに、ある研究では、リボ核...

ミスセンス変異またはナンセンス変異を引き起こす一塩基変異体(SNV)は、ヒトゲノム1における最も一般的な変異源です。特定のSNVが病原性であるかどうかを判断し、その病因を明らかにするためには、正確な動物モデルが必要です2。ゼブラフィッシュは、ヒトとの高度な生理学的および遺伝的相同性、短い発生サイクル、および強力な繁殖能力を示す優れたヒト疾患モデルであり、病原性の特徴とメカニズムの研究、および薬物スクリーニングに有利です3。
クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)/Cas9システムは、ゼブラフィッシュ4を含むさまざまな種のゲノム編集に広く適用されています。gRNAガイダンスにより、CRISPR/Cas9システムは標的部位でDNA二本鎖切断(DSB)を生成することができ、相同性指向性修復(HDR)経路を介して標的部位とドナーDNAテンプレートとの組換えによる一塩基置換が可能になります。しかし、細胞DNA修復プロセスは主に非相同末端結合(NHEJ)経路によって行われ、通常は挿入および欠失(インデル)変異を伴うため、この塩基置換法の効率は非常に低いです5。幸いなことに、CRISPR/Cas9ベースのシングルベース編集技術は、DSBを誘導することなくより効率的なシングルベース編集を可能にするベースエディタを使用することで、この問題を大幅に軽減します。Two major classes of base editors, adenine base editors (ABEs) and cytosine base editors (CBEs), have been developed to implement base substitution editing for A·T から G·C および C·G から T ·A、それぞれ6、7、8、9、10、11。これらの4種類の塩基置換は、ヒト病原性多様体の30%をカバーしています12。PmCDA1、BEシステム、CBE4max、ABE7.10、ABE8eを含む両方のクラスのベースエディタは、ゼブラフィッシュで動作することが報告されており、特にBE4maxとABE8eは高い編集活動を達成することが報告されています13,14,15,16,17,18,19。
黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、およびS.canisを含む異なる種のCas9タンパク質は、ゼブラフィッシュ遺伝子編集に実装されており、化膿レンサ球菌Cas9(SpCas9)が最も広く使用されています20,21,22,23。 しかしながら、SpCas9は、NGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する標的部位しか認識できず、これはその編集可能な範囲を制限し、その結果、目的の病原性部位の近くに適切な配列が見出されない可能性がある24。ターゲット範囲を拡大するために、さまざまなSpCas9バリアントが、指向性進化と構造ガイド付き設計を通じてさまざまなPAMを認識するように設計されています。しかし、動物、特にゼブラフィッシュに有効な変異体はほとんどなく、SNV関連疾患研究におけるゼブラフィッシュの適用を制限しています25,26,27,28。最近、SpCas9の2つのバリアント、SpGおよびSpRYは、PAM制限がそれほど厳しくない(SpGのNGNおよびSpRYのNNNはNYNよりもNRNの選好が高い)が、ヒトの細胞および植物において高い編集活性を示すことが報告されている29,30,31,32。その後、SpGとSpRY、およびSpRYを介したCBEやSpRYを介したABEなどの多くの媒介ベースエディターもゼブラフィッシュで機能することが報告されており、SNV関連疾患の機構研究と薬物スクリーニングにおけるゼブラフィッシュモデルの適用を強化します18,33,34,35.さらに、i-Silenceは、ABEを介したATGからGTGまたはACG36への開始コドン変換による効果的で正確な遺伝子ノックアウト戦略として提案されました。i-Silence戦略とSpRYを介したベースエディターzSpRY-ABE8eの組み合わせは、疾患モデリングのための新しい方法を提供します18。このプロトコルは、ゼブラフィッシュでzSpRY-ABE8eを使用して遺伝子編集を実行し、i-Silence戦略を使用してtsr2(M1V)モデルを構築する方法を示しています。ゼブラフィッシュモデルに現れる編集効率と表現型を評価および分析しました。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>1.5%アガロースを使用して注入プレート</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管を作るために使用&nbsp;</td><td>ハーバード・イスラーム</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>Kit for Infusion clone&nbsp;</td></tr><tr><td>コドン最適化サービス</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>長さ:32 mm、容量:0.5 &mu;L</td></tr><tr><td>EasyEdit gRNAサービス</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td><td>Meedle</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Pullerを</td>壊すために使用&nbsp;<td>スタッター器具</td><td>P-97</td><td>ガラス毛細血管を引っ張るために使用されます</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>PCR反応に使用</td></tr><tr><td>インテリジェント人工気候ボックス</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>ゼブラフィッシュの胚を培養するために使用されます</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td> ゼ<td>ブラフィッシュを固定するために使用されます</td></tr><tr><td>マイクロローダーピペットのヒント&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINEキット&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II 高速変異導入キット V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>部位特異的変異導入用キット</td></tr><tr><td>空気圧マイクロインジェクター</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>RNA精製用キット</td></tr><tr><td>サンガーシーケンシングサービス</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、粒状</td> ゲノム抽出に使用される <td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH</td></tr> 実<tr><td>体顕微鏡</td><td>オリンパス&nbsp;</td>表現<td>型の写真に使用</td> <td>SZX10</td></tr><tr><td>SZシリーズ ズーム実体顕微鏡</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>in vitro転写用キット&nbsp;</td></tr><tr><td>TIANprep ミニプラスミドキット</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>プラスミド抽出キット用キット</td></tr><tr><td>TIANquick ミニ精製キット TIANGEN</td><td></td><td>DP203-02</td><td>直線化プラスミド精製用キット</td></tr><tr><td>トリカイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>ゼブラフィッシュの麻酔に使用</td></tr><tr><td>トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン</td><td>サンゴン</td><td>A600194-0500</td><td>トリス&ミドドットの成分;ゲノム抽出に使用されるHCl</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>プラスミドの線形化に使用される制限エンドヌクレアーゼ</td></tr></tbody></table>

