Name: 複数の小生物からの自動マルチモーダル刺激と同時神経記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶCaenorhabditis elegansの自動マルチモーダル刺激と神経記録法。マイクロ流体デバイスを用いて複数個体の神経活動を同時に測定し、適応や時間的抑制などの神経現象を解析します。

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これらのプロトコルをテストし、原稿をレビューしてくれたFox Avery と、プログラミングの支援をしてくれた Eric Hall に感謝します。ここに提示された方法のための資金は、全米科学財団1724026(D.R.A.)によって部分的に提供された。

<ol><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008(2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li>
<li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li>
<li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217(2018).</li>
<li>Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li>
<li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026(2017).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li>
<li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Cohen, R. A. Temporal Inhibition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+RA+%22Encyclopedia+of+Clinical+Neuropsychology%22">Encyclopedia of Clinical Neuropsychology</a>. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).</li>
<li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+during+sleep%2Fwake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532(2022).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+microscope+control+using+%C2%B5Manager+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10(2014).</li>
<li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis%2C+microscopy%2C+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li>
<li>NeuroTracker. GitHub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022).</li>
<li>NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li>
<li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids%3A+Advances%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074(2019).</li>
<li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+synaptic+signaling%2C+regulation%2C+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234(2017).</li>
<li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

このプロトコルでは、さまざまな刺激パターンの時間的に正確な配信を使用して神経活動現象を評価するためのオープンアクセス顕微鏡システムについて説明します。マイクロ流体プラットフォームは、数十匹の動物を顕微鏡の視野に保ちながら、再現性のある刺激を提供します。さまざまな刺激タイミングパターンを簡単にプログラミングできる市販の顕微鏡ソフトウェアパッケージはほとんどなく、各パターンや独自のファイル形式を手動で入力する必要があることがよくあります。対照的に、実験は、コンピュータ生成することができ、分析ソフトウェアによって読み取ることができるテキストファイルによってこのシステムで定義される。ここでは、マルチモーダル刺激中の時間的抑制、適応、クロストークなどの神経現象を評価するために、可変刺激パターンを採用することの有用性を示します。データ分析パイプラインは、大規模な顕微鏡ビデオファイルを、集団変動(図5B)、経時的な変化(図7Cおよび図8C、D)、および摂動後の変化(<strong class...

