Name: ミニブタにおける硬膜下軟性皮質電図(ECoG)アレイ移植と長期皮質記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶミニブタにおける軟性硬膜下ECoGアレイの移植手術と長期皮質記録法。神経モニタリング、生体内・生体外イメージング、電気化学評価を含む再現性のある手法で、神経プロステティクス開発と大規模皮質ネットワーク活動の理解に貢献する。

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著者らは、Bertarelli FoundationおよびSNSF Sinergia助成金CRSII5_183519からの財政的支援に感謝します。著者らはまた、組織学の染色プロトコルの開発に協力してくれたEPFLのKatia Galan氏、製造プロセスを支援してくれたジュネーブのWyss Center for Bio and NeuroengineeringのNeural Microsystems Platformのスタッフ、動物のケアに協力してくれたジュネーブ大学大学医療センター(CMU)の動物プラットフォームのスタッフ、 ミニブタの外科的支援、術後管理(John Diaper、Xavier Belin、Fabienne Fontao、Walid Habre)、ジュネーブ大学の生物医学イメージングセンター(CIBM)のチームメンバー(Julien Songeon、François Lazeyras、Rares Salomir)、ジュネーブ大学病院(HUG)の病理科のスタッフ(Sami Schranz、Francesca Versili、 Ruben Soto、Coraline Egger)、およびグルノーブル・アルプ大学のBlaise Yvert氏には、慢性ミニブタの実験に関する意見と意見交換をいただきました。著者らは、Neurosoft Bioelectronics SAの従業員(Benoit Huguet氏とMargaux Roulet氏)の製作プロセスへの協力とミニブタの実験への協力に感謝したい。

<ol><li>Ritaccio, A. L., Brunner, P., Schalk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+mapping+of+the+brain%3A+Basic+principles+and+emerging+alternatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation mapping of the brain: Basic principles and emerging alternatives.</a> Journal of Clinical Neurophysiology. 35 (2), 86-97 (2018).</li>
<li>Mullin, J. P., Sexton, D., Al-Omar, S., Bingaman, W., Gonzalez-Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+subdural+grid+electrode+monitoring+in+the+stereoelectroencephalography+era%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Outcomes of subdural grid electrode monitoring in the stereoelectroencephalography era.</a> World Neurosurgery. 89, 255-258 (2016).</li>
<li>Vansteensel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+implanted+brain-computer+interface+in+a+locked-in+patient+with+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fully implanted brain-computer interface in a locked-in patient with ALS.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (21), 2060-2066 (2016).</li>
<li>Lacour, S. P., Courtine, G., Guck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+and+technologies+for+soft+implantable+neuroprostheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Materilas%22%5BJournal%5D)">Materials and technologies for soft implantable neuroprostheses.</a> Nature Reviews. Materilas. 1, 16063(2016).</li>
<li>Fallegger, F., Schiavone, G., Lacour, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformable+hybrid+systems+for+implantable+bioelectronic+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Conformable hybrid systems for implantable bioelectronic interfaces.</a> Advanced Materials. 32 (15), 1903904(2019).</li>
<li>Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+implant+biomaterial+research+in+bone%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Animal models for implant biomaterial research in bone: A review.</a> European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).</li>
<li>Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+as+models+in+biomedical+research+and+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Swine as models in biomedical research and toxicology testing.</a> Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).</li>
