Name: バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ オクタノール支援リポソームアセンブリ（OLA）によるマイクロ流体デバイスを用いた生体適合性リポソームの作製法。単分散性で高い封入効率を持つ細胞サイズのリポソームを少量サンプルで迅速に生成し、合成生物学や創薬スクリーニングへの応用が可能です。

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ドルフ・ヴァイヤーズ、ヴェラ・ゴレロワ、マーク・ルーシェンがYFPを提供してくれたことに感謝します。S.D.は、オランダ研究評議会からの財政的支援を認めています(助成金番号:OCENW。クライン.465)。

著者は利益相反を宣言しません。

細胞の複雑さは、全体として研究した場合、生細胞を理解することを非常に困難にします。in vitroで主要成分を再構成することによって細胞の冗長性と相互接続性を減らすことは、生物学的システムの理解を深め、バイオテクノロジーアプリケーションのための人工細胞模倣物を作成するために必要です22,23,24。リポソームは、細胞現象を理解するための優れた最小限のシステムとして機能します。これらの現象の非網羅的なリストは、細胞骨格動態および結果として生じる膜変形25,26、生体分子凝縮物27,28の時空間調節およびそれらの膜との相互作用29、無細胞転写翻訳系30、無細胞脂質合成31、およびタンパク質の進化32を含む多種多様な生体分子のカプセル化を含み、33,34。リポソームは、薬物送達の担体としても広く使用されており、食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって臨床使用が承認されています11。リポソームおよび脂質ベースのナノ粒子は、最近のCOVID-19ワクチン35のようなmRNAワクチンを含む薬物送達の担体として使用される。
この研究では、オンチップリポソームを生成するためにOLA技術を実行するためのフォトリソグラフィ、マイクロ流体アセンブリ、および表面機能化に関する詳細なプロトコルについて説明します(図1 および 図3)。OLAを使用して製造されたリポソームは、単分散(変動係数:平均の4%〜11%)および生物学的細胞サイズ範囲(典型的には直径5〜50μmの間)にあり、それらは、内側および外側の水性チャネル36の適切な流速を使用して調整することができる。例えば、 図1に見られるリポソーム集団は、23.3μm±1.8μm(n =50)のサイズ分布を有する。10〜30Hzの典型的な産生速度で、形成されたリポソームは、単一の二重層特異的膜貫通タンパク質、α-ヘモリシン36を膜に挿入することによって、ならびにジチオン酸漂白アッセイ37を使用することによって以前に確認されたように、単層である。OLAは、さまざまな脂質組成とも互換性があり、脂質の選択に柔軟性を提供します。重要なことに、最初に使用された脂質組成物は、最終的なリポソーム組成物38に反映される。
比較的新しいテクノロジーであるため、OLAを改善する余地はさらにあります。たとえば、PVAを使用した表面機能化は非常に重要ですが、実行するのは面倒です。デバイスを表面機能化するためのより簡単で簡単な方法は、チップ製造時間とチップ間のばらつきを大幅に削減します。プルロニックF68界面活性剤は、二重エマルジョンを最初に安定化させるための外水相の重要な成分です。それにもかかわらず、その使用は特定の場合に制限される可能性があります。Pluronic F68をより生体適合性の高い界面活性剤に置き換えるか、界面活性剤を完全に除去することで、システムの汎用性が向上する可能性があります。出口チャネルで生成された二重エマルジョンの移動中に、それらはせん断のために破裂する可能性があります。OLA設計をアップグレードして二重エマルジョンの安定性とオクタノールポケット分離を改善すると、スループットが向上する可能性があります。それにもかかわらず、OLAには、主に効率的なカプセル化、単分散および単層リポソーム、および制御されたオンチップ実験を含むいくつかの利点があります。
OLAは、リポソーム39の成長と分裂、液液相分離のプロセス27とその膜21との相互作用の研究、リポソーム40における細菌増殖バイオ産物形成の理解など、さまざまな研究で採用および適応されています。OLAベースのハイスループットアッセイは、膜41を横切るイオン輸送および脂質二重層37を横切る薬物透過性を理解するために、治療目的のための薬物送達システムとして42、膜43に対する抗菌剤の効果を研究するため、および液晶44を封入するためのツールとしても使用されている。OLA技術の幅広い用途に加えて、特定の目的に適したOLAの修正バージョンが開発されています45,46,47,48,49,50。全体として、長所と短所を考慮すると、OLAは合成生物学の用途の広いプラットフォームであると強く信じています。

