クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

TEM断層撮影は細胞のイメージングに広く使用されていますが、標本の厚さの点で非常に限られています。FIB SEMおよび軟X線断層撮影は、解像度は低くなりますが、より大きなサンプルに使用できます。STEM断層撮影はこのギャップを完全に埋めます。

STEMトモグラフィーは、数ナノメートルの解像度でミクロンの厚さのサンプルを見ることができます。極低温調製物と組み合わせることで、生物学的サンプルや切片を3Dで見ることができます。画像形成を理解するためにSTEM光学系の基本を確認し、サービスエンジニアがステムモードとロマックスステムモードを適切に調整し、キャリブレーション手順がビデオのように見えることを確認します。

まず、列アラインメントファイルをロードし、列の値を開きます。サイドエントリークライオホルダーを使用する場合は、クライオシールドを開き、TEMモードで起動します。ビームが画面に表示されます。

ビームが現れない場合は倍率を下げます。コントロールパネルのボタンを押して、顕微鏡をユーセントリックフォーカスにします。スポットサイズを、蛍光スクリーンを直接視覚化するのに便利な値に設定するか、内蔵カメラで視覚化します。

顕微鏡をSTEMモードに設定し、焦点が対物レンズではなく集光レンズを使用していることを確認します。パネル上で、ユーセントリックフォーカスを設定し、初期調整のために回折モードを終了します。ビームが空白でないことを確認し、ビームが画面に表示されるまで倍率を下げます。

ビームを中心に保ちながら、ビームシフトを中央に調整し、倍率を最大70, 000まで上げます。次に、目的のコンデンサー開口部(通常、マイクロプローブモードの場合は50マイクロメートル)を挿入し、開口部のセンタリングを確認します。フォーカスノブを前後に回している間、スポットは伸縮しますが、飛行機が想像上の垂直砂時計を切断するかのように、所定の位置にとどまります。

絞りが中央にない場合、照明は砂時計が傾いているかのように横方向にシフトします。ビームに焦点を合わせるか、[位置合わせ]タブの強度リストのフォーカスを押すか、ユーセントリックフォーカスに戻ります。ビーム位置を中央に再調整し、回転中心を調整します。

次に、フォーカスステップホイールを最小または1ステップ上に回して、ビームが穏やかにパルスし、フォーカスが上下に移動しても静止したままになるようにします。ピボットポイントを選択し、2つのポイントをXとYの調整でまとめます。コンデンサースティグメーターを調整して、ビームを丸くします。

フォーカスを上下に移動して最適化します。焦点を通過するときに一方向または他の方向に伸びる傾向があってはなりません。レンズを正規化してから、倍率を約240, 000まで徐々に上げ、ビームシフトを使用してスポットを中央に保ち、回転中心とピボットポイントの調整を繰り返します。

回折モードに戻ります。この段階で、ビームは蛍光スクリーン上に均一なディスクとして現れるはずです。カメラの長さは、X線結晶構造解析として検出器までの光学距離を効果的に制御するようになりました。

それを変更し、ディスクが収縮して拡大するのを見て、スクリーンの位置が標本に近づいたり遠ざかったりするかのようにします。この円錐は明視野照明を表します。高倍率でSTEMモードを使用するには、明視野ステム検出器から始めて、回折アライメントを調整して、目的のカメラ長を使用してビームを中央に配置します。

画面の明視野マーキングをオンにし、カメラの長さを330に減らし、画面を持ち上げて検出器を挿入します。顕微鏡ソフトウェアでスキャンを開始します。スコープ表示を使用して、原稿に記載されているように明るさとコントラストの設定を調整しながら支援します。

調整を数回繰り返します。低倍率モードに入らずに、高倍率レジスタで顕微鏡を比較的低い倍率に戻します。蛍光スクリーンを挿入し、参考のためにスクリーン電流をメモします。

TEMと同様に、電流はガンレンズとスポットサイズの設定で、電流の減少に対応する数値を増やして変更できます。この時点で、FEGレジスタを保存して、標準値に戻しやすくします。標本を見るためにLMTEMモードに行きます。

試験片を挿入します。サンプルをユーセントリックの高さにします。これを行うにはいくつかの方法があります。

例えば、ステージワブラーを使用して、画像が横方向にシフトしなくなるまで、Z軸に沿って標本の高さを移動しながらグリッドを傾けます。または、表示画面でいくつかの機能をマークし、ステージを10〜30度に傾けます。フィーチャが横方向に移動します。

試験片の高さを調整して、元の位置に戻します。倍率またはステージの傾きを上げて調整し、傾きを 0 度に戻します。次に、STEMモードに戻り、STEM検出器を挿入します。

[LM スキャンを有効にする] がオフになっていることを確認します。最低高倍率モードに移動します。この方法でコンデンサーの乱視を調整します。

薄いサンプル領域にビームを当てて、両側のサンプルのシャドウイメージの間に透過ビームが吹き上がるポイントに焦点を合わせます。次に、コンデンサーのチューニングを調整して、中央のディスクを丸くします。これには、特に極低温サンプルの場合、ある程度の練習が必要です。

50マイクロメートルの開口部に戻り、FEGレジスタを更新します。LMSTEMモードに移動し、スキャンを続行して興味深い領域を見つけます。必要に応じて、この時点で検出器の明るさとコントラストの設定を大まかに再調整します。

ユーセントリックフォーカスを押し、倍率を上げて、顕微鏡が提供するフォーカスループを使用してスキャンしながらフォーカスを絞り、金ビーズの非点収差を確認します。これまで、すべてがナノプローブモードで実行されていました。コンデンサーの開口部を小さくすると、半収束角が小さくなり、厚いサンプルに役立ちます。

TFS機器の別のアプローチは、マイクロプローブモードに切り替えることで、半収束角を小さくします。次に、カメラの長さを調整して、収集角度を収束角度の3倍にします。

式を使用して記録する線量を推定します。経験則として、断層撮影装置全体で正方形のインクストロームあたり100から150の電子を目指します。ステージ全体を戻し、スポットサイズやガンレンズの設定を使用してビーム電流を調整し、目的のスクリーン電流に到達します。

STEMモードで記録された全低倍率グリッドマップは、関心のある細胞がある領域を示しています。細胞は部分的に明るく見え、電子はHAADF検出器に向かって散乱します。STEMモードで記録された中解像度マップには、2つの中解像度アンカーマップが表示されました。

ステムチルトシリーズのゼロ度傾斜により、ミトコンドリアのリン酸カルシウム沈着物、クリステ、金基準マーカーを視覚化することができました。60ナノメートルと40ナノメートルの厚さのセクションのボリュームレンダリングが示されています。クライオステムトモグラフィー(CSTET)は、構造生物学と細胞生物学の間の架け橋となり、超解像蛍光のコンテキストを提供します。

切片作成やラメラの準備を必要とせずに、細胞劇場全体をほぼネイティブの状態に見ることができます。