Name: クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶクライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ可視化手法。ミクロン厚の試料をナノメートル分解能で3Dイメージングし、細胞生物学研究における非侵襲的ハイレゾリューション構造解析の可能性を示します。

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SerialEMソフトウェアパッケージの作者でありメンテナであるDavid Mastronade氏とGünther Resch氏からの継続的かつ継続的なサポートに非常に感謝しています。P.K.は、シュレーディンガーフェローシップJ4449-Bを通じてオーストリア科学基金(FWF)から資金提供を受けました。オープンアクセスの目的で、著者は、この投稿から生じる著者が受け入れた原稿バージョンにCC-BYパブリック著作権ライセンスを適用しました。M.E.とSGWは、イスラエル科学財団(助成金番号1696/18)および欧州連合ホライズン2020双子プロジェクトImpaCT(助成金番号857203)からの資金提供を認めています。M.E.は、CryoSTEMプロジェクト(助成金番号101055413)におけるERCからの資金提供を認めています。M.E.は、サムとアヤラザックス教授の議長の現職者であり、アーヴィングアンドチェルナモスコウィッツナノおよびバイオナノイメージングセンターの責任者です。M.E.の研究所は、ハロルド・パールマン家の歴史的な寛大さから恩恵を受けてきました。我々はまた、欧州連合による資金提供を認識する。ただし、表明された見解や意見は著者のものであり、必ずしも欧州連合または欧州研究会議執行機関の見解や意見を反映しているわけではありません。欧州連合も付与機関もそれらに対して責任を負うことはできません。

<ol><li>Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons+of+cryo-tomography+to+larger+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons of cryo-tomography to larger volumes.</a> Current Opinion in Microbiology. 43, 155-161 (2018).</li>
<li>Schertel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+FIB-SEM%3A+Volume+imaging+of+cellular+ultrastructure+in+native+frozen+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).</li>
<li>Do, M., Isaacson, S. A., McDermott, G., Le Gros, M. A., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+characterizing+cells+using+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Imaging and characterizing cells using tomography.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 581, 111-121 (2015).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+cryo+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by cryo soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11 (4), 611-619 (2019).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+nucleation+of+hemozoin+at+the+digestive+vacuole+membrane+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oriented nucleation of hemozoin at the digestive vacuole membrane in Plasmodium falciparum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11188-11193 (2012).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+heme+detoxification+in+the+malaria+parasite+by+in+situ+correlative+X-ray+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling heme detoxification in the malaria parasite by in situ correlative X-ray fluorescence microscopy and soft X-ray tomography.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Sviben, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuole-like+compartment+concentrates+a+disordered+calcium+phase+in+a+key+coccolithophorid+alga%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A vacuole-like compartment concentrates a disordered calcium phase in a key coccolithophorid alga.</a> Nature Communications. 7, 11228(2016).</li>
<li>Wan, W., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Methods in Enzymology. , 329-367 (2016).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 249-258 (2019).</li>
<li>Bäuerlein, F. J. B., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+visual+proteomics+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards visual proteomics at high resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 433 (20), 167187(2021).</li>
<li>Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+compositional+contrast+by+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Toward compositional contrast by cryo-STEM.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (19), 3621-3631 (2021).</li>
<li>Elbaum, M., Wolf, S. G., Houben, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+biological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells.</a> MRS Bulletin. 41 (7), 542-548 (2016).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Houben, L., Weissman, H., Wolf, S. G., Rybtchinski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+ferritin+crystallization+revealed+by+cryo-STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism of ferritin crystallization revealed by cryo-STEM tomography.</a> Nature. 579 (7800), 540-543 (2020).</li>
<li>Li, Y., Huang, W., Li, Y., Chiu, W., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+cryogenic+electron+microscopy+in+materials+science+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience.</a> ACS Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nature Methods. 6 (10), 729-731 (2009).</li>
<li>Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy%3A+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Imaging+and+Electron+Physics%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy: biological applications.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 159, 357-386 (2009).</li>
<li>Wolf, S. G., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSTEM+tomography+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CryoSTEM tomography in biology.</a> Methods in Cell Biology. 152, 197-215 (2019).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition-A+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition-A comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Rez, P., Larsen, T., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+theoretical+basis+and+limitations+of+cryo-STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the theoretical basis and limitations of cryo-STEM tomography for thick biological specimens.</a> Journal of Structural Biology. 196 (3), 466-478 (2016).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Sheng, Y., Morris, K., Radecke, J., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+remote+data+collection+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography remote data collection and subtomogram averaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63923(2022).</li>
<li>Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+cryogenic+electron+tomography+data+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62383(2021).</li>
<li>O'Toole, E., vander Heide, P., McIntosh, J. R., Mastronarde, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+electron+tomography+of+cells+using+SerialEM+and+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Imaging%3A+Electron+Tomography+and+Related+Techniques%22%5BJournal%5D)">Large-scale electron tomography of cells using SerialEM and IMOD.</a> Cellular Imaging: Electron Tomography and Related Techniques. , 95-116 (2018).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTOMO%3A+An+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">AreTOMO: An integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> Journal of Structural Biology. (6), 100068(2022).</li>
<li>Seifer, S., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClusterAlign%3A+A+fiducial+tracking+and+tilt+series+alignment+tool+for+thick+sample+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Imaging%22%5BJournal%5D)">ClusterAlign: A fiducial tracking and tilt series alignment tool for thick sample tomography.</a> Biological Imaging. 2, 7(2022).</li>
<li>Waugh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+deconvolution+processing+for+STEM+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional deconvolution processing for STEM cryotomography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (44), 27374-27380 (2020).</li>
<li>Kirchenbuechler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-STEM+tomography+of+intact+vitrified+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-STEM tomography of intact vitrified fibroblasts.</a> AIMS Biophysics. 2 (3), 259-273 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lazić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+structures+from+iDPC-STEM+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM structures from iDPC-STEM at near-atomic resolution.</a> Nature Methods. 19 (9), 1126-1136 (2022).</li>
<li>Seifer, S., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+STEM+with+simultaneous+phase+and+depth+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Flexible STEM with simultaneous phase and depth contrast.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-12 (2021).</li>
<li>Ophus, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+scanning+transmission+electron+microscopy+%284D-STEM%29%3A+from+scanning+nanodiffraction+to+ptychography+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional scanning transmission electron microscopy (4D-STEM): from scanning nanodiffraction to ptychography and beyond.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (3), 563-582 (2019).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+phase+retrieval+of+biological+specimens+using+cryo-electron+ptychography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography.</a> Nature Communications. 11 (1), 2773(2020).</li>
<li>Nellist, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principles+of+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">The principles of STEM imaging.</a> Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging and Analysis. , 91-115 (2011).</li>
<li>Elad, N., Bellapadrona, G., Houben, L., Sagi, I., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+isolated+protein-bound+metal+ions+by+single-particle+cryo-STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of isolated protein-bound metal ions by single-particle cryo-STEM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (42), 11139-11144 (2017).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