カルシウムイメージング技術は、蛍光顕微鏡および標的細胞で発現される遺伝的にコードされたカルシウム指示薬を使用して、in vivo神経ダイナミクスの非侵襲的記録を可能にしました1,2,3。これらのセンサーは通常、GFP-カルモジュリン-M13ペプチド(GCaMP)ファミリーなどの緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用して、ニューロンの活性化と細胞内カルシウムレベルの上昇時に蛍光強度を増加させます。カルシウムイメージングは、線虫C.エレガンスにおいて、ニューロンおよび神経回路が生きた行動動物4,5,6,7,8,9,10においてどのように機能するかを調べるために特に強力であり、その透明な性質は光学的アクセスのための外科的プロセスが不要であり、細胞特異的遺伝子プロモーターは目的の細胞への発現を標的とする。これらの技術は、多くの場合、マイクロ流体デバイスを利用し、正確に制御された環境を提供して、生物学的、化学的、および物理的現象を小さな物理的スケールで研究します11,12。神経活動を測定するためのマイクロ流体デバイスは豊富にあり、新しいデザインが継続的に開発されており、研究室で容易に製造できます。ただし、多くの設計では一度に1匹の動物をトラップするため、実験スループットが制限されます7、9、13。神経反応は、以前の経験、ストレスや空腹などの内部状態、または遺伝子発現レベルなどの確率的要因の違いにより、動物によって大きく異なることがよくあります。これらの違いは、多くの動物を同時に刺激して観察し、個体から情報を抽出することができる方法の必要性を確立します4。
さらに、特定の神経調節現象は、刺激が急速に連続して発生したときの応答の短時間の抑制を指す時間的抑制14などの特定の刺激条件下でのみ明らかになる。電気生理学的システムは、この目的のために、例えば、電気パルス電流、電圧、周波数、波形、デューティサイクル、および周期的な刺激列のタイミングを変調して、広い刺激空間にわたって神経活動を駆動することができる。自然に検出された刺激または光遺伝学的システムによる間接刺激は、同様の幅の制御メカニズムの恩恵を受けるでしょう。現在、多くの自然な刺激は、柔軟性を追加するのが遅い商用システムを使用して、匂いの提示や除去などの単純な「オンオフ」の方法で提示されます。しかし、安価なマイクロコントローラは、研究者のニーズに合わせてカスタマイズ可能な方法で、いくつかのタイプの刺激の送達を自動化できるようになりました。マイクロフルイディクスと組み合わせることで、これらのシステムは実験スループットと柔軟性の向上という目標を達成し、さまざまな正確な刺激に対する神経応答を多くの動物で同時に測定できるようになりました4,6。マルチモーダル刺激は、薬物曝露などの直交摂動の前、最中、および後に一貫して刺激するときの神経興奮性の変化を監視することなどによって、ニューロン回路をさらに調べるために使用することができる4。安価でオープンな顕微鏡システムの利点は、科学研究を進める上で明らかですが、実際には、部品の調達、構築、および性能検証の必要性がこれらの技術の採用を妨げる可能性があります。
このプロトコルは、これらの技術的課題のいくつかを軽減することを目的としています。以前のプロトコルはマイクロ流体デバイスの使用と基本的な刺激に焦点を当てていました9、15、17、ここでは、前述のマイクロ流体デバイスを利用するC.エレガンスまたは他の小さな生物における神経イメージングのための柔軟で自動化されたマルチモーダル刺激送達システムの構築と使用について説明します4。オープンソースシステムは、実験を定義するために単純なテキストファイルを介してプログラムされ、NeuroTrackerデータ分析プログラムは、顕微鏡ビデオから神経活動データを半自動的に抽出します。光遺伝学的光感受性イオンチャネル5,6を発現する際に、異なる食品の匂いに応答して、または光に応答して脱分極する化学感覚ニューロンAWAを使用して、時間的抑制、脱抑制、および刺激クロストークを評価する例を使用して、このシステムを実証します。