<li>Khoshnevis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+induced+glioblastoma+by+implantation+of+a+human+xenograft+in+Yucatan+minipig+as+a+large+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of induced glioblastoma by implantation of a human xenograft in Yucatan minipig as a large animal model.</a> Journal of Neuroscience Methods. 282, 61-68 (2017).</li>
<li>Borton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+implantable+neuroprosthetics%3A+A+new+model+in+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+%26+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Developing implantable neuroprosthetics: A new model in pig.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society. 2011, 3024-3030 (2011).</li>
<li>Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pig+model+in+brain+imaging+and+neurosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">The pig model in brain imaging and neurosurgery.</a> Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).</li>
<li>Gierthmuehlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+mECoG+electrode+arrays+in+the+minipig%3A+Experimental+procedure+and+neurosurgical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of mECoG electrode arrays in the minipig: Experimental procedure and neurosurgical approach.</a> Journal of Neuroscience Methods. 202 (1), 77-86 (2011).</li>
<li>Palma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+recording+of+cortical+activity+underlying+vocalization+in+awake+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs.</a> Journal of Neuroscience Methods. 366, 109427(2022).</li>
<li>Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telencephalon+of+the+G%C3%B6ttingen+minipig%2C+cytoarchitecture+and+cortical+surface+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy.</a> Brain Structure & Function. 222 (5), 2093-2114 (2017).</li>
<li>Lind, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pigs+in+neuroscience%3A+Modeling+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).</li>
<li>Shepherd, R. K., Villalobos, J., Burns, O., Nayagam, D. A. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stimulators%3A+A+review+of+preclinical+safety+and+efficacy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">The development of neural stimulators: A review of preclinical safety and efficacy studies.</a> Journal of Neural Engineering. 15 (4), 041004(2018).</li>
<li>Schiavone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft%2C+implantable+bioelectronic+interfaces+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Matererials%22%5BJournal%5D)">Soft, implantable bioelectronic interfaces for translational research.</a> Advanced Matererials. 32 (17), 1906512(2020).</li>
<li>Fallegger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-compatible+and+conformal+electrocorticography+grids+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">MRI-compatible and conformal electrocorticography grids for translational research.</a> Advanced Science. 8 (9), 2003761(2021).</li>
