廃水および大気サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの定量と全ゲノム特性評価

廃水ベースの疫学は、現在、廃水サンプル中のウイルスRNAを検出し、潜在的なアウトブレイクを特定することにより、世界中のCOVID-19制御戦略を補完するために使用されています。この手法は、無症状の症例を含む、私たちのコミュニティにおけるCOVID-19の有病率の集団全体のスナップショットを提供します。空気サンプリングもこのプロトコルへの重要な追加です。

臨床診断は、病気の発生やパンデミックを管理するための最も正確な方法です。ただし、この手法は、それを補完するものとして依然として役立ちます。この方法には、多くのステップと重要なポイントがあります。

分子生物学にあまり慣れていない研究室でも手順を再現できるため、視覚的なデモンストレーションが不可欠です。まず、24 時間の複合廃水サンプルを 1 リットル採取します。20マイクロリットルのメンゴウイルスを70ミリリットルのサンプルにスパイクします。

試料を700Gで10分間遠心分離した後、得られた上清を遠心分離によりカットオフ10キロダルトンの遠心限外ろ過装置を用いて濃縮する。700Gで40分間遠心分離し、限外濾過装置の位置を反転させて濃縮液を溶出します。得られた濃縮液をRNA抽出に使用します。

空気サンプルを採取するには、採取を開始する前に滅菌コーンをエアサンプラーに入れます。サンプリングが終了したら、市販のウイルスRNA抽出キットまたは社内の方法を使用して、コーンの洗浄PBSからRNAを抽出します。各ターゲット、メンゴウイルス、SARS-CoV-2、N1、N2遺伝子の反応マスターミックスを、試薬セットアップルームの清潔なフードで調製します。

プライマー-プローブミックスと酵素を5回反転させるか、パルスボルテックスで混合します。微量遠心チューブをコールドラックに保管し、15マイクロリットルの混合物をストリップPCRチューブまたは冷却ラックに置いた96ウェルPCRプレートに分注します。プレートを覆い、核酸処理領域に移動します。

抽出したRNAのアリコートを5秒間静かにボルテックスします。5マイクロリットルのRNAを反応ミックスにピペットで移動して25マイクロリットルを作り、RT-qPCRを開始します。PCRプレートで、各サンプル16マイクロリットルをプレート上の所定の位置にピペットで移し、4マイクロリットルの5回逆転写またはRTマスターミックスを加えます。

その後、PCR反応を開始します。次に、各プライマーセットとプライマーの各セットのマスターミックスを10マイクロモル希釈液を調製します。新しいPCRプレートに、20マイクロリットルのマスターミックスをピペットで移し、次に5マイクロリットルのRTサンプルを各ミックスにピペットで移します。

プレートを覆った後、PCR反応を開始します。PCRが終わったら、プレートを1000Gで15〜30秒間スピンダウンします。PCR精製では、各ウェルに50マイクロリットルのビーズベースの試薬を添加し、ピペッティングで混合して磁気分離を進めます。

マグネットスタンドからプレートを取り外します。各ペレットを15マイクロリットルのPCRグレードの水で再懸濁し、プレートを室温で2分間インキュベートします。プレートをマグネットスタンドに戻し、ビーズを2分間ペレット化します。

次に、各サンプルから15マイクロリットルの上清を新しいPCRプレートに慎重にピペットで移します。次に、ライブラリ調製のために、DNAライブラリ調製キットから1.75マイクロリットルの反応バッファーと0.75マイクロリットルの酵素ミックスを各サンプルに加えます。覆われたプレートを短時間ボルテックスし、1000Gで15〜30秒間スピンダウンします。

21°Cで5分間、65°Cで5分間インキュベートします。各サンプルに3マイクロリットルのPCRグレードの水を新しいPCRプレートにピペットで移します。調製したサンプルを0.75マイクロリットル、バーコードを1.25マイクロリットル添加して、シーケンシングライブラリ調製を行います。

次に、5マイクロリットルのT4 DNAリガーゼマスターミックスを加え、ピペッティングでよく混合します。遠心分離機でプレートをスピンダウンした後、プレートを摂氏21度で20分間、摂氏65度で10分間インキュベートします。すべてのサンプルをプールした後、PCR精製のために192マイクロリットルのビーズベースの試薬をプールに加えます。

ピペッティングでよく混合し、室温で10分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置きます。上澄みがきれいになり、ビーズペレットが形成されるのを待ちます。

上澄み液とチューブを磁気スタンドから取り外します。700マイクロリットルのショートフラグメントバッファーまたはSFBを加え、ピペッティングで混合します。チューブを磁気スタンドに戻し、ペレットが形成され、液体が透明になるのを待ちます。

上清はピペットを使用して廃棄します。35マイクロリットルのPCRグレードの水をチューブに加え、ピペッティングで混合し、室温で2分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置き、ビーズがペレット化され、液体が透明になるまで待ちます。

35マイクロリットルの上清を新しいチューブにピペットで移します。次に、本文原稿に記載のアダプターライゲーション反応ミックスを調製し、室温で10分間インキュベートします。PCR精製用のライゲーション反応ミックスに20マイクロリットルのビーズベースの試薬を混合し、室温で10分間インキュベートします。

チューブを磁気スタンドに置き、ビーズペレットが形成され、上清が無色になるのを待ちます。上清はピペッティングで慎重に廃棄してください。125マイクロリットルのSFBをチューブに混ぜ、マグネットスタンドに戻し、ビーズを分離します。

液体が透明になったら、上清を捨て、前述のようにSFBの添加を繰り返します。磁気スタンドのチューブを30秒間開いたままにします。15マイクロリットルの溶出バッファーを加え、ピペッティングでよく混合します。

短時間のスピンダウンと室温での5分間のインキュベーションの後、磁気スタンドに2分間置きます。15マイクロリットルの上清を新しい低結合チューブにピペットで移し、蛍光分析DNA定量キットで濃度を測定します。次に、フローセルをリアルタイムDNA・RNAシーケンシングデバイスに挿入します。

200マイクロリットルにセットされた1, 000マイクロリットルのピペットの先端をプライミングポートに挿入します。音量設定ホイールを回して、先端に液体が見えるまで音量を上げてから、先端を廃棄します。800マイクロリットルのプライミングミックスを気泡のないプライミングポートに加え、5分間待ちます。

200マイクロリットルのライブラリミックスをプライミングポートにピペットで移動させます。カバーポートとプライミングポートを閉じます。ソフトウェアでシーケンシング実験を開始し、Base Calling Onを選択します。このメソッドでは、廃水および空気サンプル中のSARS-CoV-2 RNAを検出および定量しました。

廃水サンプルの標準偏差は1.91%から13.98%で、1リットルあたり8つの遺伝子コピーの10の3.05倍から3倍から2.83倍の10の範囲でした。空気サンプルは、6.17倍10から3倍から5.48倍10から9までの範囲で、重複の標準偏差は0.54%と10.95%このプロトコルで説明されており、サンプルは配列決定され、3つの配列決定されたサンプル結果の例がここに要約されています。3つのサンプルすべてで、系統BA.5。

x は Freyja ツールによって最も普及しているものとして割り当てられました。廃水サンプルの濃縮は、ウイルスRNAが廃水中に低濃度で存在するため、重要なステップです。したがって、このステップは、正確な検出と定量のための基本となります。

この手順は、RT-qPCRプロトコルで異なるプライマーを使用して、他の感染性病原体の検出と定量に使用することで適応させることができます。この技術により、廃水および大気サンプル中のSARS-CoV-2が正確に定量されました。さまざまな病原体をさまざまな場所から検出および定量化できます。