Name: 全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ全細胞パッチクランプ法による視床下部キスペプチンニューロンの電気生理学的記録。脳切片を用いてイオン電流を測定し、生殖神経内分泌学の理解を深める実験手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究は、サンパウロ研究財団[FAPESP助成金番号:2021/11551-4(JNS)、2015/20198-5(TTZ)、2019/21707/1(RF)、およびCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV)の支援を受けた。

すべての動物の手順は、サンパウロ大学の生物医科学研究所の動物倫理委員会によって承認され、ブラジル動物実験大学によって採用された倫理ガイドラインに従って実施されました。
1.溶液の調製
<ol><li>内部溶液の調製 注意: 内部溶液はパッチクランプマイクロピペットを満たし、細胞の内部に接触します( 図2の例を参照)。内部溶液は、測定される活性のタイプに応じて変化し得る33。<ol><li>実験目的と適切なレコードタイプを考慮して内部ソリューションを選択します。電流クランプモードで膜電位を記録するには、120 mM K-グルコン酸塩、1 mM NaCl、5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgCl 2、1 mM CaCl2、3 mM KOH、10 mM KCl、および4 mM(Mg)-ATPで構成される内部溶液を使用します。表1に示すように、所望の最終容量に従ってすべての塩を秤量する。</li>
		<li>溶液の最終体積の90%に達するのに十分な脱イオン水を使用してください。この容量は、pHと浸透圧を調整するのに十分なスペースを確保します。</li>
		<li>すべての成分を完全に添加して混合した後、pHメーターを使用して5 M KOHでpHを7.2〜7.3に調整します。浸透圧計を使用して、約275〜280 mOsmの浸透圧を確認します(必要に応じて、ダウンのみを調整します)。</li>
		<li>内部溶液を事前に調製し、8°Cで保存してください。 実験当日にATPを追加します。ATP含有内部溶液を-20°C(1 mLアリコート)で3〜4か月間保存します。.</li>
	</ol></li>
	<li>スライス液の調製<ol><li>238 mM スクロース、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.0 mM NaH 2 PO4、10 mM グルコース、1.0 mM CaCl 2、および5.0 mM MgCl2を含むスライス溶液を調製します。表2に示すように、所望の最終容量に従ってすべての塩を秤量する。調製するこの溶液の正確な量は、切断チャンバのサイズによって異なります。</li>
		<li>脱イオン水中ですべての塩を混合しながら、常にカルボゲン(95%O 2および5%CO2)で飽和させる。ポリエチレンチューブ(外径1.57 mm[OD] x 内径1.14 mm[ID])をカルボゲンシリンダーに取り付けて、スライス溶液にカルボゲンを供給します。スライス液を含むビーカーの内側にチューブの開放端を保持します。</li>
		<li>すべての成分をよく混ぜた後、pHメーターを使用して10%硝酸でpHを7.3に調整します。浸透圧計を使用して、290〜295 mOsmの浸透圧を確認します(必要に応じて、下方向にのみ調整します)。その後、溶液を0〜2°Cに冷却する。</li>
	</ol></li>
	<li>録画用の CSF ソリューションを準備する<ol><li>124 mM NaCl、2.8 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH 2 PO 4、1.2 mM MgSO4、5 mM グルコース、および2.5 mM CaCl2を含む記録用の人工脳脊髄液(aCSF)溶液を調製します。表3に示す所望の最終容量に従って全ての塩を秤量する。</li>
		<li>脱イオン水中で全ての塩を混合しながら、ステップ1.2.2で説明したように、カルボゲン(95%O2および5%CO2)で絶えず飽和させる。</li>
		<li>すべての成分を加えて混合した後、pHメーターを使用してpHを7.3に調整します(10%硝酸を使用できます)。浸透圧計を使用して、290〜300 mOsmの浸透圧を確認します。その後、aCSFをビーカーに注ぎ、30°Cの水浴中に維持する。</li>
	</ol></li>
</ol>2.脳の解剖とスライス
注:異なる脳構造は異なる平面(冠状、矢状、または水平スライス)での切断を必要とする場合があるため、スライスを取得するための正確なアプローチは、関心のある脳領域によって異なります。典型的には、AVPV/PeNおよびARH(ここではAVPV/PeNキスペプチンニューロンおよびARHキスペプチンニューロンと呼ばれる)におけるKiss1発現細胞を研究する。図2A、B)、冠状脳スライス(200〜300μm)は、通常、17、19、20、21、34で作られる。AVPV / PeNキスペプチンニューロンはブレグマから約0.5〜-0.22 mmに位置し、ARHキスペプチンニューロンは-1.22〜-2.70 mmに位置しています。核位置は、定位固定装置マウス脳アトラス35またはアレンマウス脳参照アトラス(http://mouse.brain-map.org/)を用いて決定することができる。この研究では、成体のKiss1-Cre / GFP雌(発情期)および雄マウス36を使用しました。