<li>Minev, I. R., Wenger, N., Courtine, G., Lacour, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+update%3A+Platinum-elastomer+mesocomposite+as+neural+electrode+coating%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Materials%22%5BJournal%5D)">Research update: Platinum-elastomer mesocomposite as neural electrode coating.</a> APL Materials. 3 (1), 014701(2015).</li>
<li>Schiavone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+to+study+and+develop+soft+electrode+systems+for+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Guidelines to study and develop soft electrode systems for neural stimulation.</a> Neuron. 108 (2), 238-258 (2020).</li>
<li>Musigazi, G. U., De Vleeschauwer, S., Sciot, R., Verbeken, E., Depreitere, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+perfusion+fixation+in+male+pigs+using+a+safer+closed+system%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Brain perfusion fixation in male pigs using a safer closed system.</a> Laboratory Animals. 52 (4), 413-417 (2018).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
</ol>

F.F.とS.P.L.は、軟質電極アレイを開発するNeurosoft Bioelectronics SAの共同設立者兼株主です。

本稿では、ソフトECoGアレイの長期移植と評価法について報告する。本研究では、側頭葉(ここでは聴覚皮質を標的とする)に機能的電極グリッドを両側に移植するための一貫した低侵襲手術アプローチを設計した。まず、研究の期間(6か月)にわたって誘発電位を記録し、電極の電気化学的特性を追跡することで、グリッドの機能を評価しました( 図6を参照)。第二に、MRIを用いてMRIに完全対応システムを確立し、組織採取と免疫染色のプロトコルを設計して死後分析 を行い、グリッド のバイオセーフティを評価しました。
侵襲性を最小限に抑えるために、開頭窓のサイズを最適化しました。側頭葉に位置する聴覚野に到達し、側頭筋の切除を避けるために、硬膜の下にインプラントをスライドさせる技術を開発しました。この技術により、露出した脳の表面を大幅に縮小し、遠くのターゲットに到達することができます。このタイプの移植は盲目に見えるかもしれませんが、術中の平面X線で視覚化されるデバイスにX線不透過性マーカーを実装することで、位置の検証が可能になり、アレイが硬膜の下で折りたたまれないようにすることができます。硬膜下スライドは、私たちが行ったほとんどの反復で安全であることが証明されています。さらに、スリットアプローチでの硬膜切開術は、開頭術が開いている間の脳の膨らみを最小限に抑え、炎症反応に偏りを与える可能性のある人工硬膜などの追加材料を必要とせずに、インプラントの周囲の閉鎖を容易にします。最後に、この外科的アプローチの強みは、異なる皮質領域に転位する能力です。座標、開頭位置、デバイスサイズなど、すべて調整可能な方法で遊ぶことで、この方法は皮質領域のほとんどをターゲットにすることができます。
ここで紹介する手術方法は、機能評価と経時的な生体統合の調査とともに、このレポートで使用されている軟電極技術に限定されません。ヒト翻訳用に開発されている他の硬膜下電極は、同じプロトコルで評価できます。この方法の強みは、ケーブルや台座などのほとんどの部品がモジュール式でパーソナライズ可能であり、テスト対象の特定のデバイスに適合できるという事実に依存しています。さらに、皮質内または深部貫通プローブは、開頭術と硬膜切開術の形状を調整するだけで済むため、硬膜下電極の代わりに、または硬膜下電極と組み合わせて使用することもできます。長期的な結果は、ここで行ったように、臨床の結果と比較することができます。
提示された方法の主な制限の1つは、最初の12年の間に発達するミニブタの頭蓋骨洞の存在です。その点で、考慮すべき重要な側面には、着床の年齢と動物の大きさが含まれます。成人の頭蓋骨に開頭手術を行うと、副鼻腔の完全性が損なわれ、慢性的な状況では大きな感染症のリスクが高くなります。このような副鼻腔は、術前の平面X線およびCTスキャンで見ることができます。一方、小さすぎる動物に慢性的な着床を早すぎると、頭蓋骨が大規模な成長とリモデリングを受けているときにも最適ではありません。私たちは、手術後のこれらの「頭蓋骨の動き」がインプラントを動かして折りたたむ原因となり、最終的に実験に悪影響を与える可能性があるという仮説を立てました。ここでは、着床時に生後約5〜6か月(および8 kg)のゲッティンゲンミニブタが最良の結果をもたらす必要があることがわかりました。
電気生理学的記録のための移植されたECoGの性能を評価するために、私たちは、自由に動く動物や鎮静下で使用できる聴覚誘発電位(AEP)記録の迅速なプロトコルを設定しました。これは、数分の間に特定の周波数で一連のアコースティックトーンバーストを提示することで構成されます。このようなプロトコルの利点は、プローブする周波数の数を減らすことによって、利用可能な記録の長さに調整できるという事実です。麻酔下で皮質信号を記録する際の課題の1つは、データを分析および比較する際に動物の意識レベルを考慮する必要があることです。
灌流のプロトコルは、抽出された脳の質を観察することにより、経時的に調整されました。実際、頸動脈のみにカテーテルを挿入し、頸静脈にはカテーテル挿入しない方が簡単であることがわかりました。最初に、文献は、頸静脈が老廃物を排出するためにカテーテル挿入される方法を提示している20。実際には、これは脳からの流出を制限し、血液の抽出と灌流の全体的な質の低下につながります。頸静脈を切断し、動物が横たわっている大きな容器に液体を逃がすことにより、灌流の効率が高まります。