全ての細胞はそれらの物理的境界として原形質膜を有し、そしてこの膜は本質的に両親媒性脂質分子の自己組織化によって形成される脂質二重層の形態の足場である。リポソームは、生物学的細胞の最小合成対応物です。それらはリン脂質で囲まれた水性内腔を有し、リン脂質は親水性の頭部基が水相に面し、疎水性の尾部が内側に埋もれている脂質二重層を形成する。リポソームの安定性は、疎水性効果、極性基間の親水性、疎水性カーボンテール間のファンデルワールス力、および水分子と親水性ヘッド間の水素結合によって支配されます1,2。脂質二重層の数に応じて、リポソームは、単一の二重層からなる単層小胞と複数の二重層から構築された多層小胞の2つの主要なカテゴリーに分類することができる。単層小胞は、そのサイズに基づいてさらに分類されます。典型的には球形であり、小さな単層小胞(SUV、直径30〜100 nm)、大きな単層小胞(LUV、直径100〜1,000 nm)、そして最後に巨大な単層小胞(GUV、直径>1,000 nm)を含むさまざまなサイズで製造できます3,4。リポソームを製造するために様々な技術が開発されており、これらはバルク技術5とマイクロ流体技術6に大きく分類することができる。一般的に実施されているバルク技術には、脂質膜の再水和、電鋳、反転エマルジョン転写、および押出7、8、9、10が含まれます。これらの技術は比較的単純で効果的であり、合成生物学コミュニティで広く使用されている主な理由です。しかしながら、同時に、それらは、サイズの多分散性、ラメラリティーに対する制御の欠如、および低いカプセル化効率に関して大きな欠点に苦しんでいる7,11。連続液滴界面交差カプセル化(cDICE)12や液滴撮影およびサイズろ過(DSSF)13などの技術は、これらの制限をある程度克服します。
マイクロ流体アプローチは、過去10年間で注目を集めています。マイクロ流体技術は、特徴的な層流と拡散が支配的な物質移動により、ユーザー定義のマイクロチャネル内の流体の流れを操作するための制御可能な環境を提供します。結果として得られるラボオンチップデバイスは、サンプル量を大幅に削減し、マルチプレックス機能を備え、分子の時空間制御に独自の可能性を提供します14。パルス噴射15、ダブルエマルジョンテンプレート16、一過性膜排出17、液滴エマルジョン転写18、および流体力学的焦点化19を含む、リポソームを作製するための多数のマイクロ流体法が開発されている。これらの技術は、高いカプセル化効率と高いスループットを備えた単分散の単層細胞サイズのリポソームを生成します。
この記事では、流体力学的ピンチオフとそれに続く溶媒デウェッティングメカニズム20に基づくオンチップマイクロ流体法であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の手順について詳しく説明します(図1)。OLAの働きを泡を吹くプロセスに関連付けることができます。6方向ジャンクションは、内水(IA)相、2つの脂質担持有機(LO)ストリーム、および2つの界面活性剤含有外水性(OA)ストリームを1つのスポットに集中させます。これにより、水中水(脂質+オクタノール)の二重エマルジョン液滴が得られます。これらの液滴が下流に流れると、界面エネルギーの最小化、外部せん断流、およびチャネル壁との相互作用により、溶媒ポケットが剥離するにつれて界面に脂質二重層が形成され、単層リポソームが形成されます。オクタノールポケットのサイズに応じて、デウェッティングプロセスには数十秒から数分かかる場合があります。出口チャネルの終わりには、密度の低いオクタノール液滴が表面に浮遊しますが、より重いリポソーム(より高密度のカプセル化溶液による)は、実験の準備ができた視覚化チャンバーの底に沈みます。代表的な実験として、リポソーム内部の液-液相分離(LLPS)のプロセスが実証されています。そのためには、必要な成分がLLPSを防ぐ酸性pHでリポソーム内に封入されています。pH変化、したがって膜貫通プロトンフラックスを外部から引き起こすことによって、相分離凝縮液滴がリポソーム内部に形成される。これは、OLAシステムの効果的なカプセル化および操作機能を浮き彫りにします。