<ol><li>脳の除去<ol><li>解剖部位と脳の抽出に必要なツールを準備します:断頭ハサミ、アイリスハサミ、カストロビエホ湾曲ハサミ、骨切り、ピンセット、ヘラ、ろ紙、ペトリ皿、かみそりの刃、シアノアクリレート接着剤。</li>
		<li>スライスを作成する前に、その後のすべての手順を迅速に実行する必要があるため、解剖が実行されるベンチを準備します。ビブラトームなどのスライス装置にアクセスできることを確認してください。</li>
		<li>組織をスライスする前に、脳スライスを維持するための記録チャンバーを準備します。市販ブランド(材料表)から、浴寸法24 mm x 15 mm x 2 mm(長さ x 幅 x 高さ)の記録室を入手するか、社内で作成します。 注:社内回収チャンバーは次のように製造できます:9つのウェルが利用可能になるように24ウェルプレートをカットします。ナイロンスクリーンを9つのウェルのベースに接着します。ウェルプレートの残りの部分で、ナイロンの下部が自由になるようにベースを作ります。この適合ベースは、aCSFを含む500mLビーカーの中に入れることができます(補足図1)。</li>
		<li>すべてを準備した後、4%〜5%イソフルランを使用して吸入麻酔薬で動物を麻酔します。麻酔は、倫理委員会によって承認されたプロトコルに従っていなければなりません。動物が動かなくなった直後に、尾と足のピンチテストを実行して、動物が深く麻酔をかけられていることを確認します。</li>
		<li>心臓がまだ活動している間にマウスをすばやく斬首して、細胞の生存率を高めます。斬首後すぐに脳を収穫します。</li>
		<li>外科用ハサミで、動物の頭蓋骨の上部、尾側から吻側まで皮膚を切開し、動物の頭から頭皮を取り除きます。次に、虹彩ハサミで矢状縫合糸に沿って頭頂間板を切り、後頭骨を取り除きます。骨切りを頭頂骨の下にスライドさせ、脳が露出するまでそっと引き出します。</li>
		<li>脳を露出させた後、頭を逆さまにし、脳をそっと下げて両側の三叉神経を視覚化し、カストロビエホ湾曲ハサミを使用して三叉神経を切ります。視床下部を視覚化した後、視神経を特定し、穏やかに切断します。 注:視神経を切断するときは、視神経を引っ張るとAVPV / PeN核を含む隣接する視床下部領域が裂けるため、注意してください。</li>
		<li>前頭葉の最も前部を切断し、脳を完全に切除します。スライスを取得するまで、すぐに脳をスライス溶液に浸します。</li>
	</ol></li>
	<li>脳サンプルのスライス<ol><li>脳をろ紙(ペトリ皿で支えられている)の上に置き、余分な溶液を乾燥させます。次に、鋭い切断かみそりの刃で、脳幹と小脳を残りの組織から分離する冠状切断を実行します。</li>
		<li>次に、脳の尾部をビブラトームの基部に接着し、スライス装置のチャンバーに0〜2°Cに冷却したスライス/ aCSF溶液を満たします。 手順の間、ビブラトームチャンバーの周りにドライアイスを詰めて、スライス液を冷たく保ちます。</li>
		<li>かみそりの刃をビブラトームに挿入し、デバイスの適切な切断パラメータを設定します:速度= 3、周波数= 9、および送り= 250μm。アクリルトランスファーピペット(シリコン乳首に取り付けられた逆パスツールガラスピペット)を使用して、組織スライス手順中にスライスを回収チャンバーに移します(ステップ2.1.3で説明)。スライス取得後の組織回復を60分待ちます。</li>
	</ol></li>
</ol>3.記録のためのセルシーリング
<ol><li>記録を開始する前に、すべての機器(顕微鏡、アンプ、デジタイザー、マイクロマニピュレーターなど)がオンになっていることを確認してください。</li>
	<li>顕微鏡に取り付けられた市販ブランド(材料表)の記録室に、記録用のaCSF溶液を充填します。灌流ポンプを使用して、aCSFを2 mL / minの速度で常に灌流します。</li>
	<li>目的の脳スライスを(一度に1つずつ)記録チャンバーに移します。アクリルトランスファーピペット(シリコン乳首に取り付けられた逆パスツールガラスピペット)を使用して、視床下部スライスをチャンバーに移します。スライスアンカー(材料表)を使用してスライスを保持し、aCSF灌流中にスライスが動かないようにします。</li>
	<li>顕微鏡に取り付けられた記録室の中央にスライスを置きます。スライス位置は、顕微鏡下で目的の領域をよく観察し、記録マイクロピペットに完全に到達させるために重要です。</li>
	<li>液浸顕微鏡の低倍率対物レンズ(10倍または20倍)を使用して、スライスの位置決めと関心領域の位置決めを支援します。</li>
	<li>関心領域を特定した後、対物レンズを高倍率レンズ(63倍)に切り替えて組織レベルに焦点を合わせ、内因性蛍光タンパク質および標的領域内の細胞の形状を観察して、脳スライス20の表面上のキスペプチン細胞を見つける。</li>
	<li>可能なターゲットセルが見つかったら、マウスカーソルを使用するか、関心のある領域に正方形などのフォーマットを描画して、コンピューター画面上でマークします。コンピューターのスクリーンマークは、記録マイクロピペットの位置をセルに導くのに役立ちます。</li>
