バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

OLAは、合成生物学コミュニティに役立つ汎用性の高いマイクロ流体プラットフォームです。特に、人工細胞をバイオエンジニアリングする。OLAベースのリポソームは、生物学における自己組織化原理を理解し、細胞模倣アセンブリを構築するのに役立ちます。

OLAは、単分散の単層細胞リポソームをハイスループット方式で、優れたカプセル化効率で製造します。50マイクロリットルのオーダーの非常に少量のサンプルを必要とし、形成されたリポソームはさらなるオンチップ実験のためにすぐに利用できます。OLAは、微小閉じ込め、小胞ダイナミクス、生体分子凝縮物内の生物学的反応と、それらの膜との相互作用を研究するのに役立ちます。

OLAは、抗菌薬の透過性や膜活性を試験するなど、薬物スクリーニングのためのハイスループットプラットフォームとしても適用されています。PV処理である表面機能化は、プロトコルにとって重要なステップであり、PV溶液が内部アクイアおよび脂質運搬有機チャネルに入るのを防ぐために慎重に実行する必要があります。また、ポストプロダクションチャネルは、オクタノールポケットの分離がリポソームを形成するのに十分な長さでなければなりません。

私の研究室の博士課程の学生であるケタン・ガナーは、チャン・チェンが手順を実演するのを手伝います。まず、直径4インチのクリーンシリコンウェーハを取り、加圧空気を使用してさらに洗浄し、ほこりの粒子を取り除きます。ウェーハをスピンコーターにマウントし、ウェーハの中央に約5ミリリットルのネガフォトレジストを静かに塗布します。

厚さ10マイクロメートルのフォトレジスト層を得るには、スピンコート設定を500 RPMに設定し、初期拡散のために毎秒100RRPの加速度で30秒間、続いて毎秒500 RPMの加速度で3, 000 RPMで60秒スピンします。次に、ウエハをスピンコートする。ウェーハを加熱プレートで摂氏65度で2分間焼き、次に摂氏95度で5分間焼きます。

ウェーハが冷えたら、右の光リソグラフィ装置の印刷チャンバーにウェーハを取り付け、オクタノール支援リポソームアセンブリまたはOLAデザインをソフトウェアに供給します。デザインが印刷されたら、ウェーハを摂氏65度で1分間焼き、続いて摂氏95度で3分間焼きます。未硬化のフォトレジストを洗い流すには、未硬化のフォトレジストが完全に除去されるまで、現像液を入れたガラスビーカーにウェーハを浸します。

ウェーハを摂氏150度で30分間ハードベークして、印刷されたデザインがウェーハ表面にしっかりと取り付けられ、下流の製造プロセスで剥がれないようにします。マイクロ流体デバイスを準備するには、マスターウェーハを正方形のアルミニウム片の上に置き、アルミニウム箔をウェーハに巻き付けて、ウェルのような構造を形成します。PDMS混合物をマスターウェーハにそっと注ぎます。

アセンブリを摂氏70度のオーブンで少なくとも2時間インキュベートします。マスターウェーハをオーブンから取り出し、冷まします。固化したポリジメチルシロキサンまたはPDMSブロックを除去するには、アルミホイルを取り外してから、ウェーハの端からPDMSブロックを慎重に剥がします。

透明なガラスカバースリップを取り、約0.5ミリリットルのPDMSをスライドガラスの中央に注ぎ、スライドガラスを軽く傾けてカバースリップ全体に広げ、PDMSでスライドガラスを完全にカバーします。スライドガラスをスピンコーターに取り付けます。スライドの中央が圧力シャフトの中心と重なるように中央に配置されていることを確認してください。

次に、スライドガラスを500 RPMで毎秒100 RPM刻みで15秒間、毎秒500 RPMの増分で30秒間1, 000 RPM回転させます。PDMコーティングされたスライドガラスを、コーティングされた面を上に向けて、覆われたペトリ皿のPDMSのブロックのような隆起したプラットフォームに置きます。摂氏70度で2時間焼きます。