zspry-abe8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なpamレスベース編集

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9技術は、ヒト遺伝病のモデル化、疾患病因の研究、および薬物スクリーニングのためのゼブラフィッシュの価値を高めましたが、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の制限は、一塩基変異体(SNV)によって引き起こされるヒト遺伝性疾患の正確な動物モデルを作成する上で大きな障害となっています。これまで、幅広いPAM互換性を持ついくつかのSpCas9バリアントは、ゼブラフィッシュで効率を示してきました。最適化されたSpRY媒介アデニン塩基エディター(ABE)、zSpRY-ABE8e、および合成修飾gRNAをゼブラフィッシュに適用することで、PAMの制限なしに効率的なアデニン-グアニン塩基変換が可能になりました。ここで説明するのは、zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュにおけるPAM制限のない効率的なアデニン塩基編集のためのプロトコルである。zSpRY-ABE8e mRNAと合成修飾gRNAの混合物をゼブラフィッシュ胚に注入することにより、TSR2リボソーム成熟因子(tsr2)の病原部位を模擬した正確な変異を有するゼブラフィッシュ病モデルを構築した。この方法は、疾患メカニズムと治療法を研究するための正確な疾患モデルを確立するための貴重なツールを提供します。

TSR2の変異は、ダイヤモンドブラックファン貧血(DBA)を引き起こすことが報告されています42。ここでは、i-Silence戦略を使用してtsr2(M1V)変異を持つDBAゼブラフィッシュモデルを構築しました。ゼブラフィッシュtsr2のスタートコドンのアデニンは、zSpRY-ABE8eを用いてグアニンへの変換に成功しました(図3)。
サンガーシーケンシング結果のEditR解析では、 tsr2 開始コドンのアデニン塩基にA/Gオーバーラップがあることが示されました(図4)。
F0ファウンダーを以前に生成された tsr2 ヘテロ接合変異体成体と交配させた後、受精後2日目(dpf)に顕微鏡下で胚表現型を観察しました。いくつかの胚は、対照と比較して、より小さな目と腫れた心膜の表現...