	<li>ターゲットセルの正確な位置を決定したら、対物レンズを持ち上げ、内部溶液で満たされた記録マイクロピペットを導入します。マイクロピペットを電極ホルダーに入れるときは、内部溶液が銀電極に接触していることを確認してください。 注意: マイクロピペットの準備、配置、および電極ホルダーへの位置決めについては、33を参照してください。</li>
	<li>マイクロピペットをaCSF溶液に浸す前に陽圧をかけ、破片がマイクロピペットに入るのを防ぐために、ポリエチレンチューブ(≈130 cm長い)を介してマイクロピペットホルダーに接続された1〜3 mLの空気充填シリンジを使用します。約100〜200μLの空気を塗布します。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを対物レンズの中央の下にガイドします。マイクロマニピュレーターのボタンを動かして、X-Y-Z軸上のマイクロピペットを目的のセルに向かってガイドします。</li>
	<li>マイクロピペットの先端が見えるようにフォーカスを調整し、フォーカスをスライスに近づけすぎないようにします。マイクロマニピュレーターの速度を落とし、マイクロピペットを焦点面までゆっくりと下げます。マイクロピペットチップがスライスに突然浸透するのではなく、細胞/標的領域の表面に触れるまでゆっくりと下降することを確認してください。</li>
	<li>マイクロピペットホルダーに取り付けられた1〜3 mLの空気充填シリンジを使用して、軽い陽圧(≈100 μL)を適用して、アプローチパスから破片を取り除きます。</li>
	<li>ターゲットセルに焦点を合わせ、マイクロマニピュレーターをX-Y-Z軸上でゆっくりと動かして、マイクロピペットをターゲットセルに近づけます。マイクロピペットを細胞に触れると、マイクロピペットチップに加えられる圧力によって引き起こされるディンプルが観察されます(図2C)。</li>
	<li>ディンプルを形成した後、マイクロピペットが細胞に近接しているため、マイクロピペットホルダーに接続されたチューブを介して口から弱く短時間吸引し(1〜2秒)、マイクロピペットとセルの間にシールを生成します(ギガオームシールまたはギガシール>1GΩ; 図2D)。シールを形成するには、ソフトウェアの電圧クランプモードを使用します。シール形成の詳細については、33を参照してください。</li>
	<li>シールが安定している場合(ギガオームシールは機械的に安定しており、ノイズ干渉がなく、約1分間の観察によって決定される)、保持電圧を目的のセルの最も近い生理学的静止電位に設定します。キスペプチン視床下部ニューロンの場合、-50mVが推奨されます。</li>
	<li>細胞に密封されたマイクロピペットで口から短時間吸引(陰圧)を加え、原形質膜を破壊します(図2E)。破裂したメンブレンがマイクロピペットを詰まらせず、メンブレンのかなりの部分またはセルを引き付けないように、十分な力で吸引が行われると、適切な全セル構成が達成されます。</li>
	<li>使用しているシステム設定マニュアルを確認してください。ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、直列抵抗(SR)とセル全体の容量(wcc)をデジタルで確認および計算します。</li>
	<li>電圧クランプモードでは、細胞膜を破壊した後、セル全体オプションを有効にし、セルタブ全体を参照して自動コマンドをクリックします。セルのSRとwccは自動的に計算され、ソフトウェアによって即座に表示されます。これらのパラメータは、 材料表33に記載されている増幅器で膜試験を行うことによっても確認することができる。</li>
	<li>細胞生存率パラメータを必ず確認してください。キスペプチンニューロンの場合、電気生理学的測定値がSR < 25 mΩ、入力抵抗>0.3 GΩ、および保持電流絶対値が30 pA<であることを確認します(個人的な観察および参考文献21)。AVPV/PeNキスペ プチンまたはARHキスペプチン ニューロンのwccの平均値は、生殖腺インタクトマウスでは10-12pF≈20である。</li>
	<li>実験中にSRとセルの定常静電容量を監視します。記録中にSRが20%を超えて変化せず、膜静電容量が安定していることを確認してください。</li>
	<li>ソフトウェアの設定を確認してください。実験の種類に応じて、録音用の特定のプロトコルを作成します。 材料表に記載されている機器を使用して、電流クランプモードで膜電位を記録するには、2〜4 kHzで電気生理学的信号をローパスフィルタリングし、ソフトウェアでオフラインで結果を分析します(ソフトウェア情報については、 材料の表 を参照してください)。</li>
	<li>セル全体の構成が適切に達成されたら、電圧クランプモードでシナプス電流を測定します(図2G)。静止膜電位(RMP)の変化と電流クランプモードでの誘導RMP変動を記録します(図2H)。細胞膜の脱分極などのRMPの変化は、 図1に示すように、既知の薬物/神経伝達物質を浴に投与することによって誘発できます(ステップ3.2に記載)。 注意: 電流クランプモードでは、正または負の電流を注入して、膜電圧を目的の電圧に保持できます。キスペプチンニューロンの場合、通常、膜電位の自発的な変化を記録するためにゼロ電流注入(I = 0)を設定します。</li>
</ol>

