Name: マウスおよびヒト涙腺オルガノイドの樹立、維持、分化、遺伝子操作、移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶマウスおよびヒト涙腺オルガノイドの樹立・維持・分化・遺伝子操作・移植の手法。電気穿孔と時系列顕微鏡観察を用いて涙腺恒常性の遺伝的制御を研究し、再生医療への応用可能性を探索する。

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プロトコルの初期開発についてYorick Postに感謝します。この研究の一部は、Cancer Research UK Grand Challenge(C6307/A29058)およびMark Foundation for Cancer ResearchからSPECIFICANCERチームへの賞によって支えられた。

<ol><li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+development%3A+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li>
<li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+infection+of+the+external+eye%3A+The+role+of+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+Arzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
<li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li>
<li>Bannier-Hélaouët, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
<li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+Studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+complex+DNA+repair+%28DECODR%29%3A+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li>
<li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy%3A+Developmental+aspects+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li>
<li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+regeneration%3A+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
</ol>

Hans Cleversは、バーゼルのロシュで製薬研究開発の責任者であり、オルガノイド技術に関連するいくつかの特許を保有しています。

このプロトコルは、機能アッセイ、突然変異モデリング、および移植のための涙腺オルガノイドの確立と使用について説明しています。マウスとヒトの涙腺オルガノイドを確立する場合、組織の解離は非常に重要です。組織が十分に消化されない場合、オルガノイド収量は低くなります。組織が過剰に消化されると、細胞は死に、オルガノイドとして成長しません。各組織は、最適なオルガノイドの伸長を確実にするために、特定の時間、特定の酵素で消化されるべきである14、17、18。涙腺は、ピペッティングベースの機械的解離と組み合わせた5〜10分のコラゲナーゼ消化が組織の小片を単離するのに十分である、かなり柔らかい組織である。シングルセルRNAシーケンシングなどのアプリケーションでシングルセルを取得する必要がある場合は、シングルセルステージに達するまで解離をより長く実行できますが、生存率の低下を制限するために、シングルセルが得られたらすぐに解離を停止する必要があります。組織の解離は非常に重要であるため、過剰消化が涙腺オルガノイドの確立の失敗の最も可能性の高い理由です。
涙腺オルガノイドの適切な維持は、それらの使用にとって重要である。長期維持は、人工多能性幹細胞由来オルガノイドと比較して、成体幹細胞由来涙腺オルガノイドの特徴である7,17。長期的なメンテナンスを達成するには、定期的なオルガノイド分割と培地交換を行う必要があります。これがないと、オルガノイドは分化し始め、幹細胞の可能性が低下し、長期的な維持を妨げます7。このステップでも、過剰消化は幹細胞を殺し、オルガノイドの維持を損なう可能性があります。定期的なメンテナンスのために、単一細胞へのオルガノイド解離は必要とされない。しかし、クローンノックアウトオルガノイド株を作製するには、まず単一細胞から始めることが重要です。そうでない場合、オルガノイドは異なる遺伝的背景を持つ細胞のモザイクで構成され、単一の定義された突然変異の影響を分析することは不可能です。ここでは、終止コドンを生成するためのC > Tベースエディタの使用について説明します。このゲノムエディターは、NGG PAMから12〜18塩基以内にアルギニン、グルタミン、またはトリプトファンコドンが存在することに依存しています。gRNAの設計においてこれらの条件が満たされない場合、代替PAMを有する従来のCas9またはC >T塩基エディターを使用することができる7,18。しかし、従来のCas9では、修理時にインデルが発生する二本鎖断線が導入されています11。両方の対立遺伝子が異なるインデルを持っている可能性があるため、クローンジェノタイピングには追加の注意が必要です。導入された修飾のデコンボリューションは、両方の対立遺伝子がフレーム外のインデルを含み、したがって、オルガノイドクローンが標的遺伝子に対してノックアウトされることを確実にするために実行する必要があります19。C > Tベースエディターの利点は、必ずしも終止コドンをもたらさない点突然変異をモデル化するために使用できるという事実にあります。たとえば、アニリジア患者に見られる特定のPax6変異をモデル化して、涙腺生理学への影響を研究するために使用できます20。
涙腺は涙液膜1の水性部分を分泌する。涙液分泌は、成長因子の離脱およびNOTCH阻害によって媒介される分化後のヒトオルガノイドにおいて再現され得る。これらの条件下では、オルガノイドは最終分化を受け、それ以上維持することはできません。しかし、分化した涙腺オルガノイドは、ドライアイ疾患の状況で、潜在的にハイスループットスクリーニングで涙を誘発する薬物の開発を導くことができます。このプロトコルで提示される引き裂きアッセイは、現在、短時間でオルガノイドサイズの最大の変化を与えるものであり、これにより、薬物スクリーニングのコンテキストで定量化することが容易になります7、9、17。
幹細胞療法は、ドライアイ疾患における涙腺再生に大きな期待を寄せています21。成体幹細胞由来の涙腺オルガノイドは、そのような用途の原料となる可能性があります。ここで提示されたプロトコルは、主に嚢胞として、ヒト涙腺オルガノイド生着をもたらします。オルガノイドの生着が低いのは、オルガノイドが間違った部位に注入されているためです。染料で注入手順をトレーニングすることで、注射部位の追跡が可能になり、最終的には注入精度が向上します。あるいは、マウスの表皮を切開して、22歳より前のラットで行われたように、涙腺に直接アクセスすることができます。この方法は時間がかかりますが、より正確になる場合があります。一方、本プロトコールでは、オルガノイドはマウスの涙腺に機能的に統合されなかった。同様の結果がiPS細胞由来涙腺生着についても観察されている22。移植方法は、事前に涙腺を創傷し、ドライアイマウスモデルを使用し、および/またはオルガノイドを単一細胞または小さな塊として注入することによってさらに改善される可能性があります。それにもかかわらず、成体幹細胞由来の涙腺オルガノイドおよび関連ツールキットは、涙腺研究および再生医療における将来の応用の基礎となる可能性があります。