私たちは、炎症追跡に日常的に使用される抗体で機能する堅牢な組織調製法を開発しました。ブタの脳の半分は標準的な顕微鏡スライドに収まるため、組織学ラボで入手可能なほとんどのイメージング機器と互換性があるため、実用的な理由から2つの半球を分離しました。脳をブロック状に切断することで、脳全体をさらに切断したり、組織の広範な部分をトリミングしたりすることなく、関心のある領域に直接アクセスできるようになります。40 μmの脳スライスは、標準的なウェルプレートにプールし、他の種の免疫染色によるプロトコルの大きな変更なしに、自由に浮遊する方法で染色することができます。全脳免疫染色は、例えば、CLARITY法21を用いても考えられる。
全体として、このプロトコルは、パーソナライズされたインプラント設計から移植、機能フォローアップ、およびバイオセーフティ評価までをカバーし、堅牢で一貫性があります。ここでは、聴覚系を研究する可能性を示しましたが、他の生理学的機能をテストするために置き換えることができます。さらに、私たちの方法の強みは、ミニブタに限定されず、ヒツジ、ヤギ、または人間以外の霊長類などの他の種に完全に転用可能であるという事実にあります。ある程度、ラットにも簡単に適応できます。

神経学的障害および疾患は、皮質電図検査(ECoG)アレイを使用して診断または治療することができる。これらの電極グリッドは、脳の表面に埋め込まれ、ヒト皮質1の記録または刺激を可能にする。例えば、薬剤耐性てんかんの場合、てんかん領域を切除するのに役立っています2。ブレイン・コンピュータ・インターフェースなどの長期的な用途では、これらの皮質電極は、脳の運動意図を記録し、麻痺患者のロボット手足を制御するために使用されます3。しかし、現在の電極グリッドは、硬質のポリマー基板に埋め込まれた硬い金属ブロックから作られており、高解像度の脳記録や長期の硬膜下生体統合(>30日)の必要性に応えていません。むしろ、それらは局所的な組織反応を引き起こし、埋め込まれたデバイスの線維化カプセル化を引き起こし、時間の経過とともに性能の低下につながります。近年、微細加工技術によって製造された薄い高分子基板を用いた可撓性または伸縮性電極アレイが提案されており、組織反応を制限することにより、長期間の移植において高い性能を達成することが提案されている4,5。しかし、これらの新しいインプラント技術の前臨床試験は、その長期的な機能性と安全性プロファイルを検証し、ヒト患者への応用を想定するために必要です。これに関連して、ミニブタとブタのモデルは、臓器のサイズが大きく、動物の取り扱いが容易なため、他の医療状況(心血管系、骨格系、胃系など)のデバイス開発に日常的に採用されています6,7,8。しかし、神経生理学のために脳を標的とするアプリケーションはごくわずかであり、主に外科的アプローチの制限と生きている動物へのインプラントシステムの統合が原因です9,10,11,12。これらは、例えば、埋め込み型組み込み電子機器などの複雑なハードウェアの開発を必要とするため、生きている動物への慢性的な移植とは互換性がないことがよくあります。さらに、トランスレーショナルスタディにおけるバイオセーフティの側面にとって重要な標的組織に対するインプラントシステムの影響は調査されていません。ブタのモデルは、皮質構造、頭蓋骨、皮膚の厚さの点で人体の解剖学的構造に近い13。さらに、行動課題を学習する能力は、機能的リハビリテーション戦略や感覚知覚を調査するための強力なモデルとなります14。
新しい技術や治療法を人間に応用するには、管轄の医療当局の要求に応じて、安全性と有効性を評価する必要があります。これらは通常、技術文書および基準15に記載されていますが、これらのテストに合格するだけであり、安全性試験と並行してデバイスの埋め込みやその他の有用なデータの収集の実際の効果を調査するものではありません。脳の完全なバイオセーフティとパフォーマンス研究のために、ここでは、脳画像データ、電気生理学的測定、埋め込まれた電極の電気化学的特性の評価、およびブタモデルにおける死後組織学の縦断的かつ体系的なコレクションを紹介します。これを達成するためには、完全な実験モデルを作成するために、いくつかの側面を考慮する必要があります:(i)電極に接続するための機械的に安定した経皮ポートとともに、デバイス埋め込みのための低侵襲外科的アクセス、(ii)麻酔下および自由に動く条件の両方で、埋め込まれた電極の性能出力として機能する堅牢な電気生理学的記録パラダイム、 (iii)脳とインプラントの進化、およびインプラントとイメージング装置との適合性を追跡するためのさまざまな時点での in vivo イメージング(コンピューター断層撮影[CT]および/または磁気共鳴画像法[MRI])、および(iv)組織学的分析のために脳を抽出するための組織調製パイプライン。
本稿では、ミニピッグモデルにおける長期移植(6ヶ月)の方法とソフトECoGアレイの評価について報告する(図1に模式的に示す)。軟質電極アレイは、以前のレポートで紹介したもので、電気トラックとして使用される弾性金薄膜を埋め込んだ薄いシリコーン膜で作られています16,17。組織との接触は、脳組織18への柔らかく効率的な電気化学的界面のためにシリコーンマトリックスに埋め込まれた白金ナノ粒子の混合物を介して行われる。インプラントは、頭蓋骨と皮膚を貫通して硬膜下トンネルを敷設された柔軟なケーブルを介して、動物の頭部のコネクターを収容する経皮ポートに接続されます。インプラントのサイズと形状は、研究のターゲットとニーズに応じてカスタマイズできます。この研究の現在の電極ストリップは、臨床ストリップの実際のサイズを反映しています。臨床的に利用可能な硬膜下ストリップおよびグリッドを、同じアプローチを用いてコンパレータとして使用した。ポリマーMRI対応経皮ポートは、頭蓋骨にしっかりと固定するフットプレートシステムを使用して頭蓋骨に配置されます。ここでは、両半球の硬膜下移植から動物の回復までの外科的処置について詳しく説明します。ここでは、聴覚野を標的領域として、麻酔状態と自由に動く状態の両方で音響刺激によって誘発電位が誘導される場所に焦点を当てています。さまざまな時点で、麻酔下で動物の脳をMRI(または臨床電極の場合はCT)で画像化し、電極の電気化学的特性を測定します。電極の特性評価法は、インプラントと電極-組織界面の進化を追跡するために使用されます(詳細については、Schiavone et al.19を参照)。これらには、電極接点の刺激能力を調べるクロノアンペロメトリー、電極の抵抗成分と容量成分の変化を示すことができる電気化学インピーダンス分光法(EIS)、および気密封止の故障を調査するためのチャネル間抵抗測定が含まれます。最後に、安楽死後の脳を灌流し、電極を装着した状態で摘出し、切片化し、さまざまな炎症マーカーを用いて組織学的解析を行うための組織抽出パイプラインを開発しました。全体として、この方法は、脳に関する新しい技術や治療法の将来の臨床翻訳のための堅牢なマルチモーダルデータ収集による前臨床試験を可能にします。