宣言される利益相反はありません。

全細胞パッチクランプ技術の開発は科学界に大きな影響を与え、科学研究を発展させ、いくつかの発見を可能にするために最も重要であると考えられていました。科学への影響は、1991年にノーベル医学賞を受賞するのに十分であり、この発見は、生理学的および病理学的条件下でイオンチャネルがどのように機能するかについてのより良い理解と、治療薬の潜在的な標的の特定への扉を開いた11,39,40,41。.医学の分野では、この技術を使用して行われた優れた発見の1つは、臨床的に使用されるいくつかの物質(局所麻酔薬、抗不整脈薬、抗糖尿病薬、筋弛緩薬など)がイオンチャネルと直接相互作用することでした42。したがって、その適用可能性は臨床研究所や基礎研究部門で明らかです。この記事では、視床下部キスペプチンニューロンを含む脳スライスで全細胞パッチクランプ実験を実行するため...

ホジキンとハクスリーは、いくつかの科学的研究で説明されている活動電位の最初の細胞内記録を作成しました。この記録は、大きな直径(~500μm)を持つイカ軸索で行われ、軸索の内側に微小電極を配置することができました。この研究は科学研究に大きな可能性を提供し、後に活動電位発生1,2,3,4,5,6,7,8のイオン基盤を研究するために使用された電圧クランプモードの作成に至りました。何年にもわたって、技術は改善され、科学研究に広く適用されるようになりました6,9。Erwin NeherとBert Sakmannによって開始された研究を通じて1970年代後半に行われたパッチクランプ技術の発明により、研究者は単一の電極のみを使用して、ほぼすべてのタイプの細胞における単一のイオンチャネルと細胞内膜電位または電流を記録することができました9,10,11,12.パッチクランプ記録は、培養細胞または組織スライスなどの様々な組織調製物に対して、電圧クランプモード(例えば、電圧依存性電流およびシナプス電流の記録を可能にする)または電流クランプモード(例えば、イオン電流によって誘発される休止膜電位の変化の記録を可能にする)のいずれかで行うことができる。 活動電位、およびシナプス後電位頻度)。
パッチクランプ技術の使用は、いくつかの注目すべき発見を可能にしました。実際、視床下部のキスペプチンニューロンは、第3脳室の吻側脳室周囲領域(RP3V)としても知られる前腹側脳室周囲および吻側脳室周囲核(AVPV/PeNKisspeptin)および視床下部の弓状核(ARHキスペプチン)に位置する視床下部キスペプチンニューロンの電気生理学的特性に関する独創的な発見13,14,15特に興味深いものです。2010年、Ducretらは、別の電気生理学的ツールであるルーズセルパッチクランプ技術を使用して、マウスのAVPV / PeNキスペプチンニューロンの最初の記録を行いました。これらの研究は、AVPV/PeNキスペプチンニューロンの電気的記述を提供し、それらの発火パターンが発情周期依存性であることを示しました16。2011年、Qiuらは全細胞パッチクランプ技術を用いて、ARHキスペプチンニューロンが内因性ペースメーカー電流を発現することを実証した17。続いて、Gottschらは、キスペプチンニューロンが自発的な活動を示し、h型(ペースメーカー)およびT型カルシウム電流の両方を発現することを示し、ARHキスペプチンニューロンが他の中枢神経系ペースメーカーニューロンと電気生理学的特性を共有することを示唆している18。さらに、ARHキスペプチンニューロンは性的に二形性の発火率を示し、AVPV / PeNキスペプチンニューロンはATP感受性カリウムチャネル(KATP)の影響を受ける二峰性の静止膜電位(RMP)を示すことが実証されています19,20。さらに、性腺ステロイドがマウスのキスペプチンニューロンの自発的な電気的活動にプラスの影響を与えることが確立された19,20,21。キスペプチンニューロンの電気生理学的特性を研究した最初の作品は、16,17,18,19,20に言及されています。それ以来、多くの研究が全細胞パッチクランプ技術を使用して、キスペプチンニューロンの電気的活動を調節するのにどの因子/神経調節物質が十分であるかを実証してきました(図1)17、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31,32。
本稿では、再生に必要な神経細胞の研究におけるこの技術の重要性を踏まえ、本稿では、溶液の調製、脳の解剖とスライス、記録のための細胞膜の封印など、全細胞パッチクランプ技術の開発のための基本的な手順について説明します。さらに、その利点、技術的な限界、最適な実験性能のために制御しなければならない重要な変数など、この技術に関する関連する問題が議論されています。

<table><tbody><tr><td>aCSF、内部およびスライス溶液用コンパウンド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich/各種</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich/</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich/</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K-グルコン酸</td><td>Σ ΣAldrich/</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Σ Aldrich/</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>シグマ・アルドリッチ/各種</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ・アルドリッチ/各種</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ/</td><td>各種 S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<サブ>3</サブ></td><td>シグマ アルドリッチ/各種</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>硝酸</td><td>シグマ アルドリッチ/各種</td><td>225711</td><td>コーション</td></tr><tr>ショ<td>糖</td><td>シグマ アルドリッチ/各種</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>イク</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エアテーブル</td><td>TMC</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>アンプ</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Various-DIGIDATA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td>デジタル蠕動ポンプ</td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>イメージングカメラ</td><td>ライカ</td><td>DFC 365 FX マイクロ</td><td></td></tr><tr><td>マニピュレーター</td><td>サッター機器</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>成重</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>オステオトーム</td><td>ボンター equipamentos &Tecnologia/various</td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>リカバリーチャンバー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ/ハーバード・イスプ</td><td></td><td></td></tr>ラー・イスプター・インストゥルメンツ <tr><td>レコーディング</td><td>・チャンバー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td> 640277 <td></td></tr><tr><td>スパチュラ</td><td>・フィッシャー・サイエンティフィック/various</td><td>FISH-14-375-10;FISH-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック/各種</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアとシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10ソフトウェア</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Commander</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>LAS X広視野システム</td><td>Leica-Image</td><td></td> <td>acquisition and analysis</td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Commanderソフトウェア</td></tr><tr><td>PCLAMP 10 WINDOWS用ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td>Pclamp 10 Standard</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl 電極、ペレット、1.0 mm</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>湾曲止血鉗子</td><td>様々</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>LOCTITE/various</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>斬首ハサミ</td><td>各種</td><td>・</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>各種</td><td>・</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー(マイクロピペット)</td><td>ワールド・プレシジョンズ・インク</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>アイリスハサミ</td><td>ボンサー・イクイパメントス &Tecnologia/various</td><td>65-66</td><td></td></tr><tr><td>パスツールガラスピペット&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ/各種</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr>-<tr><td>ポリエチレンチューブ&nbsp;</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>脳解剖用カミソリ刃</td><td>テッドペラ</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr>ビ<tr><td>ブラトーム用カミソリ刃</td><td>テッドペラ</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr>は<tr><td>さみ</td><td>ボンサーequipamentos&;Tecnologia/various</td><td>71-72, 48,49;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シリコーン乳頭</td><td>各種</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>スライスアンカー&nbsp;</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td>メル<td>クミリポア株式会社</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0.22 &mu;m</td></tr><tr><td>ピンセットボン</td><td>ターequipamentos&技術/各種</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