このプロトコルは、zSpRY-ABE8eを使用して正確なゼブラフィッシュ病モデルを構築するために、PAMの制限なしに効率的なアデニン塩基編集を実行する方法について説明します。

zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

このプロトコルにより、研究者は、疾患に関連する一塩基変異体のこれまで利用できなかった多くのゼブラフィッシュモデルを構築することができます。PAMの制限は正確な動物モデルを作成する上で大きな障害であり、zSpRY-ABE8eは、低い相互変異と緩和されたPAN制限により、効率的なアデニンからグアニンへの塩基変換を可能にします。このツールは、一塩基海兵隊に関連する病原性疾患メカニズムを研究するための正確なゼブラフィッシュモデルの構築、およびこの病気の薬物スクリーニングに使用できます。まず、マイクロピペットプーラーシステムをセットアップし、少なくとも30分間予熱します。ガラスキャピラリーを引っ張るには、プログラムを選択し、ランプテスト値を熱、50を引っ張り、速度を100、時間を50、圧力を30に設定します。次に、キャピラリーチューブが溝にあることを確認します。プルスタート/ストップを押してプログラムを実行します。引っ張られた毛細血管を保存するには、針を吊り下げたまま隙間のあるフォームに挿入します。実験には、原稿に記載されているzSpRY-ABE8e mRNAを使用し、両末端を2'O-メチルホスホロチオエートで修飾したsgRNAを簡単に編集します。gRNAデザインでは、zSpRY-ABE8eはNYN PAMよりもNRN PAMに対する高い選好性を示すため、PAM配列としてNRNを優先的に選択します。 ターゲットアデニンヌクレオチドは、プロトスペーサーに沿って3番目から9番目のヌクレオチドまで高活性編集ウィンドウに入る。注射の前夜に繁殖タンクを設置します。仕切りを挿入し、各タンクに2匹のメスと1匹のオスのゼブラフィッシュを配置します。各タンクに蓋をします。翌朝、RNaseフリーのチップ、チューブ、手袋を使用して、解凍したmRNAとEEgRNAを氷上で混合し、それぞれマイクロリットルあたり400ナノグラムと200ナノグラムの最終濃度にします。空気圧マイクロインジェクターを構成するには、まず、エアポンプの分圧バルブを閉じます。次に、メインバルブを開き、ガスボンベのネジを外し、分圧バルブの圧力を0.2メガパスカルに調整します。次に、マイクロインジェクターの電源を入れ、モードをタイマーに設定します。パラメータ圧力バルブを20ポンド/平方インチに調整し、タイマー値を0.040秒に調整します。細かい鉗子を使用して、実体顕微鏡下で引っ張られたガラス毛細血管の針を角度を付けて壊します。マイクロローダーピペットチップを使用して、mRNA/gRNA混合物をガラスキャピラリーの先端に加え、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。マイクロキャップを使用して注入ごとに2ナノリットルの混合物を生成するように圧力とタイマーの値を構成します。魚を10〜15分間飼育した後、卵をこしで集めます。実体顕微鏡で細胞の病期と卵の質を調べます。単細胞卵を注入して編集効率を向上させます。卵を1.5%アガロース注射プレートに並べ、顕微鏡を使用して2ナノリットルのRNA混合物を胚の細胞に注入します。E3バッファーでペトリ皿に卵を集め、摂氏28度でインキュベートします。死んだ卵を取り除き、受精後48時間、12時間ごとに培養バッファーを交換します。受精後48時間後、ランダムに選択された6つの注入胚の3つのプールをPCRチューブに集めます。無作為に選択された6つの対照胚を採取したら、ピペットを使用して残留E3バッファーを吸引します。40マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを胚に加える。チューブを摂氏95度の金属浴に20分間置き、次に15秒間ボルテックスします。pH 8の1モル塩酸トリスを各チューブに4マイクロリットル加えます。チューブを2000gで室温で10秒間遠心分離します。上清を新しいPCRチューブに移します。PCRチューブから1マイクロリットルの上清を取り除き、サンガーシーケンシングに使用します。その後、残りの上清を摂氏20度で保管します。サンガーシーケンシングデータを解析するには、まずシーケンシングファイルをアップロードab1 Fileボックスにアップロードします。20塩基対のgRNA配列を5'〜3'方向のgRNA配列を「gRNAを入力」配列ボックスに入力します。対応するベース位置を 5'開始ボックスと 3'終了ボックスに入力します。予測編集」をクリックし、シーケンスデータの品質を確認することで、基本的な編集効率を取得します。Tsr2の開始コドンのアデニンをグアニンに変換することにより、ダイヤモンドブラックファン貧血ゼブラフィッシュモデルを構築した。配列データのEditR解析は、Tsr2開始コドンのアデニン塩基におけるAGオーバーラップを示した。2日齢のTsr2胚の表現型は、対照胚と比較してより小さな目を示した。突然変異胚にも心膜の腫れが観察された。効率的なベース編集を実現するためには、実験を成功させるための前提条件である前述のガイドライン設計原則に厳密に従ってください。正確なモデルは、一塩基変異関連疾患の研究に不可欠です。SprY-ABE8eの開発は、正確なモデリングのための効果的なツールを提供し、疾患メカニズムと治療法の研究を促進するのに役立ちます。