プラズマクリーナーの真空チャンバーに、刻印されたチャネルを上向きにしてPDMSコーティングされたスライドガラスを置き、コーティングされた面を上に向けてPDMSコーティングされたスライドガラスを配置します。真空のスイッチを入れ、内容物を12メガヘルツの無線周波数で15秒間空気プラズマにさらして、表面をアクティブにします。酸素プラズマはピンクがかった色合いの形で見ることができます。

プラズマ処理の直後に、PDMSコーティングされたスライドガラスを、PDMS側を上に向けてきれいな面に置きます。マイクロ流体パターンをPDMSコーティングされたスライドガラスに向けてPDMSブロックをそっと置き、接着できるようにします。ボンディングされたデバイスを摂氏70度で2時間焼きます。

200マイクロリットルの5%ポリビニルアルコールまたはOVA溶液を1.5ミリリットルのチューブに分注し、マイクロ流体リザーバースタンドに接続します。一方の端がPVA溶液に沈められ、もう一方の端がマイクロ流体デバイスの外側の水性チャネルの入口に接続されるようにチューブを挿入します。外側水相の圧力を100ミリバールに上げて、外側の水性チャネルにPVA溶液を流します。

内水性および脂質を運ぶ有機相の圧力を120ミリバールに上げて、これらのチャネル内のPVA溶液の逆流を防ぎます。この方法でPVA溶液を約5分間流し、出口チャネルの完全な機能化を保証します。脂質を運ぶ有機チャネルと内側の水性チャネルの圧力を2バールに上げてPVA溶液を除去し、すぐにチューブを外側の水性入口から取り外します。

同時に、負圧チャネルに接続されたチューブを使用して、出口チャネルから余分なPVAを除去します。デバイスを摂氏120度で15分間焼き、冷ましてから使用してください。デバイスは、周囲条件下で少なくとも1か月間保管できます。

溶液を3本の1.5ミリリットルチューブに分注し、組み立てます。それらをPVA処理されたマイクロ流体チップに接続し、3つのチャネルに陽圧をかけ、内水性および脂質運搬有機チャネルに約100ミリバール、外側水性チャネルに約200ミリバールを印加します。3つの相すべてが接合部で共流し始めたら、二重エマルジョン製造が開始されるようにし、その品質に応じて圧力を調整します。

二重エマルジョン液滴が流れるにつれて、オクタノールのすべてのポケットがますます目立つようになり、最終的に挟まれてリポソームを形成します。二重エマルジョン液滴の急速な生成の明視野画像がここに示されている。蛍光脂質チャネルは、部分的な脱湿によるオクタノール全ポケットの形成を示す。

内水性チャネルは、黄色蛍光タンパク質の封入を示す。リポソームを形成する出口チャネルにおけるオクタノールポケットの脱湿をこの図に示す。この画像は、リポソーム内に封入されたポリリジンとATPの均一溶液から相分離したポリリジンATPコアセルベートへのpH依存的な移行の概略を表しています。

リポソーム内の初期の酸性環境は、ATPの分子電荷を中性にし、コアセルベーションを阻害します。リポソーム内のpHが外部から加えられたpH上昇と平衡化すると、ATPは負電荷を獲得し、コアセルベーションを引き起こします。ポリリジンと膜の空間分布と、リポソーム内でのポリリジンATPコアセルベートの形成のタイムラプス画像をこの図に示します。

塩基性バッファーの外部版は、数分かけてリポソーム内のpHレベルを上昇させ、コアセルベーションを開始します。Tがゼロ分に等しいのは、最初のコアセルベーション事象の発生直前の時間を指す。手順を実証している間、安定したダブルエマルジョン生産を生成するために、チャネル圧力を辛抱強く調整することが重要です。

OLAとそのバリエーションは、生体分子凝縮物の動態を理解するリポソームの成長と分裂、タンパク質の無細胞発現、細菌のカプセル化など、さまざまな研究に採用されています。したがって、挫折では、OLAは合成生物学のための用途の広いプラットフォームであると信じています。