複数の小生物からの自動マルチモーダル刺激と同時神経記録
March 3rd, 2023
我々は、多くの カエノラブディティス・エレガンス 線虫からの同時神経活動の柔軟な化学的およびマルチモーダル刺激および記録のための方法を提示する。この方法は、マイクロフルイディクス、オープンソースのハードウェアとソフトウェア、および教師ありの自動データ分析を使用して、適応、時間的抑制、刺激クロストークなどの神経現象の測定を可能にします。
神経反応は脳活動への洞察を与えますが、実験や個人によって異なる可能性があります。このプロトコルは、刺激の記録と分析を自動化し、さまざまなタイプとパターンの刺激のプログラミングを簡素化するのに役立ちます。自動化された技術により、複数のニューロンと生物を同じマイクロ流体フォーマットで並行して記録することができます。
これにより、記録の再現性が向上し、集団間のニューロンの多様性を調査できるようになります。適応や感覚統合などの神経現象を明らかにするには、さまざまな刺激パターンが必要です。この方法は、細胞やオルガノイドから生物や植物への他の動的シグナルに一般化できます。
まず、顕微鏡の電源を入れ、プライミングシリンジを使用してリザーバーチューブから気泡を充填および除去し、次に流出チューブにバッファーを充填します。マイクロ流体デバイスを真空デシケーターから取り外します。デバイスを顕微鏡に置き、出口チューブをすばやく挿入します。
出口シリンジをそっと押して、液滴が入口から出てくるまでデバイスに液体を注入します。この液滴が出現した入口で、ドロップツードロップ接続を使用して対応する流体入口チューブを挿入し、気泡の導入を避けるために入口チューブとデバイス舷窓の両方に液滴が存在することを確認します。次のインレットチューブを次の液滴に接続します。
必要に応じて出口からさらに液体を注入し、すべての入口が満たされるまで繰り返します。未使用のインレットとウォームローディングポートに固体ブロッキングピンを挿入します。画面上のフローをチェックして、フローが目的の方向に進むことを確認します。
バルブコントローラーのバルブ1をフリップし、マイクロ流体アリーナに流れ込む刺激流を観察します。流量のバランスが崩れている場合は、リザーバーの高さを調整します。ワイヤーチップピックを使用して、播種されていない線虫増殖培地またはNGM寒天プレートに若年成体動物を移し、動物が泳ぐことができるように、プレートに約5ミリリットルの1つのXS基礎バッファーを浸します。
1つのXS基礎バッファーが事前に充填された付属のチューブを使用して、ワームを1〜3ミリリットルのローディングシリンジに引き込みます。ステレオスコープを使用して、片手で液面下のチューブを目的の動物に移動し、もう一方の手に保持されたシリンジを使用してチューブに引き込みます。出口の輪郭を閉じ、ワームローディングピンを取り外し、ドロップツードロップ接続を使用してウォームローディングシリンジをデバイスに接続します。
次に、動物をアリーナにそっと流します。バッファーフローを確立し、テトラミソールによる固定化に最大1時間待ちます。テキストエディタを使用して、ユーザー定義取得設定という名前の刺激定義テキストファイルを作成します。
自動画像取得のための刺激設定を含むtxt。このファイルは、露光と励起のタイミング、試行期間、間隔、保存ディレクトリなどの顕微鏡取得パラメータを定義します。また、実験タイプと刺激タイミングの設定も定義します。
1回の刺激実験では、刺激コマンドを1回だけ繰り返すフォーマットを使用します。マルチパターン実験では、刺激パターンの順序を表す数字のパターンシーケンスを含めることにより、複数の刺激コマンドを含む形式を使用します。パターンごとに、刺激コマンドを別々の行に入力します。
次に、顕微鏡制御ソフトウェアを実行します。すべての流体入口が開いていること、アリーナ内で流れが望まれていること、および目的のニューロンがライブウィンドウ内で焦点を合わせていることを確認します。次に、ライブウィンドウを閉じて、スクリプトを実行します マルチパターン実行スクリプト。
ソフトウェア内のbsh。データを分析するには、プラグインを順番にクリックし、次に追跡し、次にニューロトラッカーを実行して、ニューロトラッカーを実行します。追跡するtiffビデオファイルを含むフォルダーを選択し、処理するファイルの範囲を選択します。
次に、画像メニューと調整メニューを使用して、明るさのコントラストとしきい値の制御ウィンドウを開きます。暗い背景を確認し、しきい値ウィンドウで範囲をリセットせず、しきい値の方法をデフォルトに設定し、視覚化を赤に設定します。次に、明るさのコントラストウィンドウで[自動]をクリックして、ニューロンを可視化します。
明るさのコントラスト ウィンドウで、ニューロンが明確に区別できるまで、最小スライダーと最大スライダーを調整します。次に、すべてのニューロンが他のオブジェクトから分離された小さな赤い斑点として表示されるまで、しきい値レベルを調整します。フレームスライダーを調整してニューロンの動きと強度の変化を観察し、他の動物との重複など、追跡から除外する動物に注意を払います。
追跡するニューロンを特定した後、必要に応じて各動物の閾値レベルを調整し、ニューロンの上の赤い閾値領域がすべてのフレームに表示されるようにします。ニューロンをクリックして、その位置としきい値レベルを記録します。すべてのニューロンを選択したら、スペースバーを押して追跡を開始します。
各動物の追跡プロセスを監視し、必要な修正を行います。ニューロトラッカーが一時停止すると、ニューロンが失われます。必要に応じてしきい値レベルを調整し、ニューロンを再度クリックします。
統合ボックスが近くの別の動物または非ニューロン構造にジャンプする場合は、スペースバーを押して一時停止します。スライダーを最初の誤ったフレームに戻し、正しいニューロンの位置を再度クリックします。ニューロトラッカーを実行します概要pdf。
mファイルをMATLABに保存し、ニューロトラッカーデータテキストファイルを含むフォルダを選択します。サマリー PDF が生成されるのを待ち、追跡プロセスの検証が可能になります。動物は、各動物および試験からの番号および神経反応によって識別することができ、集団変動性を評価するために観察することができる。
関数データブラウズを使用します。mは、試行番号、動物番号、刺激パターン、または別のカテゴリによってグループ化されたニューラルデータを探索する。時間的抑制現象は、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂い物質パルスからなる8つのパターンを生成するペアパルス実験でテストされました。
最初の1秒間の匂いパルスは、ジアセチル検出AWAニューロンにおいて等しい応答の大きさを誘発し、第2パルスにおける応答は刺激間間隔によって変化した。ジアセチル刺激への適応が観察されたキャッチトライアル実験により脱抑制を評価したが、新規2-メチルピラジン刺激の提示は強い脱抑制効果を誘発しなかった。テストされたマルチモーダル刺激は、化学的刺激のみが適応を引き起こすのに対し、光刺激のみでは適応を引き起こさないことを明らかにした。
しかし、組み合わせたマルチモーダル刺激パターンは、光原性応答が化学的に誘発された適応の影響を受けやすいことを示しました。マイクロ流体設計を変更して2つのアリーナを含めることで、遺伝的またはその他の摂動を、一致する参照と同時に比較できます。セットアップが完了すると、システムはさまざまな方法で変更できます。
例えば、化学物質の線量反応や、睡眠状態と覚醒状態の間などの神経活動の状態依存的な変化を自動的に測定しました。
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概要
この研究は、ミクロ流体力学と自動化されたデータ分析を用いて、ショウジョウバエの化学的および多様な刺激と神経活動の記録の方法を提示します。この手法により、複数の生物の信号反応を同時に測定することで、適応や時間的抑制などの神経現象の検討が可能になります。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- ミクロ流体力学
- 行動分析
背景
- 神経反応は脳活動に関する洞察を提供しますが、個人や実験によって異なります。
- 神経記録の反復性を向上させる自動化された方法が必要です。
- この研究は刺激のプログラミングと神経反応の分析を簡素化することにより、ミクロ流体力学の枠組み内で多細胞神経記録を容易にすることを目指しています。
研究の目的
- ショウジョウバエにおける神経活動の刺激、記録、分析を自動化する。
- 個体群間の神経の変動性を探索し、データの反復性を向上させる。
