Name: 細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3D脱細胞化マトリックスの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶ マウス胎児骨格筋の脱細胞化マトリックス調製法。C2C12筋芽細胞の増殖・分化をサポートし、子宮内で発症する筋ジストロフィーのメカニズム解明と新規治療標的発見に貢献するモデルを提供します。

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この研究は、Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon;契約番号23049)、MATRIHEALTHプロジェクト、およびcE3cユニット資金UIDB/00329/2020によって資金提供されました。MATRIHEALTHプロジェクトを支援することを選択したドナーのエンリケ・メイレレスに感謝します。この作業は、ポルトガルのバイオイメージングプラットフォーム(参照PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122)のノードである理学部顕微鏡施設のインフラストラクチャの恩恵を受けており、画像の取得と処理を支援してくれたルイスマルケスに感謝します。最後に、技術サポートを提供してくれたマルタパルマと寛大な貢献をしてくれた研究チームに感謝します。

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<li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li>
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<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+a+ToF-SIMS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tissue+engineering+with+decellularized+rhesus+monkey+kidneys%3A+age-related+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+in+vivo+validation+of+tissue-engineered%2C+small-diameter+vascular+grafts+from+decellularized+aortae+of+fetal+pigs+and+canine+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101(2017).</li>
<li>Wu Young, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+fetal+matrix+suppresses+fibrotic+gene+expression+and+promotes+myogenesis+in+a+rat+model+of+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

ECMは、すべての組織に存在する高分子の複雑なネットワークであり、細胞の挙動と機能の調節に重要な役割を果たします2。ECMは、細胞が付着するための物理的な足場として機能し、増殖、運動性、分化、アポトーシスなどの細胞プロセスをアクティブに調節する手がかりを提供します。したがって、ECMの適切な形成と維持は、発生と恒常性の両方にとって不可欠です1。
2D細胞培養モデルは広く使用されていますが、より高度な3Dプラットフォームに取って代わられることも増えています。これは、2D培養には細胞の挙動に影響を与える化学的および物理的手がかりがないためですが、3D培養は、ネイティブ組織の分子および細胞ダイナミクスを研究するためのより現実的な代替手段と見なされているためです11。組織の脱細胞化は、様々な組織または器官系にわたる多数の研究において実証されているように、生物学的組織の微小環境をより厳密に模倣する足場の産生をもたらす<sup class="xref"...