このプロトコルは、従来のTEM断層撮影ではアクセスできない細胞領域の細胞内オルガネラの3Dビューを取得することに関心のあるライフサイエンス顕微鏡学者を支援する必要があります。同じプロトコルは、曝露に対する制約を緩和したプラスチック切片のSTEM断層撮影にも使用することができます。プロトコルは、一連の厳格なルールではなく、出発点と見なす必要があります。確かに、STEMの力はその柔軟性です。それを操作するための正しい方法はありません。
STEM自体は、スキャンされたプローブのみを指し、画像形成を定義するものではないことを強調します。コントラストは、主に検出器の構成に依存します。より簡単な方法は、光軸を中心とした円盤またはそれを囲む円環のいずれかの軸対称性を有する検出器を使用する。一般に、照明が検出器に直接当たると、(電子散乱)試料が暗く見えるBF画像を記録します。逆に、検出器が散乱電子のみを収集する場合、高密度の試料が明るく見えるDF画像を記録します。適切なハードウェアが利用可能な場合、SerialEMはこれらの信号の両方を同時に集録して記録することができます。複数のセグメントを持つ検出器から完全にピクセル化されたカメラまで、さらに洗練された構成が可能です。位相差イメージングは、例えば、軸外検出器素子32、33間の差を評価することによって達成することができる。ピクセルごとに2D散乱(回折)パターン全体を収集することは、同じ元のデータから複数の画像コントラストの再構築を可能にする4D STEM34として知られる方法を定義します。4次元STEMは電子タイコグラフィを可能にし、これは位相差35を得るための別の手段を提供する。
私たちは、細胞小器官および無傷細胞またはミクロン厚の細胞切片の研究に最も有用であると考える特定のSTEMモダリティに焦点を当ててきました。これは特に、照明における小さな半収束角および検出器における比較的大きな収集角度を有するBFイメージングの使用を伴う。小さな収束は大きな被写界深度を提供し、その結果、サンプル全体がチルトシリーズ19全体を通して焦点を合わせたままになります。実際には、優れた顕微鏡ステージを使用すると、取得中の焦点調整の必要性も排除できます。価格は、プロトコルのセクション3で説明されているように、解像度の妥協です。1 nmのピクセル間隔で4 μmの視野に達する~2 nmのプローブを使用した4k画像を提案しました。ただし、読者は実験することを強くお勧めします。2番目の考慮事項は、検出器の側面にあります。照明ディスクが軸上のBF検出器をアンダーフィルすると、位相コントラストが抑制され、散乱(振幅)コントラストが支配的になります。この状態は、インコヒーレント明視野コントラスト36と呼ばれている。問題は、アンダーフィルする割合であり、答えはサンプルによって異なります。非常に薄いサンプルは、検出器が完全に満たされた状態で最高のコントラストを示します(つまり、収集角度は照明の角度と一致します)が、厚いサンプルはすべての強度を散乱させ、コントラストの低いノイズの多い信号を残します。有用な経験則は、サンプルが厚いほど、BF検出器の外側のカットオフ角度を21にする必要があるということです。検出器のサイズと位置はもちろん固定されているため、回折ディスクのサイズは、セクション1で説明したように、カメラの長さを使用して調整されます。検出器アンプの設定が、信号がダイナミックレンジを満たすが、直接照明(1.12.3)で飽和しないようなものである場合、適切な信号強度とコントラストに達するまでカメラの長さを増やすことができます。繰り返しますが、読者は実験することをお勧めします。芸術は、いわば角度にあります。
プロトコルで説明されていない別のパラメータは、顕微鏡の加速電圧です。発光電子と試料との相互作用は、より低い電圧で強くなります。他の条件がすべて等しい場合、低電圧でより高いコントラストが期待できます。一方、使用可能な試料の厚さを制限するのは、試験片内の多重散乱の開始であるため、電圧が高いほど、より厚い試料を使用できます。ただし、これらの効果はかなり微妙です。200 kVと300 kVの加速度に関するこれまでの経験は似ています。
分解能の観点からSTEMに何が期待できるかを考えると、これも試料と検出器の構成に依存します。単粒子分析アプローチを使用すると、フェリチン上の金属イオンは、環状暗視野STEMによって数オングストロームの精度に局在化することができました37。最近では、統合微分位相差(iDPC)STEM32 とタイコグラフィ35によって得られた画像を使用して、ウイルスおよびタンパク質サンプルのサブナノメートル分解能が達成されました。厚い細胞標本のユニークな物体の場合、およびここで説明した方法では、そのような高解像度は現実的ではありません。最適な分解能はプローブの直径であり、これは説明されている半収束角に関連しています。他の要因、特に広い視野に到達するための粗いピクセルサンプリング、チルトシリーズのミスアライメント、および送信中のプローブビームの広がりなど、解像度が低下します。画像はプラスチック断層撮影とよく比較されます。たとえば、ここで説明するセットアップでは、微小管の中空コアは簡単に確認できますが、個々のプロトフィラメントは確認できません。
要約すると、STEMメソッドとハードウェアはどちらも開発段階にあります。イメージングの革新はトモグラフィーにも影響を与え、STEMを他の技術ではアクセスできなかったドメインに導くことが期待できます。最新の光学超解像法に基づく相関極低温蛍光イメージングとの収束は、特に実り多いものになると期待しています。100〜1,000 nmの細胞小器官のスケールは、これらの新しい方法の理想的なターゲットです。