涙腺は、涙液膜1の水層の大部分を産生する腺上皮である。涙液膜の水層には、眼の表面を滑らかにする水だけでなく、眼の表面を感染から保護する抗菌成分のレパートリーも多く含まれています2。涙腺が損傷または炎症を起こすと、ドライアイ疾患が発生し、患者に不快感を与え、最終的には視力喪失につながる可能性があります3。何年にもわたって、涙腺、特にヒト腺を研究するためのモデルシステムは制限されてきました4、5、6。これは、生理学的および病理学的条件下での涙腺機能に関する知識のギャップに貢献しています。
最近、皿中の涙腺を研究するためにin vitroモデルが開発されました7,8,9。これらの涙腺オルガノイドは、in vitroで再生能力を維持する成長因子のカクテルを補充した細胞外マトリックス中で三次元構造として増殖した成体幹細胞に由来します7。成体幹細胞(ASC)由来のオルガノイドの利点は、健康な組織の特徴を再現しながら、非常に長期間維持できることです。このタイプのオルガノイドは、例えば間質細胞を含む可能性のある人工多能性幹細胞(iPSC)由来のオルガノイドとは異なり、上皮細胞のみで構成されています。多能性幹細胞(PSC)由来のオルガノイドとは異なり、ASCオルガノイドは成体組織から直接樹立され、拡張のための遺伝子改変を必要としません。ASCオルガノイドは成人の特徴を発現します10。
このプロトコルには、マウスおよびヒトの一次組織から涙腺オルガノイドを導出するためのツールボックスが含まれています。このプロトコルでは、単純な成長因子の回収によってオルガノイドの機能をさらに強化する方法と、膨潤アッセイを実行してオルガノイドを誘発して涙液を分泌させる方法について説明します。このプロトコルには、CRISPR由来のベースエディターを使用してマウスオルガノイドを遺伝子操作するためのエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法も含まれています。従来のCas9とは異なり、塩基エディターの使用は、二本鎖切断を生成することなくゲノム中の一塩基の改変を可能にする11,12。最後に、免疫不全マウスへのヒト涙腺オルガノイドの同所性移植とその後の生着の組織学的評価について説明します。この涙腺オルガノイドツールキットは、涙腺の再生と機能に関する研究、および遺伝および炎症性疾患のモデリングに使用できます。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 安全ロック遠心分離管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-ジアミノベンジジン四塩酸塩水和物 (DAB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS: 868272-85-9 , 注意, 6 g/L 溶液は -20 >C</td></tr><tr><td>5x グリーン GoTaq Flexi バッファー</td><td>Promega</td><td>M891A</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>-20 °Cで保管。C、ストック30 mM、10000倍</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td>、<td>4°C;C</td></tr><tr><td>アンピシリンを含む寒天プレート</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ VAPOUR-Line lite</td><td>VWR chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>-20 >C、50x</td></tr><tr><td>BD マイクロファインインスリン針 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>卓上型顕微鏡 DMI1</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>MP バイオメディカル 160069</td><td></td><td>4 °C で保存。C</td></tr><tr><td>BTXpress</td><td>BTX</td><td>MDS450805</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カセット</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>凍結保存培地、指示に従う</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS:5949-29-1</td></tr><tr><td>コラゲナーゼI</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C9407</td><td>アリコート20mg / mL、20倍、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>コニカルチューブ 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 50 mL</td><td>コーニング</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ 24 mm x 50 mm</td><td>Menzel-Gl&auml;ザー</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex基底膜抽出物(BME)、成長因子減少、タイプ2-細胞外マトリックス</td><td>R&D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>-20 °で保管;C、4°に保ちます。C 最大1ヶ月間</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>-20°Cで保管。C、10 mMでストック、1000x</td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム無水VWR</td><td>化学薬品</td><td>28026.292</td><td>CAS:7558-79-4</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム水素二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>CAS:10028-24-7</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>50 U / mLでアリコート、-20°Cで保存。C 使用時まで、400x</td></tr><tr><td>使い捨てメス 滅菌 N&deg; 10</td><td>Swann Morton</td><td>3033838</td><td></td></tr><tr><td>DM4000 顕微鏡</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 25 mM</td><td>Promega</td><td>U1420</td> 4 <td>ヌクレオチドすべてを混合し、-20 °C で保存します。C</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>Easy strainers 70 & micro;m</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+/HRP マウス</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206;5000</td><td>注意、他のエタノール希釈液の調製に使用</td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>注意</td></tr><tr><td>エタノール 96%</td><td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>注意</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>ライブイメージング明視野マイクロスロープ</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>-20 >C、ベースメディウムに100 mg / mLでストック、100x</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH、フィジー現像液</td><td></td><td></td></tr>ホル<tr><td>ムアルデヒド溶液4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496</td><td>CAS:50-00-0、注意</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>-20°Cで保存。