キスペプチンは、視床下部-下垂体-性腺(HPG)軸の成熟と生殖能力に不可欠です。視床下部のキスペプチンニューロンは、視床下部の弓状核と同様に、前腹側脳室周囲核および吻側脳室周囲核に位置し、他の細胞の中でもとりわけゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ニューロンに投射する。以前の研究では、キスペプチンシグナル伝達がKiss1受容体(Kiss1r)を介して発生し、最終的にGnRHニューロン活性を刺激することが示されています。ヒトおよび実験動物モデルでは、キスペプチンはGnRH分泌を誘導するのに十分であり、その結果、黄体形成ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)の放出を誘導するのに十分である。キスペプチンは生殖機能に不可欠な役割を果たすため、視床下部キスペプチンニューロンの固有の活動が生殖関連の行動にどのように寄与するかを評価し、これらの特性を変化させることができる主要な神経伝達物質/神経調節物質を特定するために取り組んでいます。全細胞パッチクランプ技術は、げっ歯類細胞におけるキスペプチンニューロン活性を調査するための貴重なツールとなっています。この実験技術により、研究者は自発的な興奮性および抑制性のイオン電流、静止膜電位、活動電位の発火、および細胞膜の他の電気生理学的特性を記録および測定できます。本研究では、視床下部キスペプチンニューロンを定義する電気生理学的測定として知られる全細胞パッチクランプ法の重要な側面と、その技術に関する関連する問題の議論をレビューします。

視床下部キスペプチンニューロンの活動に対するヒト組換え成長ホルモン(hGH)の可能な影響を研究するために、脳スライスで全細胞パッチクランプ記録を行い、このホルモンがAVPV / PeNキスペプチンおよびARHキスペプチンニューロンの活性に急性変化を引き起こすかどうかを評価しました。この研究では、成体のKiss1-Cre / GFP雌(発情期)および雄マウス36を使用しました。視床下部キスペプチンニューロンの特性は性ステロイドレベル19,20によって異なる可能性があるため、生殖腺無傷の動物を実験用に選択しました。男女間の違いを評価することは本研究の範囲を超えていましたが、詳細についてはCroftらおよびFrazãoら19,20を参照してください。マウスやラットなどの遺伝子改変動物は、特定の遺伝子または選択的誘導アブレ...

ここでは、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)細胞の主要なモジュレーターであるキスペプチンニューロンを含む脳スライスに対して全細胞パッチクランプを実行するためのプロトコルを提示します。キスペプチンニューロンの活動に関する知識を加えることにより、この電気生理学的ツールは、過去20年間に神経内分泌学分野の重要な進歩の基礎として機能してきました。