細胞小器官の3次元(3D)可視化は、現代の細胞生物学において最も重要な課題です。分泌小胞の数十ナノメートルから細胞核の数十ミクロンまで、関連するスケールを考えると、すべてのアプリケーションに適合する単一の顕微鏡技術を見つけることは困難です。最新の蛍光顕微鏡法は、分解能の点では広い範囲に及ぶ可能性がありますが、標識された分子のみが現れます。細胞劇場は依然として電子顕微鏡の領域です。従来の化学的固定、プラスチック包埋、重金属による染色の方法は侵襲性が強いため、サンプル調製の詳細によって結果が異なる場合があります。一方、クライオEMは、水性媒体をガラス化する必要性によって制約されます。形成される氷結晶は電子照明を回折し、目的の有機材料よりも高いコントラストのコントラストアーチファクトを引き起こします。
過去10年間で、細胞研究用に開発または適合されたEMイメージング技術が急増しました1。反復集束イオンビーム(FIB)ミリングと組み合わせた高圧凍結と走査型電子顕微鏡(すなわち、FIB-SEM)を使用したシリアル表面イメージングは、現在、大型試料2に最適な方法です。極低温軟X線断層撮影法(クライオSXT)は、水中の軟X線の特性吸収長によって制限される数ミクロンのサイズのサンプルに適しています3、4、5。このスケールには多くの無傷の細胞型が含まれており、X線吸収コントラストの定量的性質は、濃度測定6または分光法7の側面を追加します。位相差透過型電子顕微鏡(TEM)に基づくクライオ透過電子線トモグラフィー(クライオET)は、サブトモグラム平均法と組み合わせると、高分子または複合体に対して最高の分解能を提供します8,9,10。しかし、無傷の細胞小器官が非常に規則的であるため、全体を平均化できることはまれです。また、従来の広視野TEMの態様は、試料内の非弾性散乱(エネルギー損失を伴う)と磁気対物レンズ11,12内の色収差との組み合わせにより、試料の厚さが数百ナノメートルに制限されていた。大きなエネルギー拡散により、エネルギーフィルターを使用して焦点の合っていないヘイズを除去する必要がありますが、感度の高い試料は依然として放射線損傷を受け、画像信号は厚さが増すにつれて指数関数的に弱くなります。
代替イメージングモードである走査透過EM(STEM)は、エネルギーフィルタリングの必要性を回避し、TEMトモグラフィーよりも解像度が低いにもかかわらず、画像形成のために非弾性散乱電子を保持します(図1)。実際、実際の画像は形成されていません。代わりに、スキャンEMのように、測定はポイントごとに行われ、画像はコンピューターによって組み立てられます。倍率は、レンズ電流を変えずにスキャンステップのサイズによってのみ決定されます。適切に構成されている場合、クライオSTEM断層撮影(CSTET)の試料厚さの有用な範囲は1.5または2μmに達する可能性がありますが、有用な信号強度が照明のかなりの部分のままである快適ゾーンは約600〜900nmです11,13。これは、細胞質の大部分、そして時には細胞核の端を見るのに十分である。実際には、極低温液に突入する標準的な方法によるガラス化は、STEMイメージングよりも厚さに厳しい制約を課すことがわかりました。このビデオ記事の目的は、研究室や顕微鏡施設での細胞およびオルガネライメージング用のツールチェストへのCSTETの組み込みを容易にすることです。
最初の課題は、CSTETの顕微鏡操作が、クライオTEM断層撮影のようにライフサイエンスアプリケーション向けにまだ標準化されていないことです。STEMハードウェアがクライオEM市場をターゲットにすることはめったにありません。しかし、これは最新世代の顕微鏡で変化しており、多くの既存のツールを後付けすることができます。技術としてのSTEMは、極低温および低線量法への関心も高まっている材料科学で離陸し、大部分を引き継いでいます14,15。材料科学の文献には、BF-STEM、ADF-STEM、HAADF-STEM、4D-STEM、DPC-STEMなどの頭字語がたくさんあり、混乱を増しています。ここでは、ワイツマン科学研究所での集合的な経験において、明視野(BF)STEMイメージングに基づく有用な結果を得るための最も一般的なプロトコルを提供する推奨される出発点を提供します16。それは決して可能性の範囲を使い果たしたり探求したりすることはありませんが、それはさらなる強化の基礎として役立ちます。クライオSTEMを重視していますが、ほとんどのプロトコルは、プラスチック包埋切片の室温STEM断層撮影にも同様に関連しています。
STEMの本質は、集束電子プローブ(図1)、照明コーンで試料をスキャンし、透過の回折(散乱)面からの信号をピクセルごとに記録して、2D画像を生成することです17,18。ほとんどの細胞材料を含むアモルファス標本は、透過時に拡散散乱パターンを生成します。最も簡単で実用的なSTEM構成は、中央ディスク(つまり、標本なしで送信されるプローブ照明)を記録するための円形検出器を配置することです。試料は、信号が減少する程度にこの照明円錐から電子を散乱させます。これによりBF画像が生成され、標本は明るい背景で暗く見えます。環状検出器を使用して、照明コーンの外側の試料からの散乱を検出することもできます(または代わりに)。試験片を取り除いた状態では、信号はありません。標本が所定の位置にあるとき、オブジェクトは暗視野(DF)画像の暗い背景に明るく見えます。STEM(BF、環状暗視野[ADF]、高角環状暗視野[HAADF]など)の命名法は、主に検出器の収集角度の範囲を指します。
照明の収束角は、細胞断層撮影へのSTEMの本質的な適応を表しています。高解像度が最優先される場合、収束角度はできるだけ大きくする必要があります。(これは共焦点レーザー走査型顕微鏡に似ています;分解能はプローブの直径によって決定され、波長を開口数で割った値としてスケーリングされます。なお、EMについては半角または半収束角を参照します。一方、優先が被写界深度である場合、集束ビームは波長を半角の2乗で割った距離でほぼ平行のままであるため、解像度の低下は大きな利点をもたらします。理想的には、セル体積全体がフォーカス19に留まる。例えば、300 keVでは、電子デブロイ波長は0.002 nmであるため、1 mradの収束は2 nmの分解能と4ミクロンの被写界深度をもたらします。これらの条件下では、断層撮影は、データ収集プロセス中に焦点を合わせなくても、取得の開始時に一度だけ実行することができる。従来の断層撮影が可能なSTEMは、7または8 mradの半収束角に達する可能性があります。したがって、原理的には0.25nm程度の解像度に達することができましたが、焦点深度はわずか62nmでした。これは明らかに細胞イメージングには薄すぎます。3つのコンデンサーレンズを備えたより高度な顕微鏡は、かなりの範囲にわたって半収束角度の連続調整を提供します。より伝統的な2コンデンサー構成では、収束はコンデンサー(C2)アパーチャによって離散的に固定されます。