C、在庫10 mM、10000x</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNAポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>-20°Cで保存;C</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>VWR 化学薬品</td><td>10047105</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>4 °C で保存;C、100x</td></tr><tr><td>Histocore HおよびC、組織包埋装置</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>Meidax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒト核小体抗原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 5 N</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>10605882</td><td>CAS: 7647-01-0, 注意</td></tr><tr><td>過酸化水素 30%</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS:7722-84-1、注意</td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B-金</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>100 mg/&micro の在庫;L, 1000x</td></tr><tr><td>Hygromycin resistance cassette-containing plasmid</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td><td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 25 mM</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>ミクロトーム RM2235</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midiprep DNA アイソレーション キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep DNA アイソレーション キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィック K210003 <td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A9165</td><td>-20 °C で保存;C、ストック500 mM、400x</td></tr><tr><td>NEPA21エレクトロポ</td><td>レーターNepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>-20 &degで保存。C、1Mでストック、100x</td></tr><tr><td>NOD Scid Gamma(NSG)マウス</td><td>Hubrecht InstituteコロニーNoggin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンディショニング培地</td><td>U-Protein Express</td><td>カスタムオーダー</td><td>ストア-20&deg;C</td></tr><tr><td>ノルアドレナリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A7257</td><td>-20 °C;C、100 mMのストック</td></tr>オーブン<tr><td></td><td>メモリ</td><td></td><td>58°Cに設定。C</td></tr><tr><td>P20、P200、P1000ピペット</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィン</td><td>VWR化学薬品</td><td>10048502</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット、ガラス栓</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_R:TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>-20 °C で保管。C</td></tr><tr><td>パーテックス</td><td>クリニパス</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000X、-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>-20 °で保管。C、ストック 10 mM、10000x</td></tr><tr><td>シャーレ、10 cm</td><td>Greiner</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Q5 バッファー</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 抽出ソリューション</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>ストア アリコート-20 >C</td></tr><tr><td>R-spondin 3 Conditioned medium</td><td>U-Protein Express</td><td>カスタムオーダー</td><td>-20 >C</td></tr><tr><td>sgRNAリバースプライマー:TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTTTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>接着剤、ア</td></tr><tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS:26628-22-8、注意</td></tr><tr><td>シトリン酸ナトリウム二水和物</td><td>J.T. Baker</td><td>0280</td><td>CAS:6132-04-3</td></tr><tr><td>Standard Forward Primer: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サブクローニング効率コンピテントセル DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>浮遊細胞培養プレート (24ウェル)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24ウェル</td></tr> 浮<tr><td>遊細胞培養プレート (12ウェル)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665102</td><td>12ウェル</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td>Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water</td></tr><tr><td>Transposase-containing plasmid</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>U6_Forwardプライマー: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS: 1330-20-7, CAUTION</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>-20 >C、10 mM、1000倍でストック</td></tr></tbody></table>