細胞外マトリックス(ECM)は、組織の主要な構成要素であり、それらの非細胞成分を表す。この3次元(3D)構造は、細胞を物理的にサポートするだけでなく、生物の発生に関与する生化学的プロセスにおいても重要な役割を果たします1。組織特異的ECMの形成は、細胞とそれらのニッチとの間の複雑な相互作用の結果として、様々な細胞内および細胞外の刺激の影響を受ける発生中に起こる。ECMは、時間空間的に化学的および機械的再配列を起こし、細胞の運命に直接影響を与える非常に動的な構造です2。ECMの最も顕著な特徴の1つは、各組織ECMが、それに含まれる細胞に合わせた異なるトポロジーおよび特性を提供する分子の固有の組み合わせを示すため、その機能の多様性である1。
ECMシグナル伝達とサポートは、発生と恒常性に不可欠であり、破壊されると複数の病理学的状態につながる可能性があります3,4。一例は、先天性筋ジストロフィーの最も一般的な形態であるLAMA2欠損先天性ジストロフィー(LAMA2-CMD)です。LAMA2遺伝子は、ラミニン211およびラミニン221に存在するラミニンα2鎖をコードし、変異するとLAMA2-CMD5につながる可能性があります。ラミニン211は、骨格筋線維を取り囲む基底膜に見られる主要なアイソフォームです。ラミニン211が異常または不在の場合、基底膜と筋細胞との間のリンクが破壊され、疾患の発症につながる6。LAMA2-CMDの患者は、LAMA2遺伝子の突然変異の種類に応じて軽度から重度の表現型を示します。
ラミニンα2タンパク質の機能に影響を与えると、患者は出生時に重度の筋緊張低下を経験し、慢性炎症、線維症、筋萎縮を発症し、平均余命を縮める可能性があります。今日まで、標的療法は開発されておらず、治療アプローチは病気の症状を緩和することに限定されています7。したがって、この病気の発症に関与する根本的な分子メカニズムを理解することは、適切な治療戦略を開発するために重要です6,8。LAMA2-CMDのモデルであるdyWマウス9を用いた以前の研究では、この病気の発症は子宮内、特に胎児の筋形成10の間に始まることが示唆されています。胎児の筋形成障害がどのように現れるかをよりよく理解することは、LAMA2-CMDの新しい治療アプローチを生み出す上でのゲームチェンジャーとなるでしょう。
in vitro システムは、細胞-細胞および細胞-ECM相互作用を研究するための制御された環境を提供しますが、2D培養モデルにはネイティブ組織の複雑さが欠けています。組織の脱細胞化により、2Dモデルや人工/合成足場と比較して、自然の細胞微小環境をより正確に模倣する組織および発生段階特異的な無細胞ECM足場が生成されます。脱細胞化マトリックス(dECM)は、宿主組織の分子的および機械的手がかりを保存する可能性があり、 in vivo プロセスを理解するためのより良い代替モデルになります11。
脱細胞化に使用できる様々な技術、試薬、および条件がある12、13。この研究では、Silvaら14,15によって記述された胎児マウス心臓の脱細胞化プロトコルがマウス胎児骨格筋に適合し、テストされたすべてのECM成分(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持することが判明しました。このプロトコルには、浸透圧ショックによる細胞溶解(低張緩衝液)、原形質膜溶解およびタンパク質解離(0.05%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS])、およびDNAの酵素的破壊(DNase処理)の3つのステップが含まれます。我々の知る限り、これはマウス胎児骨格筋を脱細胞化するための最初の確立されたプロトコルである。
この3DインビトロシステムをLAMA2-CMDの研究に使用するには、脱細胞化後のラミニンα2鎖を維持することが重要です。したがって、異なる洗剤(SDSおよびTriton X-100)および濃度(0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、および0.5%)がテストされた最適化プロトコルが実装された(データは示されていない)。ラミニンα2タンパク質の細胞除去および保存のための最適な選択は、0.05%SDSであることがわかった。十分に確立された筋芽細胞株であるC2C12細胞16,17を使用して、dECMを播種しました。これらの細胞はdECMに侵入し、増殖し、これらの足場内で分化し、新しいECMタンパク質を合成します。この3Din vitroモデルの作成の成功は、胎児の筋形成、LAMA2-CMDの発症に関与する分子および細胞プロセスを理解するための新しいアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションが破壊される他の筋肉疾患に拡張することができます。

<table><tbody><tr><td>12ウェル細胞培養プレート、フラット、TC、滅菌</td><td>腹部実験器具</td><td>P21021</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩</td>メル<td>ク</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>48 ウェル細胞培養プレート、フラット、TC、滅菌</td><td>腹部ラボウェア</td><td>P21023</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル細胞培養プレート、フラット、TC、滅菌</td><td>腹部ラボウェア</td><td>P21024</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、フラクション V</td><td>NZYtech</td><td>MB04601</td><td></td></tr><tr><td>BX60 蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クライオスタットCM1860 UV</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーR0862</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高グルコースw /安定グルタミンw /ピルビン酸ナトリウム</td><td>Biowest</td><td>L0103-500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy血液&ティッシュキット </td><td>キアゲン</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>メルク</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>バイオウエスト</td><td>S1560-500</td><td></td></tr><tr><td>先端移動ピペット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15387823</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>バイオウエスト</td><td>S2000-100</td><td></td></tr><tr><td>ヘラガード フローキャビネット</td><td>ヘレウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiMark 染色済みタンパク質 標準</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>馬血清、ニュージーランド原産</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- ウサギ IgG</td><td>abcam</td><td>ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- ラット IgG</td><td>abcam</td><td>ab205720</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;-Mouse IgG</td><td></td><td>abcam ab205719</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ v. 1.53t</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチルグリーン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67060</td><td></td></tr><tr><td>MM400 組織溶解剤</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 分光光度計 </td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16% w/v aq. soln., メタノールフリー</td><td>Alfa Aesar</td><td>043368-9M</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (100x) </td><td>GRiSP</td><td>GTC05.0100</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン アレクサ 488 </td><td>サーモフィッシャー サイ</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン ペトリ皿 60x15mm 通気口付き (滅菌)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 3 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td></td></tr><tr><td>S6E Zoom Stereo microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Merck</td><td>11667289001</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト&reg;Plus 接着スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 化学発光基板</td><td>Thermo Scientific</td><td>15626144</td><td></td></tr><tr><td>TCS SPE 共焦点顕微鏡</td><td>Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) &ge;99%</td><td>VWR Chemicals</td><td>28811.295</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution、0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)</td><td>GRiSP</td><td>GTC02.0100</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 (50% Solution)</td><td>ThermoFisher</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright PVDF-CL メンブレンロール (0.22&micro;m)</td><td>Advansta</td><td>L-08024-001</td><td></td></tr><tr><td>&-Collagen I</td><td>abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>&-Collagen IV</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td></td></tr><tr><td>&-Collagen IV</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-398655&</td><td></td></tr><tr><td>α;-Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F-3648</td><td></td></tr><tr><td>&-Laminin &alpha;2 </td><td>シグマ</td><td>L-0663</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MHC</td><td>D.S.H.B.</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>&-マウスアレクサ488</td><td>分子プローブ</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr><td>&-マウスアレクサ568</td><td>分子プローブ</td><td>A11019</td><td></td></tr><tr><td>&-パン-ラミニン</td><td>シグマ</td><td>L-9393</td><td></td></tr><tr><td>&-リン酸化ヒストン3</td>メル<td>クミリポア</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>&-ウサギアレクサ568</td><td>分子プローブ</td><td>A21069</td><td></td></tr><tr><td>&-ウサギアレクサ488</td><td>分子プローブ</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>&-ラットアレクサ488分子</td><td>プローブ</td><td>A11006</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3d脱細胞化マトリックスの調製

Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture

細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の構造的サポートを提供し、さまざまな細胞プロセスに重要なシグナルを伝達する上で重要な役割を果たします。2次元(2D)細胞培養モデルは、完全な3次元(3D)サポートがないため、細胞の挙動が変化し、 in vivo プロセスの理解に不十分になるため、細胞とECMの間の複雑な相互作用を単純化しすぎます。ECM組成と細胞-ECM相互作用の欠損は、さまざまな異なる疾患の重要な原因です。 
一例はLAMA2-先天性筋ジストロフィー(LAMA2-CMD)であり、機能的なラミニン211および221の不在または減少は、出生時または出生直後に検出可能な重度の低張症につながる可能性があります。この疾患のマウスモデルを用いた以前の研究は、その発症が胎児の筋形成中に起こることを示唆している。本研究は、筋肉細胞と胎児の筋肉ECMとの間の相互作用の研究を可能にする3D インビトロ モデルを開発することを目的としており、ネイティブの微小環境を模倣しています。このプロトコルは、E18.5マウス胎児から解剖し、低張緩衝液、陰イオン界面活性剤、およびDNaseで処理した深部背筋を使用します。得られた脱細胞化マトリックス(dECM)は、天然組織と比較して、テストされたすべてのECMタンパク質(ラミニンα2、総ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンI、およびコラーゲンIV)を保持していました。 
C2C12筋芽細胞がこれらのdECMの上に播種されると、それらはdECMに浸透してコロニーを形成し、増殖と分化をサポートしました。さらに、C2C12細胞はECMタンパク質を産生し、dECM内のニッチのリモデリングに寄与した。この in vitro プラットフォームの確立は、LAMA2-CMDの発症に関与するプロセスを解明するための新しい有望なアプローチを提供し、ECMと骨格筋細胞間のコミュニケーションの欠陥が疾患の進行に寄与する他の骨格筋疾患に適応する可能性があります。

脱細胞化プロトコルの目標は、天然組織の組成によく似たdECMを産生することです。脱細胞化プロセスの有効性を判断するために、組織形態の検査、DNAレベルの測定、F-アクチンの染色、免疫組織化学およびウェスタンブロッティング技術を使用した主要なECM成分の分析など、さまざまな方法が採用されました。具体的には、骨格筋組織の5つの主要なECM成分を分析しました。
プロトコル全体を通して、サンプルの外観が変化します(図1B 1-4)。単離後、ミオグロビンの存在により筋肉組織は赤みがかったように見えます(図1B1)。細胞を溶解し、ほとんどの細胞質タンパク質を除去する低張バッファーでインキュベートすると、サンプルは白色に変わります(図1B2)。組織の脱...