<table><tbody><tr><td>1-Octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 297887</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>Fisher scientific</td><td>10451043</td><td>Eppendorf 3810X ポリプロピレン微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. A2383</td><td></td></tr><tr><td>バイオプシーパンチ</td><td>ダーウィンマイクロフルイディクス</td><td>PT-T983-05</td><td>直径 0.5 mm および 3 mm</td></tr> ク<tr><td>エン酸塩ベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 71405</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 31388</td><td>Mr~6,000</td></tr><tr><td>ダイレクトライト光リソグラフィー装置</td><td>Durham Magneto Optics Ltd</td><td>MicroWriter ML3 Baby</td><td>setup and software</td></tr><tr><td>DOPC lipid</td><td>Avanti</td><td>SKU:850375C</td><td></td></tr><tr><td>F68</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 24040032</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>コーニング</td><td>#1, 24 x 40 mm</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. G2025</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Thermo Scientific Acros</td><td>No. 124630010</td><td></td></tr><tr><td>Liss Rhod PE 脂質</td><td>Avanti</td><td>SKU:810150C</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P7793</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Micro resist technology GmbH</td><td>EpoCore 10</td><td></td></tr><tr><td>フォトレジスト現像液</td><td>マイクロレジストテクノロジーGmbH</td><td>mr-Dev 600</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリック プラズマ</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン</td><td>ダウ</td><td>シルガード 184</td><td>PDMS および硬化剤</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P7890</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン&ndash;FITCラベル:</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P3543</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P8136</td><td>分子量:30,000&ndash;70,000、87%&ndash;90%加水分解圧力</td></tr><tr><td></td><td>コントローラーElveflow&nbsp;</td><td>OBK1 Mk3 +</td><td>フローコントローラー</td></tr><tr><td>スコッチテープ</td><td>マジックテープ 見えないマットテープ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>シリコン材料</td><td>0620R16002</td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター&nbsp;</td><td>ローレル・テクノロジーズ・コーポレーション</td><td>WS-650MZ-23NPP</td><td></td></tr><tr><td>型 ステンレス鋼 90°C;曲がったPDMSカプラー</td><td>ダーウィンマイクロ流体工学</td><td>PN-BEN-23G</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>No.252859</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td>ダーウィンマイクロ流体工学</td><td>1/16 "OD×0.02"ID</td><td></td></tr><tr><td>紫外線レーザー&nbsp;</td><td></td><td></td><td>波長365nm</td></tr></tbody></table>

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

マイクロフルイディクスは、制御されたハイスループットな方法でさまざまな種類の液滴や小胞を生成するために広く使用されているツールです。リポソームは、脂質二重層に囲まれた水性内部で構成される単純な細胞模倣物です。それらは、合成細胞を設計し、 in vitro 方式で生物学的細胞の基礎を理解する上で価値があり、治療用途の貨物輸送などの応用科学にとって重要です。この記事では、単分散でミクロンサイズの生体適合性リポソームを製造するためのオンチップマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)の詳細な作業プロトコルについて説明します。OLAは、内水(IA)相と周囲の脂質担持1-オクタノール相が界面活性剤を含む外液流によって挟まれる気泡吹きと同様に機能します。これにより、オクタノールポケットが突出した二重エマルジョン液滴が容易に生成されます。脂質二重層が液滴界面で集合すると、ポケットは自発的に剥離し、さらなる操作および実験の準備ができている単層リポソームを生じさせる。OLAは、安定したリポソーム生成(>10 Hz)、生体材料の効率的なカプセル化、単分散リポソーム集団など、いくつかの利点を提供し、貴重な生物学的製剤を扱う際に重要な非常に少量のサンプル(~50 μL)を必要とします。この研究には、ラボでOLA技術を確立するために必要な微細加工、ソフトリソグラフィ、および表面パッシベーションの詳細が含まれています。原理実証合成生物学の応用は、膜貫通プロトンフラックス を介して リポソーム内の生体分子凝縮物の形成を誘導することによっても示されています。この付随するビデオプロトコルは、読者がラボでOLAを確立してトラブルシューティングすることを容易にすることが期待されています。