マウスおよびヒト涙腺オルガノイドの樹立、維持、分化、遺伝子操作、移植

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

涙腺は、眼表面の恒常性に不可欠な器官です。涙液膜の水性部分を生成することにより、乾燥ストレスや外部からの侮辱から目を保護します。涙腺(病態)生理学については、適切な in vitro モデルがないため、ほとんど知られていません。オルガノイド技術は、複数の臓器にとって有用な実験プラットフォームとしての地位を証明しています。ここでは、涙腺生検から始まるマウスとヒトの涙腺オルガノイドを確立および維持するためのプロトコルを共有します。培養条件を変更することで、涙腺オルガノイドの機能を高めます。オルガノイドの機能は、涙腺オルガノイドを選択された神経伝達物質にさらして内腔の涙液放出を引き起こす「泣く」アッセイによって調べることができます。この現象を画像化して定量化する方法を説明します。涙腺恒常性における目的の遺伝子の役割を調べるために、これらを遺伝子組み換えすることができる。ガイドRNA設計からオルガノイドクローンジェノタイピングまで、ベースエディターを使用して涙腺オルガノイドを遺伝子改変する方法を徹底的に説明します。最後に、ヒト涙腺オルガノイドの再生能をマウスへの同所性移植により調べる方法を示します。この包括的なツールセットは、マウスとヒトの涙腺オルガノイドを使用して涙腺(病態)生理学を研究するためのリソースを提供します。