堅牢なプラスチック包埋サンプルの場合、各傾斜で焦点系列を記録し、それらを組み合わせて高解像度20にすることができますが、極低温標本の場合、放射線バジェットが厳しく制限されすぎます。最後に、BFまたはDFイメージングの利点を比較検討する際には、厚い試料の場合、試料内の多重弾性散乱の影響を考慮する必要があります。BF信号は多重散乱による破損が少なく、厚い試料に対してより高い分解能を示す16,21。
有用な経験則は、収束よりも数倍大きい収集角度を設定することでした。標本が厚いほど、収集ディスクを大きくする必要があります。ディスクが小さすぎると、信号強度が低くなります。ディスクが大きすぎると、最大角度の散乱のみが寄与するため、画像のコントラストが低下します。収集角度は、特定のサンプルに対して最適化する必要があります。(回折)カメラの長さの関数としての検出器角度は、個別に校正する必要があります。それらは顕微鏡ソフトウェアによって便利に表示されてもよい。実際には、収集と照明の半角の比率、θとαの係数がそれぞれ2〜5倍(図1)であり、細胞標本のCSTETの推奨される開始点です。
以下のプロトコルは、顕微鏡制御のための一般的なSerialEMソフトウェアを用いたSTEM断層撮影動作を説明する22、23。シリアルEMは特定のメーカーに縛られておらず、TEM断層撮影で広く使用されています。断層撮影のセットアップにおけるほとんどの操作は、TEMから直接引き継ぐことができます。SerialEM戦略は、スキャンシステムをカメラとしてモデル化することです。これにより、TEMからSTEMへの簡単なクロスオーバーが可能になります。ただし、倍率やビニングなどのパラメータは完全に人工的なものであることに注意してください。重要なパラメータは、ミクロン単位の視野、視野内のピクセル数、および露光時間です。ピクセル間隔、またはサンプリングは、線形フィールドをピクセル数で割った値であり、滞留時間はピクセル数を露光時間で割った値です。
STEMおよびCSTETの最小構成には、スキャンジェネレータ、STEM検出器、断層撮影制御ソフトウェアの3つの顕微鏡機能が含まれます。このプロトコルは、FEI/サーモフィッシャーサイエンティフィック(TFS)の命名法を参照していますが、概念は一般的です。TFSのプロプライエタリなソフトウェアは、TEM24のJoVEで説明されており、STEM操作は非常に似ています。
顕微鏡はサービスチームまたは経験豊富なスタッフによって事前に位置合わせされており、ファイルをロードすることでカラムの位置合わせを呼び出すことができることを前提としています。微調整はダイレクトアライメントと呼ばれ、いわゆるFEGレジスタ(TFS顕微鏡)に保存できます。直接アライメントには、回転中心、ピボットポイント、回折アライメント、およびコンデンサー非点収差の補正が含まれます。調整は繰り返し実行する必要があります。TFS顕微鏡は、異なるナノプローブ(nP)モードとマイクロプローブ(μP)モードを実装していることに注意してください。所与のコンデンサー開口部に対して、これらはそれぞれTEMにおける平行照明およびSTEMにおける多かれ少なかれ収束する(緊密に集束された)電子ビームを有する比較的狭いまたは広い視野を提供する。他のメーカーは、収束角の範囲をカバーするために異なるスキームを使用しています。
開始する前に、調査中のサンプルに応じて、視野 Lとサンプリング(ピクセル幅)lを選択する必要があります。例えば、 l = 1nm/ピクセルの場合、4μm2 の視野をカバーする4,000×4,000ピクセルの画像を選択するべきである。分解能はせいぜい空間サンプリングの2倍なので、2 nm、プローブの直径dはそれに一致する必要があります。プローブ角度のキャリブレーションはこのプロトコルの範囲を超えているため、テーブルまたは画面の読み取りが利用可能であると想定しています。プローブの直径は、ほぼ電子波長を半収束角(ラジアン単位)で割ったものです:d = λ/θ。波長λは、300 keVの場合は0.002 nm、200 keVの電子の場合は0.0025 nmであるため、θが1 mradの場合、スポット径はそれぞれ2または2.5 nmになります。
プロトコルは、複雑さが増すにつれて提示されます。最初のタスクは、顕微鏡メーカーのソフトウェアに依存するSTEM画像を作成し、次にSerialEMを使用するチルトシリーズを作成することです。多くの読者は間違いなくSerialEMに精通しているので、より複雑なタスクは自然に起こります。手順を厳密に守る必要はありません。自動化に関連する開発は、TEMだけでなくSTEMにも直接実装できます。経験豊富なユーザーは、蛍光マップの相関登録から始めて、バッチ断層撮影のセットアップを継続して、プロトコルを反転させる可能性があります。詳細については、オートメーション25の最新の開発に関する最近のJoVEの記事を含む、SerialEM自体の広範なドキュメントとチュートリアルライブラリを参照してください。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;SerialEM</td><td>University of Colorado</td><td>Veriosn 4.0</td><td>SerialEMは、顕微鏡制御とデータ収集のためのフリーソフトウェアプラットフォームです。&nbsp;</td></tr><tr><td>STEM対応透過型電子顕微鏡</td><td></td><td></td><td>このプロトコルは、サーモフィッシャーサイエンティフィックの複数の顕微鏡(Titan Krios、Talos Arctica、Tecnai T20-F)の経験に基づいて作成されました。原則として、他のメーカーにも適用できるはずです。</td></tr></tbody></table>

クライオstemトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、天然の水性媒体に埋め込まれた生物学的または有機試料のイメージングに依存しています。水は結晶化せずにガラスに固化(すなわちガラス化)される。クライオ電子顕微鏡法は、最近、生体高分子の構造を原子に近い分解能で決定するために広く使用されています。このアプローチは、断層撮影法を用いた細胞小器官や細胞の研究にも拡張されていますが、従来の広視野透過EMイメージングのモードは、標本の厚さに厳しい制限があります。これは、集束イオンビームを使用して薄いラメラを粉砕する慣行につながりました。再構成からサブトモグラム平均化によって高い分解能が得られますが、残りの層の外側の3次元関係は失われます。厚さの制限は、走査型EMまたは共焦点レーザー走査型顕微鏡と同様に、走査型プローブイメージングによって回避できます。材料科学における走査型透過電子顕微鏡(STEM)は、単一の画像で原子分解能を提供しますが、電子照射に対する極低温生物試料の感度には特別な考慮事項が必要です。このプロトコルは、STEMを使用したクライオトモグラフィーのセットアップを提供します。顕微鏡の基本的な局所構成は、2コンデンサーシステムと3コンデンサーシステムの両方で説明されていますが、自動化は非商用のSerialEMソフトウェアによって提供されます。バッチ取得の機能強化と、以前に取得した蛍光マップとの相関アライメントについても説明します。例として、ミトコンドリアの再構成を示し、内膜と外膜、リン酸カルシウム顆粒、および周囲の微小管、アクチンフィラメント、およびリボソームを指摘します。クライオSTEMトモグラフィーは、細胞質内の細胞小器官の劇場、場合によっては培養中の接着細胞の核周辺を明らかにすることに優れています。