本研究では、代表的な実験として、リポソーム内の液-液相分離(LLPS)プロセス を介した 膜のない凝縮物の形成を実証しています。
サンプル調製 IA、OA、ES、およびフィード溶液(FS)は、次のように調製されます。
IA: 12% グリセロール、5 mM デキストラン、150 mM KCl、5 mg/mL ポリ L-リジン (PLL)、0.05 mg/mL ポリ-L-リジン-FITC標識 (PLL-FITC)、8 mM アデノシン三リン酸 (ATP)、15 mM クエン酸塩酸塩 (pH 4)
OA: 12% v/v グリセロール, 5% w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM クエン酸塩酸塩 (pH 4)
ES: 12% グリセロール, 150 mM KCl, 15 mM クエン酸塩酸塩 (pH 4)
FS: 12% グリセロール, 150 mM KCl, 75 mM トリス塩酸塩 (pH 9)
リポソーム内部での凝縮物形成 正に帯電したポリ-L-リジン(PLL)と負に帯電した多価アデノシン三リン酸(ATP)のpH感受性複合コアセルベーションの簡単なアッセイを選択して、リポソームにおけるLLPSの現象を実証しました。カプセル化中のポリリジンとATPの相分離を防ぐために、溶液のpHはATPが中性である4に維持した。FS(pH9の緩衝液)を添加してESのpHを上昇させると、膜貫通プロトンフラックスによりリポソーム内のpHが上昇し、ATPが負に帯電し、正に帯電したPLL21との相分離が引き起こされます(図4A)。リポソーム生成の約2時間後、IAおよびLO圧力をオフにした。OAチャネル圧力を100mbarに保ち、残りのリポソームをゆっくりと観察チャンバーに流した。チャネル内のすべてのリポソームがEWで回収されると、圧力をオフにして流れを停止し、リポソームが動くのを防ぎます。より低いpHで生成されたリポソームは、それらの内腔に均一な蛍光(カプセル化された蛍光PLL-FITCから)を示しました(図4B、D)。表面に浮遊するオクタノール液滴は、さらなるピペッティングステップに影響を与えないように、上部から5 μLの溶液を慎重にピペッティングすることによって除去されました。続いて、10 μLのFSバッファーをEWに添加し、カプセル化されたPLLとATPの相分離を誘導しました。各リポソームからの均一なFITC蛍光は、徐々に異なる蛍光凝縮液滴に変換されました。最終的に、個々の液滴は1つの大きな凝縮液滴に融合し、リポソーム内で自由に拡散しました(図4C、E-G)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig01.jpg"> 図1:OLAの組み立てと動作を示す概略図。圧力コントローラは、外側の水性、オクタノール中の脂質、および内側の水溶液を含むリザーバーに接続されています。リザーバーに挿入されたチューブは、OLAデバイスのそれぞれの入口に接続されています。3つのチャネル内の適切な流れは、水中水(脂質-インオクタノール)-水中ダブルエマルジョンの形成につながります。形成された二重エマルジョンは出口ウェルに移動し、その間にオクタノールポケットが剥離してリポソームを形成する。形成されたリポソームは、可視化およびさらなる実験のためにウェルの底に集められる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig02.jpg"> 図2:OLAチップの作製(フォトリソグラフィ、微細加工、表面処理)。 (A)3つの入口、出口、および6方向の生産ジャンクションを含む、OLA設計の主要な機能を示すデジタル設計。(B)UVリソグラフィを用いて作製した複数のOLA設計を示すマスターウェーハの概略図。(c)マスターウェーハ上にPDMSエラストマーをキャストし、アルミホイルで作成したウェルに入れ、70°Cで2時間焼成して硬化させる。 (d)酸素プラズマ処理を用いて接合されたマイクロ流体デバイスであって、OLA設計を含むPDMSブロックをPDMS被覆スライドガラスに取り付ける。(e)作製したチップの表面機能化により、デバイスを部分的に親水性にする。これは、外側の水性チャネルから出口チャネルに向かって5分間5%w / v PVAを流すことによって行われます。他のチャネルの正の空気圧は、PVAソリューションがこれらのチャネルに入るのを防ぎます。(f)出口チャネルに真空を印加することによりPVAを除去する。デバイスを120°Cで15分間焼き、すぐに使用できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig03.jpg"> 図3:OLAが単分散二重エマルジョンを効率的に生成し、最終的にはカプセル化に優れたリポソームを生成することを実証。 (A)二重エマルジョン液滴の急速な生成を示す明視野画像。(B)蛍光脂質チャネルは、部分的な脱湿によるオクタノールポケットの形成を示す。脂質インオクタノール相には、DOPC(5 mg/mL)とLis Rhod PEが1,000:1の比率で混合されていました。(c)黄色蛍光タンパク質(YFP)の封入を示す内水チャネル。(A-C)の挿入図は、それぞれのパネルの代表的なズームインビューを示しています(スケールバー= 10 μm)。(D-F)出口チャネルにおけるオクタノールポケットの脱湿は、リポソームを形成する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig04.jpg"> 図4:リポソーム内のpLL/ATPのpHトリガー液-液相分離。 (A)リポソーム内に封入されたpLLとATPの均一溶液(左)から相分離したpLL/ATPコアセルベート(右)へのpH依存的な移行の模式図。リポソーム内の初期の酸性環境は、ATPの分子電荷を中性にし、コアセルベーションを阻害します。リポソーム内のpHが外部から加えられたpH上昇と平衡化すると、ATPは負電荷を獲得し、コアセルベーションを引き起こします。(B-C)pLL(緑チャンネル)とメンブレン(赤チャンネル)の空間分布を示す折れ線グラフ(それぞれパネル[D]と[G]の点線に対応)。(D-G)リポソーム内のpLL/ATPコアセルベートの形成を示すタイムラプス画像。塩基性バッファーの外用添加は、数分かけてリポソーム内のpHレベルを上昇させ、コアセルベーションを開始します。t=0分は、最初のコアセルベーション事象の発生直前の時間を指す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル1:OLAデザインのCADファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/OLA%20device%20design.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコルは、生体適合性リポソームを生成するためのマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)を記載する。OLAは、効率的なカプセル化を備えた単分散のミクロンサイズのリポソームを生成し、即時のオンチップ実験を可能にします。このプロトコルは、合成生物学および合成細胞研究に特に適していると期待されています。