efficient-pam-less-base-editing-for-zebrafish-modeling-human-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、生理的に、関連する高感度で特異的な開発のための体系的なアプローチを提示...

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

ゼブラフィッシュは、遺伝学および発生研究のための優れたモデルシステムです。ビーズ移植は、局所的な細胞環境の変化を導入することにより、発生メカニズムを調査するために使用できる貴重な組織操作技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚にマイクロビーズ移植を行う方法について説明します。...

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

トランスジェニック操作およびゲノムの編集は、機能的遺伝子とシス -regulatory要素の役割をテストするために重要です。ここでは、ゲノム（Tol2の媒介蛍光レポーター導入遺伝子構築物を含む、TALENs、およびCRISPRs）の変更を生成するための詳細なマイクロインジェクションプロトコルが緊急モデルの魚のために提示され、イトヨ。...

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

有糸分裂はすべての生物にとって重要であり、欠陥はしばしば癌や発達障害を引き起こします。このイメージングプロトコルとゼブラフィッシュをモデルシステムとして使用することで、研究者は生きた脊椎動物の有糸分裂と、有糸分裂プロセスに欠陥がある場合に生じる多数の欠陥を視覚化することができます。...

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR...

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

ゼブラフィッシュは、遺伝子編集技術の登場により、特に、生物医学研究における信頼性の高い遺伝モデル有機体として使用されています。幼虫の表現型の場合は、DNA 抽出と遺伝子型同定は挑戦できます。ここでは、尾クリッピング、早ければ 72 時間後受精によるゼブラフィッシュの幼虫、効率的なジェノタイピング手順について述べる.

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

進化系アステュアナクス メキシコで遺伝子を操作するためのアプローチについて述べる。3 つの方法を示します: メダカ Tol2 を介した遺伝子導入、CRISPR/Cas9、および morpholinos...

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

このプロトコルは、CRISPR-Cas9技術を使用してゼブラフィッシュ胚の正確なノックイン編集を容易にするアプローチを説明しています。表現型パイプラインは、QT延長症候群関連遺伝子変異をモデル化するためのこれらの技術の適用可能性を実証するために提示される。...

CRISPR-Cas9を介したゼブラフィッシュハートの正確なノックイン編集

CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0...

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

ここでは、ゼブラフィッシュの低存在量タンパク質の可視化に特に有用な、新たに開発および改変された in vivo...

ゼブラフィッシュの低発現タンパク質を可視化するための蛍光標識

RASopathyiesは、RAS-MAPK経路の過剰活性化によって引き起こされる多系統遺伝性症候群です。検証を待っている潜在的に病原性の多様体が次々と出現する一方で、前臨床のエビデンスが乏しいため治療が制限されています。ここでは、Teen-reporter ZebrafishのライブFRETイメージングにより、RASopathy関連ERK活性化レベルとその薬理学的調節を胚発生時に試験および交差検証するためのin...

ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

学ぶzSpRY-ABE8eを用いたPAMレスアデニンベース編集法。Danio rerioで単一塩基変異によるヒト遺伝病モデルを構築し、Diamond-Blackfan貧血の病態メカニズムと治療薬スクリーニング研究に応用する革新的アプローチです。

zSpRY-ABE8eを用いたゼブラフィッシュヒト遺伝病モデリングのための効率的なPAMレスベース編集

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