- 多様な刺激パターンを通じて重要な神経現象を明らかにする。
使用された方法
- この研究では、同時刺激と記録のためのミクロ流体プラットフォームを利用しています。
- 神経メカニズムの探索のための生物モデルとしてショウジョウバエを使用しています。
- 自動化された技術により、データ分析プロセスが効率化され、データの整合性が向上します。
- 重要なステップには、ミクロ流体デバイスの準備と刺激パラメータの定義が含まれます。
- 分析は、神経活動の追跡と要約のために設計されたソフトウェアを通じて行われます。
主要な結果
- この方法は、様々な刺激パターンに対する神経反応を評価するための信頼できる手段を提供します。
- 結果は、時間的抑制が神経活動にどのように現れるかを示し、その機能性を支持しています。
- データ分析により、個々のニューロンとその試行にわたる反応を追跡することができます。
- このアプローチは、ニューロンレベルでの感覚統合と適応の理解を深めます。
結論
- この研究は、単純な生物の神経メカニズムを調査するための多目的なツールを確立しました。
- 自動化された方法により、個体群ダイナミクスと神経反応の効率的な分析が可能になります。
- この研究は、刺激に対する神経可塑性と行動の理解を進めるための意味を持っています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Automated multimodal stimulation and parallel neuronal recording in small organisms addresses the challenge of biological variability and throughput in early discovery neuroscience. This platform enables high-content, quantitative assessment of neural function across populations, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at the target validation stage. Its scalability and flexibility position it as a reusable capability for portfolio-wide interrogation of neural dynamics and adaptation phenomena.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of neural adaptation, inhibition, and sensory integration across multiple individuals.
- Supports functional target validation by quantifying neural responses to diverse, programmable stimuli.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing population-level variability and state-dependent neural dynamics.
- Provides a platform for comparative studies of genetic or pharmacological perturbations in parallel arenas.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, repeatable stimulation protocols for robust assay development.
- Generates quantitative, population-wide neural activity readouts suitable for downstream screening workflows.
- Enables rapid evaluation of compound or genetic effects on neural excitability and adaptation.
- Supports scalable, automated data acquisition and analysis for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Allows exploration of state-dependent neural responses relevant to disease modeling and biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying functional neural endpoints in relevant biosystems.
Pipeline & Workflow Integration
This automated platform integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neural circuits and adaptation mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative neural activity assays for compound or genetic screening.
- Analytics: Delivers population-level and single-neuron quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of neural response phenotypes with disease-relevant or state-dependent endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to diverse small biosystems and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes stimulation and recording workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust, parallelized data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neural targets and mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, fluorescence imaging, and neural data analysis.
- Depends on instrumentation for automated microscopy and programmable stimulus delivery.
- Needs cross-team standardization of data acquisition and analysis protocols.
- Adaptable to various small organisms, cells, or organoids with appropriate genetic indicators.
- Manual oversight may be needed for data quality control and tracking adjustments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Microfluidic Device Preparation
2:04
Animal Loading
3:02
Automated Stimulation and Neuronal Recording
4:15
Data Analysis Using NeuroTracker
6:08
Data Exploration and Visualization
6:47
Results: Assessment of Temporal Inhibition, Disinhibition, and Multimodal Stimulation
7:51
Conclusion