マウスの涙腺の解剖(図2A)に続いて、酵素的および機械的消化により小さな組織断片が生成され、その中で腺房と管を区別することができました(図2B)。残りの大きな組織片はECMを不安定にし、初期のオルガノイドの成長を減少させます。マウスの涙腺オルガノイドの誘導は、オルガノイドが分割できる段階である~7日後に~500 μmの嚢胞性オルガノイドが見つかったときに成功しました(図2C)。全体的なオルガノイド誘導が成功したとしても、一部のオルガノイドは最終的に停止する前に成長し始める可能性があります。ヒト涙腺オルガノイドは、3〜4日以内に嚢胞として成長し、組織分離後10〜14日で完全に成長したサイズに達しました(図2D)。マウスとヒトの両方で、オルガノイドの誘導が失敗し、オルガノイドがまったくまたはほとんど成長しないことがありました。これは一般的に組織の過剰消化によって引き起こされました。マウスの涙腺オルガノイドは少なくとも40倍、ヒトオルガノイドは少なくとも20倍継代することができました。継代は、オルガノイドの成長に応じて、平均して7〜10日ごとに行われました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> 図2:マウスとヒトの涙腺オルガノイドの樹立。 (A)マウス涙腺解離のさまざまな段階の写真。矢印は、その保護膜の下の涙腺を指しています。(B)組織消化直後のマウス涙腺細胞の明視野画像で、挿入図には腺房と管が示されています。(C)マウス涙腺オルガノイド誘導の成功と失敗の明視野画像。(D)14日間のヒトオルガノイド成長の明視野画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
涙腺オルガノイドは、増殖培地で培養すると幹細胞を多く含みます。分化レベルを高めるために、成長因子含有量を減らしたマウスとヒトの分化培地をセットアップしました。5日後および7日後、それぞれ、分化培地において、マウスおよびヒトの涙腺オルガノイドはより密度が高くなった(図3A-B)。この形態学的変化は、機能特性の増加と相関していました。サイクリックAMPアクチベーターフォルスコリンまたは神経伝達物質ノルエピネフリンを適用すると、3時間以内にオルガノイドの腫脹(すなわち、頂端水分分泌)がもたらされました(図3C)。腫脹が3〜4時間以上かかった場合、これはオルガノイドが十分に分化していないか、および/または神経伝達物質の受容体などの機能マーカーを発現していないことを示唆しました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> 図3:マウスとヒトの涙腺オルガノイドの分化とヒトオルガノイドの機能的腫脹アッセイ。 (A)マウス涙腺オルガノイドを増殖培地で7日間培養し、分化培地で2日間培養した後、増殖培地で2日間培養したマウス涙腺オルガノイドの明視野画像。(B)拡大培地で11日間培養し、分化培地で2日間増殖培地で2日間培養したヒト涙腺オルガノイドの明視野画像。(C)新鮮な分化培地(コントロール)、1 μMフォルスコリン、および100 μMノルエピネフリンに3時間にわたって曝露された分化したヒト涙腺オルガノイドの明視野画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
マウス涙腺オルガノイド中のPax6をノックアウトするために、選択したPax6標的化gRNAを含むプラスミドをPCRおよびライゲーションにより作製した(図4A)。このgRNA含有プラスミドを、Piggy-Bacプラスミド(ハイグロマイシン耐性トランスポゾン含有およびトランスポザーゼ含有プラスミド)およびC &gt; T塩基エディターCas9とともにマウス涙腺オルガノイドに解離させて単一細胞にエレクトロポレーションした。3日後、オルガノイドが回復したとき、それらをハイグロマイシンに曝露し、ハイグロマイシン耐性カセットを組み込んだクローンについて選択した。エレクトロポレーションの成功では、ハイグロマイシンに耐性のあるオルガノイドが成長しました(図4B)。~300 μmを超える成長中のオルガノイドクローンを、理想的には自発的に分化し始める前にピックしました(図4C)。DNAは、オルガノイドの一部から抽出され、残りは培養中に保持されました。gRNAによって標的とされたPax6遺伝子座のPCR増幅により、選択された各クローンについて367 bpバンドが得られました(図4D)。増幅遺伝子座を配列決定した後、ホモ接合的にC&gt;T編集されたクローン(n=1)を保持した。一方、編集されていないクローン(n = 4)、ヘテロ接合的に編集されたクローン、または誤って編集されたクローン(n = 1)は破棄されました(図4E)。全体として、Pax6を標的とするこのgRNAを用いて、配列決定された6個のうち1個のホモ接合型ノックアウトマウス涙腺クローンが得られた。一部のクローンはよく成長しましたが、一部のオルガノイドクローンはピッキング後に失われたり、分化し始めたりしました(図4F)。選ばれた10個のオルガノイドクローンのうち、7個は順調に成長しました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> 図4:マウス涙腺オルガノイドにおけるPax6の塩基編集を介したノックアウト。 (A)Pax6遺伝子座を標的とするgRNAが正しく統合された後のpFYF1320のサンガーシーケンシングトレース。(B)エレクトロポレーション後のハイグロマイシン曝露後5日後のマウス涙腺オルガノイドの明視野画像。オルガノイドをマウス増殖培地で培養した。左側はエレクトロポレーションの失敗例で、ハイグロマイシンに耐性のあるクローンは成長していません。右側はエレクトロポレーションの成功例で、いくつかのハイグロマイシン耐性オルガノイドクローンが生き残っています。(C)選択すべきクローンと選択すべきでないクローンの明視野画像。(D)gRNAを標的としたPax6遺伝子座の増幅を示すアガロースゲル。緑色では、予想されるサイズの 367 bp のバンドが強調表示されます。(E)ハイグロマイシンに耐性を示した3つのオルガノイドクローンのサンガーシーケンシングトレース。一番上のクローンは未編集です。真ん中のクローンはホモ接合性のC &gt; T版であり、したがってホモ接合型のノックアウトです。一番下のクローンは、2つのヘテロ接合点突然変異を示し、ヘテロ接合型ノックアウトまたは混合クローンのいずれかであり、誤って編集されています。(F)さまざまなレベルの成長を伴うピックされたオルガノイドクローンの明視野画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
最後に、マウスにヒト涙腺オルガノイド同所移植を行うために、3日前に分割したオルガノイド(直径&lt;100μm)を用いた。オルガノイドの生着は、マウス涙腺にオルガノイドを注入してから1ヶ月後にヒト特異的マーカーであるヒト核小体抗原について染色することにより確認した(図5)。マウスの涙腺のすべてのセクションからの点状染色の欠如は、ヒトオルガノイド生着の欠如を意味していました。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> 図5:ヒト涙腺オルガノイドのマウス涙腺への移植。 移植後1ヶ月の生着を監視するためのヒト核小体マーカーに対する移植マウス涙腺の染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:培地および緩衝液の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、初代マウスおよびヒト組織に由来する涙腺オルガノイドを確立、維持、遺伝子改変、分化、機能的に特徴付け、および移植する方法を説明しています。