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

細胞膜の電気生理学的特性を測定することによって、細胞の電気的活動を調節することが主な証明の問題は解決され得る。全細胞パッチクランプ記録は、個々の細胞内のイオン電流を研究し、さまざまな刺激に対する細胞応答を調べるための周辺技術です。全細胞パッチクランプの事前記録で最高のパフォーマンスは、多くの練習と勉強の後に達成されます。脳解剖を開始するには、斬首された動物の頭蓋骨の上部にある皮膚を尾側から吻側まで外科用ハサミを使用して切開し、頭皮を取り除きます。次に、虹彩ハサミで矢状縫合糸に沿って頭頂間プレートを切り、後頭骨を取り除きます。骨切りを頭頂骨の下にスライドさせ、脳が露出するまでゆっくりと引き出します。脳を露出させた後、頭を逆さまにします。脳をゆっくりと下げて、両側の三叉神経を視覚化します。次に、カストロビエホ湾曲ハサミを使用して三叉神経を切断します。視床下部を視覚化した後、視神経を識別し、それを穏やかに切断します。次に、前頭葉の前部を切断します。脳を取り除き、スライスが得られるまですぐにスライス溶液に浸します。脳サンプルをスライスするには、脳をろ紙の上に置き、余分な溶液を乾燥させます。次に、鋭利な切断かみそりの刃で冠状切断を行い、小脳のある脳幹を残りの組織から分離します。次に、脳のコードル部分をビブラトームの基部に接着し、0〜2°Cに冷却したスライス溶液またはaCSF溶液でスライスデバイスチャンバーを満たします。バイブラトームチャンバーの周りにドライアイスを詰めて、手順中にスライス溶液を冷たく保ちます。かみそりの刃をビブラトームに挿入し、速度などのデバイスの切断パラメーターを3、周波数を9、フィードを250マイクロメートルに設定します。組織スライス手順の間、アクリルトランスファーピペットを使用してスライスを回収チャンバーに移し、スライス取得後の組織回収を60分間待ちます。細胞のシーリングと記録を開始する前に、顕微鏡、アンプ、デジタイザー、マイクロマニピュレーターの電源を入れます。aCSF溶液で顕微鏡に取り付けられた記録チャンバーを構築します。灌流ポンプを使用して、毎分2ミリリットルでaCSFを常に灌流します。ソフトウェアの設定を確認し、実験の種類に応じて記録用の特定のプロトコルを作成します。目的の脳スライスを一度に1つずつアクリルトランスファーピペットを使用して記録チャンバーに移します。aCSF灌流中にスライスが動かないように、スライスアンカーでスライスを保持します。スライスを記録チャンバーの中央に、液浸顕微鏡の低倍率対物レンズ(10倍または20倍)で配置します。スライス位置は、顕微鏡下で目的の領域をよく見ることができ、記録マイクロピペットに完全に届くようにするために重要です。関心領域を特定した後、対物レンズを高倍率レンズに切り替え、63X組織レベルに焦点を合わせて、標的領域内の内因性蛍光タンパク質および細胞の形状を観察し、脳スライスの表面にキスペプチン細胞を配置した。可能なターゲットセルが見つかったら、マウスカーソルを使用するか、関心のある領域に正方形のようなフォーマットを描画して、コンピューター画面でマークします。コンピュータのスクリーンマークは、記録ピペットの位置をセルに導くのに役立ちます。ターゲットセルの正確な位置を決定したら、対物レンズを持ち上げ、内部溶液で満たされた記録マイクロピペットを電極ホルダーに導入し、内部溶液が銀電極に接触していることを確認します。破片がマイクロピペットに入るのを防ぐために、ポリエチレンチューブを介してマイクロピペットホルダーに接続された1〜3ミリリットルの空気充填シリンジを使用して、マイクロピペットをaCSF溶液に浸す前に陽圧をかけます。