STEMで作成されたフルグリッドモンタージュは、関心のある細胞がある領域を示しています(図4)。画像は暗いフィールドにあるため、空の穴は暗く表示されることに注意してください。細胞は部分的に明るく見え、電子はHAADF検出器に向かって散乱されます。最も厚い部分、通常は中央またはグリッドバーの近くでは、コントラストは再び暗くなります。これは多重散乱によるもので、電子は検出器によって捕捉されない角度に達します。実際には、これらの領域は断層撮影には厚すぎます。
次の段階には、中間倍率のマップが含まれます(図10)。これらはしばしばミディアムモンタージュマップ、または正方形マップと呼ばれ、形状ではなくグリッドの正方形を指します。最も低いマイクロプローブSTEMモードでも、モンタージュ画像として取得されます。[ナビゲータ] ウィンドウでアイテムをクリックすると、マップ イメージがメイン ウィンドウに読み込まれます。断層撮影のための特定のポイントは、この領域内で選択されます。プレビューモードを使用して、記録倍率で領域を見つけます。スキャン速度によっては、プレビューと記録の間に横方向のシフトがある場合があることに注意してください。単一のチルトシリーズをここに記録することができます。たとえば、ミトコンドリアは、プレビューおよび記録画像で識別されることがよくあります(図12)。
バッチ断層撮影の場合、ステージはグリッドの周りを移動し、まったく同じ場所に戻らない場合があります。アンカーマップは、ステージの動きがずれた場合でも、プレビュー画像を低倍率のビューに一致させることで、目的のレコード領域を確実に再識別するために使用されます。PyEM23,24は、確かに推奨されるより高速な代替手段を提供しますが、まだ標準インストールの一部ではありません。
CLEMアプローチでは、蛍光マップを使用して、トモグラフィーの関心のある領域を特定できます。蛍光は外部で取得され、フルグリッドモンタージュに登録する必要があります。グリッドバーと穴が見えるようにしておくと便利なので、インポート前に、たとえばGIMP(https://www.gimp.org)やImageJ31 ソフトウェア(ImageJが縦軸を反転するように注意してください)で、マージされた蛍光+明視野複合体を準備できます。蛍光のダイナミックレンジが大きいと、飽和せずにこのような融合を作成することが困難な場合がある。この場合、2 つのマップを別々にインポートし、説明に従って一緒に登録できます (図 13)。このようにして、ナビゲーターウィンドウの蛍光マップ上のポイントに続いて「Go To XY」が続くと、ステージはTEMに取り付けられたグリッド上の対応する位置に移動します。モンタージュ(またはモンタージュの場合は蛍光マップ)の作成における小さな不整合が小さな変位につながることに注意してください。したがって、最適な精度を得るには、蛍光を正方形マップに特異的に再登録する必要があります。多くの場合、支持フィルムの穴または明視野光画像と共有される特徴に基づいて、目視でこの登録を行うだけで十分である。
傾斜系列を再構築すると、3Dボリュームが得られます(図14)。この例のピクセルサイズは2.042nmで、視野は~4μmです。リン酸カルシウムの堆積物(オレンジ色の矢印)は、周囲に比べて原子番号が高いため、目立ちます。微小管(赤い矢じり)は、視野全体にわたって追跡できます。また、ミトコンドリアの内膜と外膜(緑色の矢じり)がはっきりと見えます。アクチンは束または個々のフィラメントとして観察することができる。より等方的な分解能を達成するために、再構成はデコンボリューションによって処理され得る。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg"> 図1:TEMとSTEMの比較。 TEMでは、視野はほぼ平行なビームによって照らされ、対物レンズはカメラ上に拡大像を形成する。クライオTEMの場合、対物レンズの開口部を開いて散乱電子波(赤い破線)を通過させ、焦点がぼけると、非散乱(緑)波との干渉によって位相差が生じます。一方、STEMは、試料全体に集束ビームをラスター化し、散乱した電子をピクセルごとに収集します。複数の検出器は、異なる角度に散乱された電子を収集することができます。この数値は30から変更されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg"> 図2:スキャンレートが高いことによる左側の画像の歪みの例。 黄色の矢印でマークされた歪みと、クォンティフォイルの歪んだ楕円形の穴に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg"> 図3:グリッドモンタージュ全体のモンタージュ設定ダイアログ。XとYの倍率とピース数を選択して、総面積が約2,000μmに達するようにして、ほとんどのグリッドのマップを取得します。また、画像をシフトする代わりに「ステージを移動」を選択し、「記録」パラメーターではなく「モンタージュマッピングを使用」を選択します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg"> 図4:STEMモードで記録されたフル低倍率のグリッドマップ。 壊れた領域は、暗視野画像では完全に黒く表示されます。濃い灰色の領域は、厚すぎてガラス化が不十分である可能性があります。断層撮影に適した候補領域は、このスキャンでは白または薄い灰色です。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg"> 図5:マーカープロセスへの移行。 認識可能なオブジェクトは、低解像度マップで[ポイントの追加](この図では38)によってマークされます。低解像度マップ(緑色の円)と中解像度マップ(オレンジ色の円)の間のシフトに注意してください。次に、オブジェクトがマーカー(緑の十字、赤い円)でマークされ、[マーカーに移動]ダイアログが開始されます。選択したオプションは、すべてのマップを245倍で同じ量だけ移動します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg"> 図6:STEMチルトシリーズのチルトシリーズセットアップダイアログ。 線量対称スキームは、-60°から+60°まで2°刻みで使用されます。低い収束角度を使用すると焦点深度が高いため、オートフォーカスがスキップされます。これは以前に行われたように真心度を洗練する必要はありません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg"> 図7:中解像度マップのファイルプロパティダイアログ。 MRC スタック ファイルとして保存し、整数を選択して、追加情報を .mdoc メタデータ ファイルに保存します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg"> 図8:中解像度のマップを保存するためのモンタージュ設定ダイアログ。 幅90μmの200メッシュグリッド上の正方形の場合、少なくとも90μm x 90μmの総面積が推奨されます。画像をシフトする代わりにステージの移動を選択し、低線量モードでビューパラメータを使用します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg"> 図9:記録媒体の解像度マップ。 中解像度のマップを記録するためのアイテムダイアログで取得します。マッピングを選択し、画像またはモンタージュを取得して保存し、[ナビゲーターマップを作成]にチェックマークを付けます。プライマリの前または後のタスクで、[粗い真心度]と[細かい真心度]を選択します。支援しない場合は、必要に応じて [エラーが発生したときにメッセージ ボックスを表示しない] と [最後に列バルブを閉じる] を選択します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg"> 図10:中解像度マップの画像。 3 x 3のモンタージュによってSTEMモードで記録された中解像度マップ(正方形マップ)。データ収集用の 2 つの中解像度アンカー マップは、青い四角形で示されます。スケールバー = 10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg"> 図11:バッチチルトシリーズデータ。 バッチチルトシリーズを収集するためのアイテムダイアログで取得します。傾斜系列データ収集の場合は、[最終データ]と[傾斜系列を取得]を選択します。プライマリの前後のタスクで、[デュワー/バキュームの管理]([セットアップ]メニューで適切な設定を選択)、[アイテムに再配置]、[微細な真心度]、および[アクションの前にスクリプトを実行]をオンにします。一般オプションで、エラーが発生したときにメッセージボックスがないとチェックを入れ、最後にカラムバルブを閉じます(5.14を参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg"> 図12:ミトコンドリアのSTEM傾斜系列の0°傾斜。 オレンジ色の矢印はリン酸カルシウムの堆積物(マトリックス顆粒)、緑色の矢印はクリステ、赤い矢印は15 nmの金の基準マーカーを示しています。スケールバー= 500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg"> 図13:登録されたクライオ-CLEMマップ 。 (A)中解像度STEMマップ(正方形マップ、26-A)が(B)低解像度STEMマップ、(C)BFチャネルクライオFMマップ、および(D)GFPチャネルクライオFMマップに登録されています。9 つの基準点 (ラベル 4-21) は、(E) ナビゲーターに表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg"> 図 14: ボリュームのレンダリング。 (A)60 nmおよび(B)厚さ40 nmの切片を、異なる深さでSIRTのような(30サイクル)フィルター断層撮影したボリュームレンダリング。ピクセルサイズは2.048nmで、約4μmの視野が得られます。 図12と比較した逆密度は、高輝度の特徴が明るいことを意味します。オレンジ、白、赤、緑、および水色の矢印は、それぞれリン酸カルシウム沈着物、リボソーム、微小管、ミトコンドリアの内膜および外膜、およびアクチンフィラメントを指しています。スケールバー= 500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