<table><tbody><tr><td>ボーンドリル</td><td>BBraun</td><td>Elan 4 with&nbsp;GA861ハンドピース</td><td></td></tr><tr><td>ボーンドリルビット</td><td>BBraun</td><td>Neurocutter GP204R</td><td></td></tr><tr><td>Bonewax</td><td>Ethicon</td><td>W31G</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル</td><td>Venisystems</td><td>Abbocath 14G</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>ゲルフォーム</td><td>ファイザー</td><td>ゲルフォーム</td><td></td></tr><tr><td>スピーカーを挿入</td><td>語源</td><td>語源 ER2 挿入 イヤホン</td><td></td></tr><tr><td>マルチメーター</td><td>フルー</td><td>ク フルーク 1700</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>テクトロニクス</td><td>MDO3014 ミックスドドメイン オシロスコープ</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>深セン</td><td>LabS3/UD15</td><td></td></tr><tr><td>ポテンショスタット</td><td>ガムリー機器</td><td>リファレンス 600</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体抗GFAP</td><td>サーモフィッシャー</td><td>抗GFAP, ラット, # 13-0300</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体 抗Iba1</td><td>富士フイルム</td><td>抗IBA1, ウサギ, 019-19741</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体 抗NeuN</td><td>SigmaAldrich</td><td>抗NeuN, モルモット, ABN90</td><td></td></tr><tr><td>パルス発生器</td><td>AMシステム</td><td>モデル2100 分離パルス刺激装置</td><td></td></tr><tr><td>ヘッドステージ記録</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>W2100-HS32</td><td></td></tr><tr><td>記録システム</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>W2100</td><td></td></tr><tr><td>ドライバー</td><td>メドトロニック</td><td>ハンドル:001201、シャフト:8001205</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体 488</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ヤギ 抗ラット IgG (H+L) 交差吸着型二次抗体、アレクサ フルーア 488、# A-11006</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体 555</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ヤギ抗モルモットIgG(H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 555、#A-21435</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体647</td><td>Thermofischer</td><td>ヤギ抗ウサギIgG(H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647、#A-21245</td><td></td></tr><tr><td>スライドスキャナー</td><td>Olympus</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>Snapfrost</td><td>Excilone</td><td>Excilone Snapfrost</td><td></td></tr><tr><td>Stab knife</td><td>FineScience Tools</td><td>10316-14</td><td></td></tr><tr><td>縫合線真皮</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 2-0</td><td></td></tr><tr><td>縫合線硬膜</td><td>Ethicon</td><td>Mersilk 5-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル用縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>Vycril 3-0 針</td><td></td>なし</tr><tr><td>硬膜を持ち上げるための縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>Prolene 6-0 BV-1針</td><td></td>付き</tr><tr><td>縫合線 皮下</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 4-0</td><td></td></tr><tr><td>チタンブリッジ</td><td>Medtronic</td><td>TiMesh 015-2001-4</td><td>必要なサイズを切り取ります</td></tr><tr><td>チタンネジ</td><td>メドトロニック</td><td>9001635、9001640</td><td></td></tr><tr><td>X線装置</td><td>GE</td><td>GE OEC 9800 Plus C-Arm</td><td></td></tr></tbody></table>

ミニブタにおける硬膜下軟性皮質電図(ecog)アレイ移植と長期皮質記録

Subdural Soft Electrocorticography (ECoG) Array Implantation and Long-Term Cortical Recording in Minipigs