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを対物レンズの中心より下に導きます。マイクロマニピュレータのボタンを動かして、マイクロピペットのXYZ軸を目的の細胞に導きます。焦点を調整してマイクロピペットの先端を確認し、焦点を近づけますが、スライスに近づきすぎないようにします。マイクロマニピュレーターの速度を下げ、マイクロピペットをゆっくりと焦点の合ったプレーンまで下げて、マイクロピペットの先端がスライスに突然浸透せず、細胞の表面またはターゲット領域に触れるまでゆっくりと下降するようにします。1〜3ミリリットルの空気充填シリンジで軽い陽圧を適用して、アプローチパスから破片を取り除きます。マイクロマニピュレーターをXYZ軸上でゆっくりと動かし、マイクロピペットチップを近づけ、ターゲット細胞に触れると、加えられた圧力によってディンプルが発生します。ソフトウェアの電圧クランプモードを使用してディンプルを確立した後、マイクロピペットホルダーに接続されたチューブを通して1〜2秒間口から弱い短時間吸引を適用し、マイクロピペットとセルの間のシールを生成します。シールがノイズ干渉なしに約1分間機械的に安定している場合は、保持電圧を目的の細胞の最も近い生理学的静止電位に設定します。キスペプチンの場合、視床下部ニューロンマイナス50ミリボルトが推奨されます。次に、破裂した膜がマイクロピペットを詰まらせたり、かなりの膜部分または細胞を引き付けたりしないように、細胞に密封されたマイクロピペット先端で原形質膜を破壊するために口から短時間吸引を適用します。十分な力で吸引を行うことにより、適切な全セル構成を実現できます。使用しているシステム設定マニュアルを確認してください。細胞膜を破壊した後、電圧クランプモードでセル全体オプションを有効にし、セル全体タブを参照する自動コマンドをクリックします。セルの直列抵抗とセル全体の静電容量は自動的に計算され、ソフトウェアによって即座に表示されます。次に、テキスト原稿に記載されているように、ソフトウェアで細胞生存率パラメータを確認します。実験中に直列抵抗とセル定常状態の容量を監視します。セル全体の構成が適切に達成されたら、電圧クランプモードでシナプス電流を測定します。現在のクランプモードでの静止膜電位の変化と誘導静止膜電位変動を記録します。視床下部キスペプチンニューロンの活性に対するヒト組換え成長ホルモンの可能な効果を、全細胞パッチクランプ記録の助けを借りて研究した。ヒト組換え成長ホルモンHGHをグラム当たり20マイクログラムで投与すると、12個のAVPV / PeNキスペプチンニューロンのうち5個および記録された14個のARHキスペプチンニューロンのうち9個において休止膜電位の有意な過分極が誘導された。AVPV/PeNキスペプチンおよびARHキスペプチン過分極ニューロンは、非応答細胞と比較して静止膜電位を有意に変化させた。HGH適用中の静止膜電位への影響は、AVPV / PeNキスペプチンニューロンで約0.9〜0.7ギガオーム、ARHキスペプチンニューロンで1.7〜1.0ギガオームの全細胞入力抵抗の有意な減少に続きました。.慎重なギガシールを介して実行される完璧な脳線と、ビーチパラメータを介したセルの領域の間に、最高の全細胞記録を達成するために必要です。記録された細胞のマイクロピペット溶液を回収し、シングルセルRTPCRに使用し、単離された細胞の分子特性評価を可能にします。遺伝子組み換え動物の使用と組み合わせた全細胞パッチクランプ技術は、キスペプチンニューロンの定義を可能にする生殖の理解におけるブレークスルーを表し、特性を増加させ、それらは主要なモジュレーターです。