クライオSTEMトモグラフィーは、埋め込み、切片作成、またはその他の侵襲的な調製物なしで、無傷の細胞の細胞小器官を視覚化する手段を提供します。得られた3D解像度は現在、数ナノメートルの範囲であり、数マイクロメートルの視野および1μmのオーダーのアクセス可能な厚さを有する。

クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is ...

TEM断層撮影は細胞のイメージングに広く使用されていますが、標本の厚さの点で非常に限られています。FIB SEMおよび軟X線断層撮影は、解像度は低くなりますが、より大きなサンプルに使用できます。STEM断層撮影はこのギャップを完全に埋めます。STEMトモグラフィーは、数ナノメートルの解像度でミクロンの厚さのサンプルを見ることができます。極低温調製物と組み合わせることで、生物学的サンプルや切片を3Dで見ることができます。画像形成を理解するためにSTEM光学系の基本を確認し、サービスエンジニアがステムモードとロマックスステムモードを適切に調整し、キャリブレーション手順がビデオのように見えることを確認します。まず、列アラインメントファイルをロードし、列の値を開きます。サイドエントリークライオホルダーを使用する場合は、クライオシールドを開き、TEMモードで起動します。ビームが画面に表示されます。ビームが現れない場合は倍率を下げます。コントロールパネルのボタンを押して、顕微鏡をユーセントリックフォーカスにします。スポットサイズを、蛍光スクリーンを直接視覚化するのに便利な値に設定するか、内蔵カメラで視覚化します。顕微鏡をSTEMモードに設定し、焦点が対物レンズではなく集光レンズを使用していることを確認します。パネル上で、ユーセントリックフォーカスを設定し、初期調整のために回折モードを終了します。ビームが空白でないことを確認し、ビームが画面に表示されるまで倍率を下げます。ビームを中心に保ちながら、ビームシフトを中央に調整し、倍率を最大70, 000まで上げます。次に、目的のコンデンサー開口部(通常、マイクロプローブモードの場合は50マイクロメートル)を挿入し、開口部のセンタリングを確認します。フォーカスノブを前後に回している間、スポットは伸縮しますが、飛行機が想像上の垂直砂時計を切断するかのように、所定の位置にとどまります。絞りが中央にない場合、照明は砂時計が傾いているかのように横方向にシフトします。ビームに焦点を合わせるか、[位置合わせ]タブの強度リストのフォーカスを押すか、ユーセントリックフォーカスに戻ります。ビーム位置を中央に再調整し、回転中心を調整します。次に、フォーカスステップホイールを最小または1ステップ上に回して、ビームが穏やかにパルスし、フォーカスが上下に移動しても静止したままになるようにします。ピボットポイントを選択し、2つのポイントをXとYの調整でまとめます。コンデンサースティグメーターを調整して、ビームを丸くします。フォーカスを上下に移動して最適化します。焦点を通過するときに一方向または他の方向に伸びる傾向があってはなりません。レンズを正規化してから、倍率を約240, 000まで徐々に上げ、ビームシフトを使用してスポットを中央に保ち、回転中心とピボットポイントの調整を繰り返します。回折モードに戻ります。この段階で、ビームは蛍光スクリーン上に均一なディスクとして現れるはずです。カメラの長さは、X線結晶構造解析として検出器までの光学距離を効果的に制御するようになりました。それを変更し、ディスクが収縮して拡大するのを見て、スクリーンの位置が標本に近づいたり遠ざかったりするかのようにします。この円錐は明視野照明を表します。高倍率でSTEMモードを使用するには、明視野ステム検出器から始めて、回折アライメントを調整して、目的のカメラ長を使用してビームを中央に配置します。画面の明視野マーキングをオンにし、カメラの長さを330に減らし、画面を持ち上げて検出器を挿入します。顕微鏡ソフトウェアでスキャンを開始します。スコープ表示を使用して、原稿に記載されているように明るさとコントラストの設定を調整しながら支援します。調整を数回繰り返します。低倍率モードに入らずに、高倍率レジスタで顕微鏡を比較的低い倍率に戻します。蛍光スクリーンを挿入し、参考のためにスクリーン電流をメモします。TEMと同様に、電流はガンレンズとスポットサイズの設定で、電流の減少に対応する数値を増やして変更できます。この時点で、FEGレジスタを保存して、標準値に戻しやすくします。標本を見るためにLMTEMモードに行きます。試験片を挿入します。サンプルをユーセントリックの高さにします。これを行うにはいくつかの方法があります。例えば、ステージワブラーを使用して、画像が横方向にシフトしなくなるまで、Z軸に沿って標本の高さを移動しながらグリッドを傾けます。または、表示画面でいくつかの機能をマークし、ステージを10〜30度に傾けます。フィーチャが横方向に移動します。試験片の高さを調整して、元の位置に戻します。倍率またはステージの傾きを上げて調整し、傾きを 0 度に戻します。次に、STEMモードに戻り、STEM検出器を挿入します。[LM スキャンを有効にする] がオフになっていることを確認します。最低高倍率モードに移動します。この方法でコンデンサーの乱視を調整します。薄いサンプル領域にビームを当てて、両側のサンプルのシャドウイメージの間に透過ビームが吹き上がるポイントに焦点を合わせます。次に、コンデンサーのチューニングを調整して、中央のディスクを丸くします。これには、特に極低温サンプルの場合、ある程度の練習が必要です。50マイクロメートルの開口部に戻り、FEGレジスタを更新します。LMSTEMモードに移動し、スキャンを続行して興味深い領域を見つけます。必要に応じて、この時点で検出器の明るさとコントラストの設定を大まかに再調整します。ユーセントリックフォーカスを押し、倍率を上げて、顕微鏡が提供するフォーカスループを使用してスキャンしながらフォーカスを絞り、金ビーズの非点収差を確認します。これまで、すべてがナノプローブモードで実行されていました。コンデンサーの開口部を小さくすると、半収束角が小さくなり、厚いサンプルに役立ちます。TFS機器の別のアプローチは、マイクロプローブモードに切り替えることで、半収束角を小さくします。次に、カメラの長さを調整して、収集角度を収束角度の3倍にします。式を使用して記録する線量を推定します。経験則として、断層撮影装置全体で正方形のインクストロームあたり100から150の電子を目指します。ステージ全体を戻し、スポットサイズやガンレンズの設定を使用してビーム電流を調整し、目的のスクリーン電流に到達します。STEMモードで記録された全低倍率グリッドマップは、関心のある細胞がある領域を示しています。細胞は部分的に明るく見え、電子はHAADF検出器に向かって散乱します。STEMモードで記録された中解像度マップには、2つの中解像度アンカーマップが表示されました。ステムチルトシリーズのゼロ度傾斜により、ミトコンドリアのリン酸カルシウム沈着物、クリステ、金基準マーカーを視覚化することができました。60ナノメートルと40ナノメートルの厚さのセクションのボリュームレンダリングが示されています。クライオステムトモグラフィー(CSTET)は、構造生物学と細胞生物学の間の架け橋となり、超解像蛍光のコンテキストを提供します。切片作成やラメラの準備を必要とせずに、細胞劇場全体をほぼネイティブの状態に見ることができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、"高分子"（〜4...