神経学的障害および疾患は、皮質電図検査(ECoG)アレイを使用して診断または治療することができる。薬剤耐性てんかんでは、これらは切除するてんかん領域の輪郭を描くのに役立ちます。ブレイン・コンピュータ・インターフェースなどの長期的な用途では、これらの皮質上皮質電極は、脳の運動意図を記録し、麻痺患者のロボット手足を制御するために使用されます。しかし、現在の硬い電極グリッドでは、高解像度の脳記録や長期的なバイオインテグレーションの必要性に応えることはできません。近年、高性能で長期のインプラント安定性を実現するためのコンフォーマブル電極アレイが提案されています。しかし、これらの新しいインプラント技術の前臨床試験は、ヒト患者への転用に対する長期的な機能性と安全性プロファイルを検証するために必要です。これに関連して、ブタモデルは、臓器のサイズが大きく、動物の取り扱いが容易なため、医療機器の開発に日常的に使用されています。しかし、文献に記載されている脳への応用はごくわずかであり、そのほとんどは手術の制限と生きている動物へのインプラントシステムの統合によるものです。
本稿では、ミニブタモデルにおける長期(6ヶ月)の移植方法とソフトECoGアレイの評価について報告する。この研究では、まず、磁気共鳴画像法(MRI)と互換性のあるポリマー経皮ポートを統合した軟質微細加工電極アレイで構成されるインプラントシステムを紹介します。次に、硬膜下移植から動物の回復までの外科的処置について説明します。ここでは、聴覚刺激によって誘発電位が誘導される標的領域の例として、聴覚野に着目します。最後に、脳全体のMRI、インプラントの電気化学的特性評価、術中および自由に動く電気生理学、および抽出された脳の免疫組織化学染色を含むデータ取得シーケンスについて説明します。
このモデルは、皮質プロテーゼの新しいデザインの安全性と機能を調査するために使用できます。ヒト患者への翻訳を想定した必須の前臨床試験。

デバイスの配置(図3A)と機能を確認するために、台座の配置後に術中に電気生理学的記録が実行されます。ベースライン信号は、基礎活動の制御として、刺激なしで最初に2分間にわたって取得されます。第二に、動物は異なる周波数(500-20,000 Hz)でのトーンバーストで音響刺激を受け、生データは刺激期間にわたって平均化され、アレイ全体の聴覚誘発電位をマッピングします(たとえば、ベースラインと比較して800Hz; 図3B)。ここに示すデータは未処理ですが、ノイズが多すぎる場合は、ノッチフィルターとバンドパスフィルターを適用できます。手術室の典型的な騒音源には、加熱パッド、詰まったドリル、吸引器や焼灼器などがあり、取得前に取り外す必要があります。覚醒中の記録では、よりクリーンなデータセットのために、咀嚼などの頭の周りの大きな筋肉の動きを避ける必要があります。
このプロトコルはすべての記録時点で適用され、1つのチャンネルの信号を経時的に比較することができました。1つの例を 図3Cに示し、応答のロバスト性と変化を示しています。実験の経時的な経過に伴う各接触の記録能力は、各時点におけるベースライン信号の標準偏差を計算することによって評価できます(図3D)。この研究では、記録期間が限られているため(つまり、2分)、多少のばらつきはあるものの、S/N比は減少し、0日目から6か月目の間に落ち着きました。これは、電極インピーダンスとさらに相関させることができます。
in vivoイメージングは、脳の状態とインプラントの位置を評価するために術後に行われます。プロトコルの最初の反復では、術中X線は行われず、T1強調MRIシーケンスの図4Aに見られるように、折りたたまれたデバイスになりました(さらに図4Bを参照)。動物では行動の変化は観察されませんでしたが、時間の経過とともに、インプラント位置の周りの脳の巨視的圧迫により、デバイスの周囲に線維化カプセル化が見られました(図4C)。この経験の後、図4Dに示すように、術中X線が導入され、X線不透過性マーカー(挿入図4Dのインプラントに見える黒いバー)が適切に配置されていることが示されています。その後、図4Eの術後MRIで観察できるように、脳の表面は無傷です。全体として、このインプラントとペデスタルシステムにより、全脳イメージングが可能です。冠状面のさまざまな配列により、解剖学的構造を見ることができます(図4F、G;T1およびT2 MRIシーケンス)またはインプラント周囲の液体と血液の存在(図4H;TSE強調MRIシーケンス)。ペデスタルシステムは、チタンネジの周りのいくつかの小さな黒いコントラストの空洞を除いて、ほとんどアーチファクトを作成しません(図4Gを参照)。さらに、この研究では臨床用電極がコンパレータとして使用されていますが、加熱と安全性の懸念からMRIでは画像化できません。したがって、図4Iに示すように、これらの動物でCTスキャンが取得されます。電極ははっきりと見え、ペデスタルシステムは画質に影響を与えていません。
移植期間の後、動物は灌流され、脳が抽出されます。この研究では、炎症反応の分析は各半球で独立して行われます。脳を半分に切断すると、切片化前の組織調製が容易になり、切片を標準的な顕微鏡スライドに取り付けることができるという利点があります。脳サンプルの一例は、ブロックを切断する前(図5A)と切断後(図5B)を示しています。インプラントの輪郭がはっきりと見え、脳に小さなへこみができています。平行な平面で切断することにより、組織はすでにクライオスタットに位置合わせされており、トリミングのために組織を失うことなく切片を容易に切断できます(図5C)。染色後、組織切片全体が画像化され(図5D)、例えば、ニューロン層が詳細にはっきりと見えます(NeuNマーカーを参照)。切片全体が壊れやすく、組織がいくらか失われることもありますが( 図5Dの下部を参照)、関心領域は無傷です。40倍の共焦点顕微鏡イメージングにより、細胞が明確に定義され、炎症マーカーの精密な調査などが可能になります(図5E)。さらに定量化分析を行って、対照半球と移植半球の間の炎症を比較することができます。 図6 は、埋め込まれた電極の電気化学的特性評価を示しています。インピーダンス弾性率と位相を持つ軟電極アレイの In vitro 電気化学インピーダンス分光法を 図 6A に示し、注入から 6 か月間の 1 kHz でのインピーダンス係数を 図 6B に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig01.jpg"> 図1:実験の概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig02.jpg"> 図2:脳へのソフトECoGの低侵襲移植 。 (A)ブレグマの兆候を伴う頭蓋骨への外科的アクセス。(B)硬膜が見える両側開頭術。(C)第1半球のスリット硬膜切開術。(D)軟質ECoGの硬膜下移植と硬膜閉鎖。(E)第2半球のスリット硬膜切開術。チタンブリッジを使用した第1半球の骨皮弁固定。(F)第2半球への軟ECoGの移植と硬膜閉鎖。