<table><tbody><tr><td>細菌株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.&nbsp;coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>Cat# OP50</td><td></td></tr><tr><td>Experimental models: Organisms/strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C.&nbsp;目的のニューロンでGCaMP(およびオプションでクリムゾン)を発現するelegans</td>株<td>Caenorhabditis Genetics Center(CGC)または発表された研究</td><td>NZ1091</td>の責任著者、例えば<td></td></tr><tr><td>Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B85307</td><td>diacetyl、例刺激物</td></tr><tr><td>塩化カルシウム、CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C3881</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン、ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# F6377</td><td></td></tr><tr><td>ガラス撥水剤</td><td>Rain-X</td><td>Cat #800002250</td>ガラス<td>疎水性処理(使い捨て)</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム、MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# M2393</td><td></td></tr><tr><td>線虫増殖培地(NGM)寒天</td>ジェ<td>ネシー</td><td>猫#:20-273NGM</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(60&nbsp;mm)</td><td>Tritech</td><td>Cat #T3305</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ジメチルシロキサン) (PDMS): Sylgard 184</td><td>Dow Chemical</td><td>Cat# 1673921</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P8281</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S7653</td><td></td></tr><tr><td>(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)トリクロロシラン(TFOCS)</td><td>Gelest</td><td>CAS#78560-45-9</td><td>ガラス疎水性処理(耐久性)</td></tr><tr><td>ソフトウェアとアルゴリズム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino IDE</td><td>Arduino</td><td>https://www.arduino.cc/en/software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td></td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>マイクロマネージャー</td><td>https://micro-manager.org/</td><td></td></tr> <tr><td>顕微鏡制御ソフトウェア</td><td>Albrecht Lab</td><td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td><td></td></tr><tr><td>Neurotracker データ解析ソフトウェア</td><td>Albrecht Lab</td><td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td><td></td></tr><tr><td>自動顕微鏡および刺激システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.A1落射蛍光用にセットアップされた倒立顕微鏡(GFPフィルターキューブ、5倍、対物レンズまたは同等)</td><td>Zeiss</td><td>Cat #491237-0012-000</td><td></td></tr><tr><td>Excelitas X-cite XYLIS LEDイルミネーター</td><td>Excelitas</td><td>Cat #XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 デジタルsCMOSカメラ</td><td>浜松</td><td>猫#C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Arduino nano</td><td>Arduino</td><td>Cat #A000005</td><td></td></tr><tr><td>3方向ミニチュア直径分離弁 (LQX12)</td><td>Parker</td><td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td><td>バルブ1:制御</td></tr><tr><td>2方向ノーマルクローズ(NC)ピンチバルブ</td><td>Bio-Chem Valve Inc</td><td>Cat #075P2-S432</td><td>バルブ2:流出</td></tr><tr><td>3方向ピンチバルブ</td><td>NResearch</td><td>Cat #161P091</td><td>バルブ3:刺激選択</td></tr><tr><td>光遺伝学的刺激 LEDおよびコントローラー (615 nm)</td><td>Mightex</td><td>Cat #PLS-0625-030-S および #SLA-1200-2</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 8.2 デジタル/手動バルブコントローラー</td><td>AutoMate Scientific</td><td>Cat #01-18</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤーおよびコネクタ</td><td>各種</td><td>Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)</td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic Device Preparation</td> <td>の図2を参照してください。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドレメル可変速ロータリーカッター4000&nbsp;</td><td>ドレメル</td><td>キャット #F0134000AB</td><td>ガラスを切断するために速度を5k RPMに設定</td></tr>ド<tr><td>レメルドリルプレス回転工具ワークステーション</td>ド<td>レメル</td><td>キャット#220-01</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドドリルビット</td><td>ドレメル</td><td>キャット#7134</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス、1&nbsp;mm厚</td><td>VWR</td><td>Cat #75799-268</td><td></td></tr><tr><td>ガラススクライブ(ダイヤモンドスクライバー)</td><td>Ted Pella</td><td>Cat #54468</td><td></td></tr><tr><td>ルアー3ウェイストップコック</td><td>コールパーマー</td><td>Cat #EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>ルアー23 G鈍針</td><td>VWR</td><td>Cat #89134-100</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体デバイス</td><td>この記事に関連するCADファイルから著者または製作</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体デバイスクランプ</td><td>ワーナーインスツルメンツ(または機械工場)</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体チューブ、0.02&プライム;ID</td><td>コールパーマー</td><td>キャット #EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>チューブ19 g、0.5&プライム;</td><td>ニューイングランドスモールチューブ</td><td>キャット #NE-1027-12</td><td></td></tr></tbody></table>

複数の小生物からの自動マルチモーダル刺激と同時神経記録

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

蛍光遺伝暗号カルシウム指標は、個々の神経細胞レベルから脳回路全体までの神経動態の理解に大きく貢献しています。しかし、神経反応は、以前の経験、内部状態、または確率的要因によって異なる可能性があるため、一度に多くの個人の神経機能を評価できる方法が必要になります。ほとんどの記録技術は一度に1匹の動物を調べますが、広視野顕微鏡を使用して、ニューロンの記録を数十の カエノラブディティスエレガンス または他のサブミリメートルスケールの生物に一度にスケールアップすることについて説明します。オープンソースのハードウェアとソフトウェアにより、化学的、光学的、機械的、熱的、電磁的刺激など、さまざまな刺激タイプの強度とタイミングを制御する完全に自動化された実験をプログラミングする柔軟性が大幅に向上します。特に、マイクロ流体フローデバイスは、秒未満の時間分解能で化学感覚刺激の正確で再現性のある定量的制御を提供します。次に、NeuroTrackerの半自動データ分析パイプラインは、個人および集団全体の神経反応を抽出して、神経の興奮性とダイナミクスの機能的変化を明らかにします。本論文では、神経細胞の適応、時間的抑制、刺激クロストークの測定例を紹介します。これらの技術は、刺激の精度と再現性を高め、集団の多様性の探索を可能にし、細胞やオルガノイドから生物や植物全体に至るまで、小さな生物系における他の動的蛍光シグナルに一般化できます。