細菌細胞の電子Cryotomography

私たちは、収集する方法のプロトコル全体ミトコンドリアのプロセス電子クライオ断層像を提示する。技術はネイティブ生体膜に大きな膜タンパク質複合体の構造、機能、および組織への詳細な洞察を提供しています。...

電子クラ​​イオトモグラフィーによるミトコンドリアにおけるATP合成酵素二量体の可視化

このプロトコルでは、シアノ バクテリアの一時的な DNA の締固めを可視化する方法について説明します。同期の栽培、蛍光顕微鏡、急速凍結、高によって監視電圧低温電子断層撮影法を使用します。これらの方法のためのプロトコルを提案し、,...

高圧低温電子トモグラフィー法によるシアノ バクテリアの DNA 締固めの可視化

ここでは、クライオ軟X線断層撮影法(SXT)で凍結保存細胞全体の超構造を25nmハーフピッチの分解能で画像化するために必要なサンプル調製およびデータ収集ステップを説明するプロトコルを提示する。...

クライオ軟X線断層撮影による細胞の3D地図作成記述

集束イオンビームミリングを使用して、凍結した生物学的サンプルを急落させてクライオ電子線トモグラフィー用にガラス体オングリッドラメラを作成します。...

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

クライオに焦点を当てたイオンビームマイクロマシニングによる、凍結した生体試料のラメラ調製プロトコルを提示し 、その場で...

クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

このプロトコルの目的は、細胞接着と成長を、クライオ電子顕微鏡用のグリッドの標的領域に向け出す方法です。これは、細胞播種前のパターン化領域に細胞外マトリックスタンパク質を堆積させた後、ユーザー指定のパターンで脱退された反ファリング層を適用することによって達成される。...

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

本プロトコルは、Tomo5を用いた高分解能クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集と、その後のデータ処理およびemClarityを用いたサブトモグラム平均化について記述する。アポフェリチンは、2.86...

クライオ電子線トモグラフィー遠隔データ収集とサブトモグラム平均化

クライオ電子線トモグラフィー(クライオET)は、ナノメートルの分解能で細胞の超微細構造を3D可視化することを可能にしますが、手作業によるセグメンテーションは依然として時間がかかり、複雑です。クライオET断層撮影のための高度なバーチャルリアリティソフトウェアを統合した新しいワークフローを提示し、哺乳類細胞のミトコンドリアのセグメンテーションを通じてその有効性を示します。...

バーチャルリアリティを活用したクライオ電子線トモグラフィーデータの没入型セグメンテーションと解析

このビデオプロトコルは、ウイルス学的標本の走査型透過型電子顕微鏡断層撮影法を実行する方法を示しています。最適な結果を得るために、サンプルは高圧凍結とその後の凍結置換によって調製されます。...

ウイルス学における走査型透過型電子顕微鏡断層撮影:高圧凍結凍結置換サンプルの3Dイメージング

学ぶクライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ可視化手法。ミクロン厚の試料をナノメートル分解能で3Dイメージングし、細胞生物学研究における非侵襲的ハイレゾリューション構造解析の可能性を示します。

クライオSTEMトモグラフィーによるオルガネラのin situ 可視化

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