手動受粉、顕微鏡検査、および S遺伝子型分析を使用した柑橘類の自己(非)適合性および相互(非)適合性関係の決定
June 30th, 2023
このプロトコルは、柑橘類の品種における花粉の適合性と非適合性を決定するための迅速な方法を提供します。
この技術は、S遺伝子型を効率的に特定し、柑橘類の自己不和合性を正確に特定し、適切な花粉症の木を選択するために必要な情報を提供します。これは、繁殖プログラムで適切な親の木を選択するための、時間効率が良く、シンプルで信頼性の高い手法です。このテクニックはシンプルで簡単で、初めて実験を行うには忍耐と注意が必要です。
S遺伝子型の同定とS特異的プライマーの設計には、より多くの注意と注意が必要です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の大学院生であるYu Huです。マジアザボン、シトラスマキシマ、花を実験室に持って行って花粉収集を開始します。
ピンセットを使用して葯を収集し、ろ紙が入ったペトリ皿に入れます。葯が入っているペトリ皿を摂氏28度のオーブンに24時間入れて、花粉粒を乾かします。乾燥後、色が変化するシリカゲルが入ったマイクロセントロン気密ジップロックバッグに花粉を保存します。
袋を閉じて、花粉の種類の名前と保管日を袋にラベル付けします。300マイクロリットルの液体培地を2ミリリットルの遠沈管のキャップに注ぎ、受粉ブラシを使って花粉を均等に振りかけます。花粉を加湿したブラックボックスに入れ、摂氏28度で12時間インキュベートします。
インキュベーション後、1, 000マイクロリットルのピペットチップから上部の1ミリメートルの先端を切り取り、少量の培養液で花粉を吸引します。花粉を顕微鏡スライドの中央に置き、カバースリップで覆います。完了したら、10倍対物レンズを使用して倒立顕微鏡で標本を観察します。
各反復でほぼ同じ花粉密度を使用して、3つの独立した反復を実行します。受粉のために、受粉ブラシを使用して十分な量の生存可能な花粉を柱頭の表面に広げ、雌しべを傷つけないようにします。受粉した花を硫酸塩の紙袋で覆い、ペーパークリップで袋を密封して、遺伝子型が異なる花粉による受粉を防ぎます。
種の名前と受粉の数と時間をラベルに書いてください。受粉した花の近くの枝にラベルを掛けます。受粉後約3〜4日で受粉バッグを取り出し、受粉した花をジップロックバッグに集めます。
すぐに花から花びら、容器、卵巣を取り除き、スタイリングに融合した柱頭を、新しく調製した固定液が入った遠沈管に浸します。固定液中の柱頭とスタイルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、柱頭を洗う前に固定液を捨て、95%エタノールで2〜3回スタイリングします。
次に、70%エタノール溶液をスタイルに追加し、サンプルが溶液に完全に浸されていることを確認します。この段階でのスタイルは、摂氏4度で1〜2か月間保存できます。アニリンブルー染色の場合は、70%エタノールに保存されたスタイルサンプルを蒸留水で3〜4回洗浄します。
4モルの水酸化ナトリウム溶液に浸して密封してから、摂氏65度の水浴で60分間インキュベートします。この手順では、スタイルの色が黄白色からオレンジ赤色に変わります。次に、スタイルを蒸留水に浸します。
30分後、蒸留水を捨て、蒸留水で3〜4回、またはスタイルの色が黄色になるまでスタイルを洗います。次に、サンプルが水没するまでアニリンブルーを加え、暗所で12時間インキュベートします。花粉管の成長を蛍光顕微鏡で観察します。
スライドを平らなテーブルに置きます。メスを使用して、スタイルを縦軸に沿って2つに分割します。スタイルの半分をスライドガラスに置き、スライドの表面にポリエチレングリコールを2〜3滴加えます。
次に、カバースリップで覆います。完了したら、スライドを顕微鏡ステージの開口部の上の上に置き、10倍の対物レンズを使用して視覚化します。DAPIフィルターを使用して、花粉管の成長を観察します。
受粉の種類ごとに5つのスタイルを観察します。カンキツマキシマの花粉生存率と発芽率は、蛍光顕微鏡を使用して定量化されました。互換性のある花粉は柱頭の表面で首尾よく発芽し、正常な花粉管を生成し、それが成長し、最終的に卵巣での受精につながりました。
対照的に、互換性のない花粉管は、スタイルの約2/3で成長し、その後成長を停止しました。アガロースゲル電気泳動は、S遺伝子座特異的プライマーを用いて増幅されたDNA産物を検出した。500〜1,000塩基対の間のDNA産物の増幅を示した。
対応するS遺伝子型が同定された。この方法を使用して、異なる柑橘類種の21のSハプロタイプが同定されました。受粉ステップは重要です。
受粉が成功した場合にのみ、その後の花粉管の観察を確実にすることができます。この手法は、自己不適合特性を分析し、自己不適合の女性決定要因を調査および特定するために使用されました。この方法は、自己不適合の研究や繁殖プログラムにとって重要です。
また、農業コミュニティが果樹園に花粉症の木を選択するのを容易にすることもできます。
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概要
この研究は、柑橘類の品種における花粉の適合性と不適合性を迅速に判定する手法を提示し、特にS遺伝子型の同定とそれが育種プログラムに与える影響に焦点を当てています。この技術は、受精を成功させるために必要な適合性のある花粉媒介木を選択するための簡単で信頼性の高いアプローチを提供します。
主要な研究要素
研究分野
- 柑橘類の品種における花粉の適合性
- 自家不和合性の特徴
- 育種プログラムの効率
背景
- 適切な花粉媒介木を選択することの重要性
- 育種におけるS遺伝子型同定の役割
- 植物生物学における自家不和合性研究の重要性
使用した方法
- 花粉管の成長を観察するための顕微鏡技術
- 柑橘類（Citrus maxima）
- DNA増幅解析のためのアガロースゲル電気泳動
主要な結果
- 適合性のある花粉の柱頭上での成功した発芽
- 不適合な花粉管は成長が減少
- 異なる柑橘種において21のS遺伝子型の同定
結論
- この技術は柑橘類における自家不和合性に関する重要な洞察を提供します。