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

涙腺オルガノイドを使用すると、特定の遺伝子が涙腺の恒常性をどのように制御しているかを調べることができます。さらに、オルガノイドは再生医療にも使用できます。成体幹細胞由来の涙腺オルガノイド技術の主な利点は、健康で形質転換されていない涙腺上皮細胞の成長と研究を可能にすることです。これらのオルガノイドは、最終的にはドライアイ疾患患者の治療に使用される可能性があります。実験に必要な培地と材料を準備することから始め、実験の前に消化培地のすべての成分を組み合わせることから始めます。この培地でメスを事前に濡らして、組織片がメスに付着しないようにします。培地からマウスの涙腺組織を取り出し、それをペトリ皿に入れ、事前に湿らせたメスを使用してミンチします。組織片が0.5立方ミリメートル未満になったら、メスでペトリ皿からそれらをこすり落とし、消化媒体を含む15ミリリットルのチューブに移します。非常に小さな人間の生検の場合は、ミンチせずに消化培地に直接入れます。組織片を有する15ミリリットルのチューブを摂氏37度の水浴中で最大15分間インキュベートする。それまでの間、炎の中でパスツールピペットチップを細くし、ベース培地で事前に湿らせます。解離プロセスを容易にするために、事前に湿らせて狭めたパスツールピペットで、ミンチ混合物を5分ごとに上下にピペットで行います。顕微鏡下で多くの単一細胞と小さな塊が見える場合は、10ミリリットルのベース培地を加えて解離を停止します。400gで5分間スピンダウンした後、上清を除去し、ペレットを10ミリリットルのベース培地に再懸濁し、細胞にペレットダウンして洗浄を繰り返した。細かく刻んだ混合物を70マイクロメートルのストレーナーでろ過することにより、大きくて未消化の組織片と残りのコラーゲン繊維を取り除きます。溶出液を400gで5分間回転させます。上清を除去した後、気泡を発生させずに、100マイクロリットルの冷たい細胞外マトリックス(ECM)に細胞ペレットを再懸濁し、単一のマウス涙腺の場合は50マイクロリットルの冷たいECMに、ヒト生検の場合は50マイクロリットルを再懸濁します。P200を使用して、12ウェル懸濁プレートのウェルあたり最大100マイクロリットルの細胞を播種し、ウェル内に約20マイクロリットルの液滴を作ります。プレートを逆さまにして、摂氏37度の加湿インキュベーターに20〜30分間置き、ECMを固化させます。ECMが固まったら、12ウェルプレートのウェルあたり約1ミリリットルの室温マウス増殖培地を追加します。涙腺オルガノイドによる分泌を誘導する個々の成分を含む1ミリリットルのヒト分化培地を新たに調製する。自動明視野タイムラプス顕微鏡で、プレート内で画像化する位置、5分の時間間隔、および4時間の持続時間を設定します。ECM液滴全体が各位置に表示されていることを確認します。イメージングを開始する前に、顕微鏡からプレートを動かさずにイメージングするウェルから培養液を取り出し、フォルスコリンやノルアドレナリンなどの化合物を含む、新しく調製した十分に再懸濁したヒト分化培地と交換します。陰性対照として、分化培地をリフレッシュしたウェルが挙げられる。顕微鏡の実行ボタンをクリックし、4時間後に結果を分析します。本文に記載されているようにオルガノイドを解離した後、上清を廃棄します。細胞を80マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーに再懸濁します。1.5ミリリットルのチューブで、実験に必要なプラスミドを調製します。プラスミドを細胞に加え、上下にピペッティングしてよく混ぜます。ポアリングパルスとトランスファーパルスのパラメータを使用してエレクトロポレーターをセットアップします。プラスミドを含む細胞をエレクトロポレーションキュベットに入れます。