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are ...

OLAは、合成生物学コミュニティに役立つ汎用性の高いマイクロ流体プラットフォームです。特に、人工細胞をバイオエンジニアリングする。OLAベースのリポソームは、生物学における自己組織化原理を理解し、細胞模倣アセンブリを構築するのに役立ちます。OLAは、単分散の単層細胞リポソームをハイスループット方式で、優れたカプセル化効率で製造します。50マイクロリットルのオーダーの非常に少量のサンプルを必要とし、形成されたリポソームはさらなるオンチップ実験のためにすぐに利用できます。OLAは、微小閉じ込め、小胞ダイナミクス、生体分子凝縮物内の生物学的反応と、それらの膜との相互作用を研究するのに役立ちます。OLAは、抗菌薬の透過性や膜活性を試験するなど、薬物スクリーニングのためのハイスループットプラットフォームとしても適用されています。PV処理である表面機能化は、プロトコルにとって重要なステップであり、PV溶液が内部アクイアおよび脂質運搬有機チャネルに入るのを防ぐために慎重に実行する必要があります。また、ポストプロダクションチャネルは、オクタノールポケットの分離がリポソームを形成するのに十分な長さでなければなりません。私の研究室の博士課程の学生であるケタン・ガナーは、チャン・チェンが手順を実演するのを手伝います。まず、直径4インチのクリーンシリコンウェーハを取り、加圧空気を使用してさらに洗浄し、ほこりの粒子を取り除きます。ウェーハをスピンコーターにマウントし、ウェーハの中央に約5ミリリットルのネガフォトレジストを静かに塗布します。厚さ10マイクロメートルのフォトレジスト層を得るには、スピンコート設定を500 RPMに設定し、初期拡散のために毎秒100RRPの加速度で30秒間、続いて毎秒500 RPMの加速度で3, 000 RPMで60秒スピンします。次に、ウエハをスピンコートする。ウェーハを加熱プレートで摂氏65度で2分間焼き、次に摂氏95度で5分間焼きます。ウェーハが冷えたら、右の光リソグラフィ装置の印刷チャンバーにウェーハを取り付け、オクタノール支援リポソームアセンブリまたはOLAデザインをソフトウェアに供給します。デザインが印刷されたら、ウェーハを摂氏65度で1分間焼き、続いて摂氏95度で3分間焼きます。未硬化のフォトレジストを洗い流すには、未硬化のフォトレジストが完全に除去されるまで、現像液を入れたガラスビーカーにウェーハを浸します。ウェーハを摂氏150度で30分間ハードベークして、印刷されたデザインがウェーハ表面にしっかりと取り付けられ、下流の製造プロセスで剥がれないようにします。マイクロ流体デバイスを準備するには、マスターウェーハを正方形のアルミニウム片の上に置き、アルミニウム箔をウェーハに巻き付けて、ウェルのような構造を形成します。PDMS混合物をマスターウェーハにそっと注ぎます。アセンブリを摂氏70度のオーブンで少なくとも2時間インキュベートします。マスターウェーハをオーブンから取り出し、冷まします。固化したポリジメチルシロキサンまたはPDMSブロックを除去するには、アルミホイルを取り外してから、ウェーハの端からPDMSブロックを慎重に剥がします。透明なガラスカバースリップを取り、約0.5ミリリットルのPDMSをスライドガラスの中央に注ぎ、スライドガラスを軽く傾けてカバースリップ全体に広げ、PDMSでスライドガラスを完全にカバーします。スライドガラスをスピンコーターに取り付けます。スライドの中央が圧力シャフトの中心と重なるように中央に配置されていることを確認してください。次に、スライドガラスを500 RPMで毎秒100 RPM刻みで15秒間、毎秒500 RPMの増分で30秒間1, 000 RPM回転させます。PDMコーティングされたスライドガラスを、コーティングされた面を上に向けて、覆われたペトリ皿のPDMSのブロックのような隆起したプラットフォームに置きます。