(g)第2半球の骨皮弁固定。(H)頭蓋骨上のフットプレートの位置。(I)フットプレートへの台座の固定。(J)台座基部の周りの皮膚閉鎖。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig03.jpg"> 図3:聴覚誘発電位の記録 。 (A)側頭葉表面の電極配置の模式図。(B)800 Hzのトーンバースト刺激(紫色のトレース)に応答するベースライン活動(灰色のトレース)と聴覚誘発電位の代表的なマッピング。各平均は、ソフト ECoG アレイの 1 つのチャネルに対応します。平均化は、音の刺激からのアナログ入力信号でトリガーされます。「ON」と「OFF」の音響刺激期間は、左下の1つのチャンネルに記録されています。(C)刺激が提示されていない場合のベースライン信号と比較した、音響刺激後の単一チャネル応答の経時的変化(0日目、2か月目、5か月目)。平均化は、音の刺激からのアナログ入力信号でトリガーされます。「ON」と「OFF」の刺激期間は下部に記載されています。「ON」刺激の誘発電位は矢印でマークされています。(D)ベースライン記録の時点ごとのチャンネル(色付きのドット)ごとの標準偏差。中央値は太字の青で表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig04.jpg"> 図4:脳と埋め込み電極のin vivoイメージング。 (A)冠状面の術後T1強調MRI。矢印は折り畳まれたインプラントを示します。(B)インプラントの折り畳みが脳にへこみを作るAの拡大部分。(C)1ヶ月の移植時のT1強調MRIで、Cと同じ位置に脳の線維化被覆による脳の圧迫が見られる。(D)術中平面X線検査で、インプラントの埋入と折り畳みなしを確認する X線不透過性マーカーの配置。挿入図:X線不透過性マーカーが見えるインプラントの写真。(E)最適なインプラント埋入を伴う冠状面での術後T1強調MRI。(F)1ヶ月の移植時のT1強調MRI。(G) 1 か月の移植時の T2 強調 MRI。矢印は、頭蓋骨のフットプレートを固定しているチタン製のネジからの画像アーチファクトを示しています。(H)1か月の移植時のTSE強調MRI。(i)臨床用電極を埋め込んだ動物のCTスキャン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig05.jpg"> 図5:長期移植後の脳の組織学的分析 。 (A)移植・灌流した脳左半球の写真。(B)凍結ステップの前にブロックに切断された灌流脳。(C)クライオスタットのブロック全体の切片化セットアップの写真。「プレカットブロック」全体を切断することができます。(D)全半球の免疫染色イメージング(スライドスキャナー、20倍対物レンズ)および(E)皮質の最初の層のズーム(共焦点イメージング、40倍対物レンズ)グリア細胞、アストロサイト、およびニューロンを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig06.jpg"> 図6:埋め込まれた電極の電気化学的特性評価 。 (A)インピーダンス弾性率(上)と位相(下)の軟質電極アレイ(各チャネルの小さな灰色の線、赤の平均)の in vitro 電気化学インピーダンス分光法。(B)移植後6ヶ月間の1 kHzでのインピーダンス弾性率の変化(青字は平均、灰色の線は個々のチャンネル、 in vitro 測定値は赤色で基準値)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:MRI対応ペデスタル。 (A)軟電極アレイにアクセスするための慢性MRI対応経皮接続システム(ペデスタル)。(B)頭蓋骨を固定するためのフットプレートに電極が取り付けられた台座。挿入図: フットプレートの詳細。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/FigS1_Pedestal.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:脳の最適な灌流のための外科的アクセス。 (A)皮膚の切断と頸動脈と頸静脈の位置へのアクセス。(B)血管周辺の組織の解剖。(C、D)頸動脈と頸静脈周辺の組織の同定と解剖。(E)頸動脈を下の組織から分離する。(F)頸静脈を下の組織から分離する。(g)頸動脈(縫合糸1および縫合糸2)および頸静脈(縫合糸3)の周囲に縫合線を配置する。(H)頸動脈の基部(心臓側)で縫合糸3を閉鎖し、血管を開く際の出血を防ぎます。(I) Hとは反対側の頸動脈をクランプする。(J)頸動脈の切片化。(k) Jから開口部にカテーテルを挿入した。挿入図:生理食塩水を注射器からカテーテル先端に流したプライミングカテーテル。(L)カテーテルを所定の位置に維持し、動脈に沿って縫合糸2を閉鎖する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/FigS2_Catheter.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:T1-(1-2ページ)、T2-(ページ(3-4)およびTSE重み付け(5-6ページ)のMRIシーケンスのパラメーター。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%201_MRIparameters.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:染色された脳スライスのスライド全体イメージングのためのスライドスキャナーのメタデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%202_Metadata%20Slide%20Scanner%20(1).pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:染色された脳スライスの拡大切片の共焦点イメージングのメタデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%203_Original%20Metadata%20-%20confocalsettings.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、ミニブタモデルにおける軟硬膜下電極アレイの長期的な性能と安全性を評価する方法を提示し、手術方法とツール、術後の磁気共鳴画像法、聴覚皮質の電気生理学、インプラントの電気化学的特性、および死後の免疫化学について説明します。

ミニブタにおける硬膜下軟性皮質電図(ECoG)アレイ移植と長期皮質記録

Neurological impairments and diseases can be diagnosed or treated using electrocorticography (ECoG) arrays. In drug-resistant epilepsy, these help ...