0.3アンペアから0.55アンペアの間の抵抗をすぐに測定し、すぐにエレクトロポレーションします。完了したら、細胞を1.5ミリリットルのチューブに移し、Rhoキナーゼ阻害剤を添加した400マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーを追加します。細胞を室温で30分間回復させます。次に、細胞を500gで5分間ペレット化します。上清を廃棄した後、細胞を200マイクロリットルのECMにプレートします。固化後、マウス膨張培地を追加します。オルガノイドの調製は、移植日の約3日前にヒト涙腺オルガノイドを分割します。ECMからオルガノイドを抽出するには、培養液にディスパーゼを加えて最終濃度0.125単位/ミリリットルに到達し、P1000を使用してECM液滴を完全に再懸濁して破壊します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間戻します。オルガノイドを10ミリリットルのベース培地に再懸濁して、酵素を洗い流します。細胞を400gで5分間ペレット化した後、5%ECMを添加した50マイクロリットルの低温ヒト増殖培地に再懸濁します。オルガノイド懸濁液を氷上に置き、直ちに移植に進む。マウスの同所性移植では、オルガノイド懸濁液をインスリン針で吸引します。マウスが眠っているときは、主涙腺にアクセスできるようにすばやく横に置きます。5マイクロリットルのオルガノイド懸濁液を皮膚から直接涙腺に注入します。マウスを回復させ、移植関連の不快感の存在を毎日、特に目に評価します。マウスの涙腺の解剖に続いて、酵素的および機械的消化により、腺房および管を含む小さな組織断片が生成されました。マウス涙腺オルガノイド誘導に成功し、7日後に直径約500マイクロメートルの嚢胞性オルガノイドが見つかった。ヒト涙腺オルガノイドは3〜4日以内に嚢胞として成長し、組織分離後10〜14日で完全に成長したサイズに達しました。分化培地中でそれぞれ5日後および7日後、マウスおよびヒトの涙腺オルガノイドはより密度が高くなった。サイクリックAMP活性化剤フォルスコリンまたは神経伝達物質ノルエピネフリンを適用すると、3時間以内にオルガノイドが腫れました。エレクトロポレーションが成功すると、ハイグロマイシンに耐性のあるオルガノイドが成長しました。300マイクロメートルを超える成長中のオルガノイドクローンは、分化前にピックされました。ガイドRNAによって標的とされたPax6遺伝子座のPCR増幅は、選択されたすべてのクローンに対して367塩基対バンドをもたらした。配列決定した6個のうち1個のホモ接合型ノックアウトマウス涙腺クローンを、Pax6を標的とするガイドRNAを用いて得た。一部のクローンは順調に成長しましたが、一部のオルガノイドクローンは摘み取った後に失われたり、分化し始めました。選ばれた10個のオルガノイドクローンのうち、7個は順調に成長しました。オルガノイドの生着は、マウス涙腺にオルガノイドを注入してから1ヶ月後に、ヒト特異的マーカーであるヒト核小体抗原について染色することにより確認した。注意すべきことの1つは、組織やオルガノイドを過剰に消化しないことです。そうしないと、細胞が死滅する可能性があり、オルガノイドの確立率が低下します。涙腺オルガノイドは組織学によって分析することができます。そうすることで、細胞組成の洞察を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

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マウスおよびヒト涙腺オルガノイドの樹立、維持、分化、遺伝子操作、移植

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