摂氏70度で2時間焼きます。プラズマクリーナーの真空チャンバーに、刻印されたチャネルを上向きにしてPDMSコーティングされたスライドガラスを置き、コーティングされた面を上に向けてPDMSコーティングされたスライドガラスを配置します。真空のスイッチを入れ、内容物を12メガヘルツの無線周波数で15秒間空気プラズマにさらして、表面をアクティブにします。酸素プラズマはピンクがかった色合いの形で見ることができます。プラズマ処理の直後に、PDMSコーティングされたスライドガラスを、PDMS側を上に向けてきれいな面に置きます。マイクロ流体パターンをPDMSコーティングされたスライドガラスに向けてPDMSブロックをそっと置き、接着できるようにします。ボンディングされたデバイスを摂氏70度で2時間焼きます。200マイクロリットルの5%ポリビニルアルコールまたはOVA溶液を1.5ミリリットルのチューブに分注し、マイクロ流体リザーバースタンドに接続します。一方の端がPVA溶液に沈められ、もう一方の端がマイクロ流体デバイスの外側の水性チャネルの入口に接続されるようにチューブを挿入します。外側水相の圧力を100ミリバールに上げて、外側の水性チャネルにPVA溶液を流します。内水性および脂質を運ぶ有機相の圧力を120ミリバールに上げて、これらのチャネル内のPVA溶液の逆流を防ぎます。この方法でPVA溶液を約5分間流し、出口チャネルの完全な機能化を保証します。脂質を運ぶ有機チャネルと内側の水性チャネルの圧力を2バールに上げてPVA溶液を除去し、すぐにチューブを外側の水性入口から取り外します。同時に、負圧チャネルに接続されたチューブを使用して、出口チャネルから余分なPVAを除去します。デバイスを摂氏120度で15分間焼き、冷ましてから使用してください。デバイスは、周囲条件下で少なくとも1か月間保管できます。溶液を3本の1.5ミリリットルチューブに分注し、組み立てます。それらをPVA処理されたマイクロ流体チップに接続し、3つのチャネルに陽圧をかけ、内水性および脂質運搬有機チャネルに約100ミリバール、外側水性チャネルに約200ミリバールを印加します。3つの相すべてが接合部で共流し始めたら、二重エマルジョン製造が開始されるようにし、その品質に応じて圧力を調整します。二重エマルジョン液滴が流れるにつれて、オクタノールのすべてのポケットがますます目立つようになり、最終的に挟まれてリポソームを形成します。二重エマルジョン液滴の急速な生成の明視野画像がここに示されている。蛍光脂質チャネルは、部分的な脱湿によるオクタノール全ポケットの形成を示す。内水性チャネルは、黄色蛍光タンパク質の封入を示す。リポソームを形成する出口チャネルにおけるオクタノールポケットの脱湿をこの図に示す。この画像は、リポソーム内に封入されたポリリジンとATPの均一溶液から相分離したポリリジンATPコアセルベートへのpH依存的な移行の概略を表しています。リポソーム内の初期の酸性環境は、ATPの分子電荷を中性にし、コアセルベーションを阻害します。リポソーム内のpHが外部から加えられたpH上昇と平衡化すると、ATPは負電荷を獲得し、コアセルベーションを引き起こします。ポリリジンと膜の空間分布と、リポソーム内でのポリリジンATPコアセルベートの形成のタイムラプス画像をこの図に示します。塩基性バッファーの外部版は、数分かけてリポソーム内のpHレベルを上昇させ、コアセルベーションを開始します。Tがゼロ分に等しいのは、最初のコアセルベーション事象の発生直前の時間を指す。手順を実証している間、安定したダブルエマルジョン生産を生成するために、チャネル圧力を辛抱強く調整することが重要です。OLAとそのバリエーションは、生体分子凝縮物の動態を理解するリポソームの成長と分裂、タンパク質の無細胞発現、細菌のカプセル化など、さまざまな研究に採用されています。したがって、挫折では、OLAは合成生物学のための用途の広いプラットフォームであると信じています。