時間的抑制、適応、脱抑制など、さまざまな神経現象を評価する刺激パターンの例をいくつか紹介します。 時間的抑制 は、最初の提示の直後に起こる第2の刺激呈示に対する神経応答の瞬間的な抑制である14。この現象をテストするために、ペアパルス実験では、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂いパルスからなる8つのパターンが提示されました(図6B;対応する刺激制御ファイルについては 図3B を参照)。アリーナは、単一の刺激液(1.1 μMジアセチル)、バッファー、および制御フローチューブでセットアップされ、未使用の入口ポートは固体ピンでブロックされました(図6A)。バルブ1をオンにすると、制御流体が ctrl1 入口に入り、刺激がアリーナに入るように流体の流れをシフトします。バルブ1がオフの場合、制御液は Ctrl2 インレットに入り、バッファ...

我々は、多くの カエノラブディティス・エレガンス 線虫からの同時神経活動の柔軟な化学的およびマルチモーダル刺激および記録のための方法を提示する。この方法は、マイクロフルイディクス、オープンソースのハードウェアとソフトウェア、および教師ありの自動データ分析を使用して、適応、時間的抑制、刺激クロストークなどの神経現象の測定を可能にします。

Fluorescent genetically encoded calcium indicators have contributed greatly to our understanding of neural dynamics from the level of individual neurons ...