hypothalamic-kisspeptin-neurons-as-target-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

このビデオは、全細胞パッチ電流クランプを使用して、蛍光タンパク質を発現するニューロン細胞の興奮性を研究する方法を示しています。電流クランプモードでは、ニューロンの興奮性を示す活動電位が生成されます。...

全細胞パッチクランプを用いた蛍光ニューロンの興奮性の研究

このビデオは、トランスフェクションされたマウス海馬の脳スライスにおけるシナプス相互作用とニューロン応答を研究するためのプロトコルを示しています。これには、長距離の感覚ニューロンを照射して活動電位をトリガーし、全細胞パッチクランプ技術を使用して記録されたニューロンに結果として生じる興奮性シナプス後電位を記録することが含まれます。...

マウス海馬切片におけるニューロンの光刺激および全細胞パッチクランプ記録

このビデオは、トランスフェクションされたマウス視床下部スライスからのキスペプチンニューロンの応答を測定するための全細胞パッチクランプ技術の使用を示しています。このプロセスでは、全細胞構成を達成し、電流クランプモードを使用して試験ホルモンによって誘発される膜電位変化を記録します。...

全細胞パッチクランプを用いたキスペプチンニューロンに対する成長ホルモンの試験効果の決定

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。...

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

プロトコルビデオは、マウスの鋤鼻器官(VNO)の感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立について説明しています。蛍光標識された感覚ニューロンを備えた冠状VNOスライスを記録セットアップに配置します。標識されたニューロンは、化学刺激に応答して電気生理学的記録のために、全細胞構成の記録ピペットでパッチされます。...

鋤鼻感覚ニューロンからの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。...

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

ここでは、電気生理学的記録のためのマウスの網膜の暗順応のスライスを生成するための手順を説明します。...

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

学ぶ全細胞パッチクランプ法による視床下部キスペプチンニューロンの電気生理学的記録。脳切片を用いてイオン電流を測定し、生殖神経内分泌学の理解を深める実験手法です。

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

さらに動画を探す