このモデルは、生体適合性、分解能、シグナル品質の観点から、慢性皮質デバイスの安全性と有効性を検証するための標準となる可能性があります。私たちの手順は、デバイスの安全性と有効性の長期的なフォローアップを実行するための再現性と拡張性のある方法を説明しています。これには、経時的な神経モニタリング、in vivoおよびex vivoイメージングが含まれます。私たちの方法は、感覚的および運動皮質神経プロテーゼの開発に役立ちます。これは、大規模な皮質ネットワークの活動を理解するためのツールです。この方法は、さまざまな皮質領域にわたる機能的接続を調査するために、基礎神経科学に使用できます。他の大型動物モデルにも適用できます。外科的アプローチにはある程度の練習が必要ですが、最初に死体や急性実験で習得することができます。そうすれば、測定はかなり簡単になります。まず、麻酔をかけた動物の皮膚をメスナイフで正中線に沿って切開します。ラスパトリーを使用して筋肉と骨膜を骨から分離し、最適なアクセスのためにスプレッダーを配置します。開頭術を行うには、X線で測定された頭蓋骨の厚さを考慮して、丸い切断ビットを備えた骨ドリルを使用して輪郭をドリルで開けます。骨の過熱を避けるために、掘削場所を生理食塩水で灌漑します。硬膜に達するまで、輪郭を均一に慎重にドリルで開けます。最初のブレークスルーでは、アウトラインがほぼ突き抜けるほど薄くなるまで穴あけを終了します。次に、平らなスパチュラを使用して、開頭術の縁をテコにして骨皮弁を1つに分解します。硬膜切開術を行うには、6オー縫合キットの針を使用して、開頭術の前端または後端、内側と外側の中間にある硬膜を慎重に突き刺して持ち上げ、スタブナイフで切開の始まりを作成します。次に、硬膜下腔に挿入された小さな平らなヘラを使用して、皮質を保護するための切断ベースとして機能します。両方のツールを同時に進めることにより、硬膜に前後スリットを作成します。スリットがインプラントの幅よりわずかに大きいことを確認してください。インプラントを硬膜スリットの上に置き、小さな鉗子で、各端を順番にスライドさせて硬膜下に挿入します。デバイスの台座の端を慎重に保持し、挿入を妨げる張力を発生させないようにインプラントを前進させます。コネクタの端がスリットの上に来たら、挿入を停止します。インプラントを所定の位置に固定するには、開頭術の端または固定翼のケーブルの上にチタン製のブリッジを配置し、適切なドライバーを使用して1本または2本のチタン製ネジで固定します。次に、インプラントケーブルの周囲に硬膜を慎重に縫合します。3オーの吸収性縫合糸と小さなニードルホルダーを使用して、縫合糸ワイヤーで薄い膜を引き裂くことなく、2つの硬膜の縁をできるだけ一緒にします。骨フラップの留置を行うには、チタン製のネジを使用して、各骨フラップの前部と後部にチタン製のブリッジを固定します。チタンブリッジの端を頭蓋骨にねじ込みます。次に、フットプレートの向きを計画して、すべての脚が頭蓋骨にねじ込まれるようにします。次に、フットプレートのチタンネジをしっかりと固定されるまでねじ込んで、フットプレートを固定します。次に、台座をフットプレートにねじ込みます。縫合糸を3ミリメートル離して、4オーの非吸収性縫合糸ワイヤーで皮下縫合糸を作成します。台座から離れ、切開の両側で台座に向かって移動します。次に、6オーの非吸収性縫合ワイヤーを使用して皮膚を縫合することにより、真皮層を閉じます。縫合糸を5ミリメートル離して。台座から離れ、切開の両側で台座に向かって移動します。空隙を避けるために、2つの皮膚フラップの間と台座の端の近くで良好な組織配置を実現するように注意してください。動物を抱っこしたり、おやつを与えて気をそらしたりして、ワイヤレスヘッドステージを動物に接続した後、覚醒している脳信号を記録します。信号を記録するときは、必ず ampアンテナと外部スピーカーを豚のケージの近くに置きます。800ヘルツのトーンバースト刺激に応答する音刺激および聴覚誘発電位を伴わないベースライン活動を電極アレイ上にマッピングすることができる。単一の電極チャネルにおける聴覚誘発電位は、オンの「応答」を示す矢印で経時的に示され、ベースライン活性は比較として示されています。In vivoイメージングは、脳の状態とインプラントの位置を評価するために、術中および術後に実施されました。術中平面X線検査でインプラント埋入が確認され、X線不透過性マーカーの埋入で観察された折り畳みはありませんでした。術後のMRIで観察できるように、脳の表面は無傷です。全体として、このインプラントとペデスタルシステムにより、インプラント期間中の全脳イメージングが可能になり、インプラントの周りの解剖学的構造や液体や血液の存在を確認できます。さらに、この研究では臨床用電極が比較対象として使用されていますが、加熱と安全上の懸念からMRIで画像化できず、CTスキャンが必要です。提示されたパイプラインは、全脳抽出と全半球を画像化するための切片化を可能にします。組織切片全体の画像化では、明瞭なニューロン層が見られました。細胞は20倍の共焦点イメージングで明確に定義され、炎症マーカーの精密な調査を可能にします。デバイスの電気化学的特性評価を使用して、インピーダンス弾性率と位相をin vitroで抽出し、移植の6か月間に1キロヘルツで経時的に追跡しました。手術中に副鼻腔が開かないように、動物の年齢と大きさを慎重に選択することが重要です。これは慢性的な実験を損なうことになります。硬膜にアクセスしたり、インプラントを挿入したりするときに出血を避けることが重要です。これにより、さらなる合併症や炎症反応を回避できます。このモデルが確立されると、ミニブタで自由に振る舞う電気生理学を実行し、皮質の関心領域からの活動を記録するために使用できます。この方法は、ヒトに翻訳される新しい神経補綴物を開発する際の臨床試験の提出のためのバイオセーフティデータの収集に適用できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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