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。...

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

私たちは、自己組織化ナノ構造をコアに含む脂質粒子の速度論的安定化のためのカーボンナノチューブのスマートな応用について報告します。脂質粒子の調製には、かなり低濃度のカーボンナノチューブが必要であり、薬物送達などの生物医学的用途での使用が可能です。...

カーボンナノチューブにより安定化内部自己組織化脂質粒子の簡便な調製

私たちは、保存可能な、可搬型の脂質二重層形成システムを実証します。凍結した膜前駆体を周囲温度にしたときに脂質二重膜は、80％以上の成功率で1時間以内に形成することができます。このシステムは、イオンチャンネルに関連した面倒なプロセスと専門知識を軽減します。...

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

本研究では、ナノリポソーム調製の薄い脂質膜法を用いた古典的な水和を説明し、続いてナノ粒子の特性を説明する。47...

生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。...

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

脂質ナノ粒子は、mRNAおよびDNAカプセル化のためのマイクロ流体混合プラットフォームアプローチを用いて開発される。...

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。...

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

ここでは、ナノバー支持脂質二重層システムが開発され、 in...

in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

学ぶ オクタノール支援リポソームアセンブリ（OLA）によるマイクロ流体デバイスを用いた生体適合性リポソームの作製法。単分散性で高い封入効率を持つ細胞サイズのリポソームを少量サンプルで迅速に生成し、合成生物学や創薬スクリーニングへの応用が可能です。

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

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