神経反応は脳活動への洞察を与えますが、実験や個人によって異なる可能性があります。このプロトコルは、刺激の記録と分析を自動化し、さまざまなタイプとパターンの刺激のプログラミングを簡素化するのに役立ちます。自動化された技術により、複数のニューロンと生物を同じマイクロ流体フォーマットで並行して記録することができます。これにより、記録の再現性が向上し、集団間のニューロンの多様性を調査できるようになります。適応や感覚統合などの神経現象を明らかにするには、さまざまな刺激パターンが必要です。この方法は、細胞やオルガノイドから生物や植物への他の動的シグナルに一般化できます。まず、顕微鏡の電源を入れ、プライミングシリンジを使用してリザーバーチューブから気泡を充填および除去し、次に流出チューブにバッファーを充填します。マイクロ流体デバイスを真空デシケーターから取り外します。デバイスを顕微鏡に置き、出口チューブをすばやく挿入します。出口シリンジをそっと押して、液滴が入口から出てくるまでデバイスに液体を注入します。この液滴が出現した入口で、ドロップツードロップ接続を使用して対応する流体入口チューブを挿入し、気泡の導入を避けるために入口チューブとデバイス舷窓の両方に液滴が存在することを確認します。次のインレットチューブを次の液滴に接続します。必要に応じて出口からさらに液体を注入し、すべての入口が満たされるまで繰り返します。未使用のインレットとウォームローディングポートに固体ブロッキングピンを挿入します。画面上のフローをチェックして、フローが目的の方向に進むことを確認します。バルブコントローラーのバルブ1をフリップし、マイクロ流体アリーナに流れ込む刺激流を観察します。流量のバランスが崩れている場合は、リザーバーの高さを調整します。ワイヤーチップピックを使用して、播種されていない線虫増殖培地またはNGM寒天プレートに若年成体動物を移し、動物が泳ぐことができるように、プレートに約5ミリリットルの1つのXS基礎バッファーを浸します。1つのXS基礎バッファーが事前に充填された付属のチューブを使用して、ワームを1〜3ミリリットルのローディングシリンジに引き込みます。ステレオスコープを使用して、片手で液面下のチューブを目的の動物に移動し、もう一方の手に保持されたシリンジを使用してチューブに引き込みます。出口の輪郭を閉じ、ワームローディングピンを取り外し、ドロップツードロップ接続を使用してウォームローディングシリンジをデバイスに接続します。次に、動物をアリーナにそっと流します。バッファーフローを確立し、テトラミソールによる固定化に最大1時間待ちます。テキストエディタを使用して、ユーザー定義取得設定という名前の刺激定義テキストファイルを作成します。自動画像取得のための刺激設定を含むtxt。このファイルは、露光と励起のタイミング、試行期間、間隔、保存ディレクトリなどの顕微鏡取得パラメータを定義します。また、実験タイプと刺激タイミングの設定も定義します。1回の刺激実験では、刺激コマンドを1回だけ繰り返すフォーマットを使用します。マルチパターン実験では、刺激パターンの順序を表す数字のパターンシーケンスを含めることにより、複数の刺激コマンドを含む形式を使用します。パターンごとに、刺激コマンドを別々の行に入力します。次に、顕微鏡制御ソフトウェアを実行します。すべての流体入口が開いていること、アリーナ内で流れが望まれていること、および目的のニューロンがライブウィンドウ内で焦点を合わせていることを確認します。次に、ライブウィンドウを閉じて、スクリプトを実行します マルチパターン実行スクリプト。ソフトウェア内のbsh。データを分析するには、プラグインを順番にクリックし、次に追跡し、次にニューロトラッカーを実行して、ニューロトラッカーを実行します。追跡するtiffビデオファイルを含むフォルダーを選択し、処理するファイルの範囲を選択します。次に、画像メニューと調整メニューを使用して、明るさのコントラストとしきい値の制御ウィンドウを開きます。暗い背景を確認し、しきい値ウィンドウで範囲をリセットせず、しきい値の方法をデフォルトに設定し、視覚化を赤に設定します。次に、明るさのコントラストウィンドウで[自動]をクリックして、ニューロンを可視化します。明るさのコントラスト ウィンドウで、ニューロンが明確に区別できるまで、最小スライダーと最大スライダーを調整します。次に、すべてのニューロンが他のオブジェクトから分離された小さな赤い斑点として表示されるまで、しきい値レベルを調整します。フレームスライダーを調整してニューロンの動きと強度の変化を観察し、他の動物との重複など、追跡から除外する動物に注意を払います。追跡するニューロンを特定した後、必要に応じて各動物の閾値レベルを調整し、ニューロンの上の赤い閾値領域がすべてのフレームに表示されるようにします。ニューロンをクリックして、その位置としきい値レベルを記録します。すべてのニューロンを選択したら、スペースバーを押して追跡を開始します。各動物の追跡プロセスを監視し、必要な修正を行います。ニューロトラッカーが一時停止すると、ニューロンが失われます。必要に応じてしきい値レベルを調整し、ニューロンを再度クリックします。統合ボックスが近くの別の動物または非ニューロン構造にジャンプする場合は、スペースバーを押して一時停止します。スライダーを最初の誤ったフレームに戻し、正しいニューロンの位置を再度クリックします。ニューロトラッカーを実行します概要pdf。mファイルをMATLABに保存し、ニューロトラッカーデータテキストファイルを含むフォルダを選択します。サマリー PDF が生成されるのを待ち、追跡プロセスの検証が可能になります。動物は、各動物および試験からの番号および神経反応によって識別することができ、集団変動性を評価するために観察することができる。関数データブラウズを使用します。mは、試行番号、動物番号、刺激パターン、または別のカテゴリによってグループ化されたニューラルデータを探索する。時間的抑制現象は、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂い物質パルスからなる8つのパターンを生成するペアパルス実験でテストされました。最初の1秒間の匂いパルスは、ジアセチル検出AWAニューロンにおいて等しい応答の大きさを誘発し、第2パルスにおける応答は刺激間間隔によって変化した。ジアセチル刺激への適応が観察されたキャッチトライアル実験により脱抑制を評価したが、新規2-メチルピラジン刺激の提示は強い脱抑制効果を誘発しなかった。テストされたマルチモーダル刺激は、化学的刺激のみが適応を引き起こすのに対し、光刺激のみでは適応を引き起こさないことを明らかにした。しかし、組み合わせたマルチモーダル刺激パターンは、光原性応答が化学的に誘発された適応の影響を受けやすいことを示しました。マイクロ流体設計を変更して2つのアリーナを含めることで、遺伝的またはその他の摂動を、一致する参照と同時に比較できます。セットアップが完了すると、システムはさまざまな方法で変更できます。例えば、化学物質の線量反応や、睡眠状態と覚醒状態の間などの神経活動の状態依存的な変化を自動的に測定しました。

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Research

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Neuroscience

神経科学

テクニックは、4を注入するために記述されています...

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