- 育種家が果樹園に適切な花粉媒介種を選択することを容易にします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable identification of self- and inter-(in)compatibility in citrus via S-genotype analysis and pollen tube microscopy addresses a critical bottleneck in breeding and germplasm selection. This method enables rapid, reproducible determination of compatible parental lines, directly impacting early-stage target validation and portfolio triage in crop biotechnology. Its integration streamlines the selection of pollinizer trees, reducing time-to-decision for breeding and orchard establishment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of self-incompatibility mechanisms through S-genotype identification.
- Supports biological de-risking by clarifying compatibility relationships among candidate cultivars.
- Facilitates predictive confidence in parental selection for breeding pipelines.
Screening & Assay Development
- Standardizes pollen compatibility assays using quantitative pollen tube growth readouts.
- Improves reproducibility and comparability across independent pollination experiments.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic and phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genotype-phenotype relationships for translational continuity in breeding programs.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate cultivars based on compatibility profiles.
- Provides mechanistic de-risking for selection of breeding parents and pollinizers.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits at the intersection of early discovery, lead identification, and pre-breeding workflows in crop R&D.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of self-incompatibility and clarifies S-locus-driven compatibility pathways.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible pollen tube growth metrics for compatibility assessment.
- Analytics: Provides PCR-based S-genotype outputs and microscopy-based phenotypic readouts for robust comparison.
- Translational Research: Ensures continuity from genotype identification to phenotypic validation in breeding pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform for compatibility testing across diverse citrus germplasm.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in compatibility group assignment and parental selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in compatibility testing workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for breeding and orchard establishment, reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cultivars and pollinizers for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR-based genotyping and fluorescence microscopy.
- Needs access to electrophoresis, imaging, and sample preparation infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of pollination and staining protocols.
- Adaptable to diverse citrus species but may require primer redesign for novel S haplotypes.
- Dependent on careful execution of manual pollination and sample handling steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:02
Pollen Collection
1:40
In Vitro Pollen Germination Test
2:27
Pollination
3:02
Sampling, Fixation, and Preservation
3:55
Aniline Blue Staining
4:46
Fluorescence Microscopy
5:26
Results: Determining Pollen Compatibility and Incompatibility in Citrus Cultivars
6:16
Conclusion