この研究では、脱細胞化プロトコルを最適化して、マウス胎児骨格筋の脱細胞化マトリックスを取得しました。C2C12筋芽細胞は、これらのマトリックスにコロニーを形成し、増殖し、分化することができます。この in vitro モデルは、筋ジストロフィーなどの骨格筋疾患の状況における細胞の挙動を研究するために使用できます。

細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3D脱細胞化マトリックスの調製

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various ...

私たちの知る限り、このプロトコルは胎児の骨格筋から脱細胞化マトリックスを生成する最初のプロトコルであり、子宮内で発症し始めるミオパチーを研究するための新しいアプローチを提供します。このプロトコルは、制御された環境で筋細胞の挙動および細胞外マトリックスとの相互作用を研究するために使用できる発生および組織固有のメトリックを生成します。LAMA2-CMDは、出生時に現れ始める先天性筋ジストロフィーです。このモデルは、その発症に関与するパターンメカニズムを解明し、新しい標的療法につながるのに役立ちます。このプロトコルは、さまざまな組織や疾患モデルに適合させることができます。マトリックスとセルの種類に応じて異なる複雑さのレベルを達成でき、システムの多様性を実証します。これは非常に簡単なプロトコルです。最も困難な部分は、サンプルの収集と取り扱いです。しかし、練習すれば、技術的なスキルを簡単に向上させることができます。安楽死させた胎児を一度に1つずつ、氷のように冷たいPBSを含むペトリ皿に移すことから始めます。皮膚と手足を切除した後、胸郭の腹側を切ります。胸骨とその下にある臓器を取り除きます。胎児の背側を上にして配置し、脊柱の頸部を取り除きます。次に、背側脂肪沈着物と深部背筋結合組織を切除します。次に、外科用鉗子を使用して胸郭を固定します。マイクロメスで慎重にこすり、周囲の組織から背中の深い筋肉を切り離します。将来の使用のために、組織を摂氏4度の12ウェル細胞培養プレートのPBSに保管します。長期間、マイナス80°Cの空のマイクロ遠心チューブに組織を保管します。初日に、上軸筋量全体を使用します。1%ペニシリンとストレプトマイシンを含む3ミリリットルの低張バッファーを12ウェルプレートの各ウェルに加えます。筋肉組織片を各ウェルに加え、攪拌しながら18時間一晩インキュベートします。2日目に、細い先端ピペットでバッファーを取り除きます。次に、サンプルを3ミリリットルのPBSで3回洗浄し、毎回1時間攪拌します。PBSを廃棄した後、サンプルを3ミリリットルの0.05%SDS洗剤溶液中で24時間攪拌しながらインキュベートします。3日目に、細かいチップピペットを使用してSDS洗剤を除去し、毎回20分間攪拌しながら、3ミリリットルの低張洗浄バッファーで断片を3回洗浄します。ウェルの溶液を2ミリリットルのDNase溶液に交換し、組織片を摂氏37度で3時間攪拌しながらインキュベートします。DNase溶液を除去した後、毎回20分間攪拌しながら3ミリリットルのPBSで断片を3回洗浄し、最後の洗浄を一晩放置します。サブコンフルエントC2C12細胞を播種したT-25フラスコに、500マイクロリットルのトリプシンを加え、1ミリリットルの完全培地に再懸濁します。10マイクロリットルの懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルー色素と混合し、血球計算盤にロードして細胞数をカウントし、生存率を推定します。層流フード内で、1%ペニシリンとストレプトマイシンを含むPBSを含むペトリ皿に脱細胞化マトリックス(dECM)を入れます。マイクロメスとピンセットを使用して、マトリックスを細かく分けます。断片を96ウェルプレートのウェルに移し、ウェルごとに3〜4個入れます。200マイクロリットルの予熱した完全培養培地を各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で2時間インキュベートします。ウェルプレート内の培地を廃棄し、50, 000個の生存可能なC2C12細胞を含む200マイクロリットルの完全培養培地を各ウェルに加えます。ウェルプレートを2日間インキュベートします。細胞を含むdECMを、400マイクロリットルの完全培養培地を含む48ウェルプレートに移します。マトリックスの剥離を防ぐために2日ごとに培地を注意深く吸引し、8日目まで新鮮な培地を補充します。分化のために、完全培養培地を分化培地に交換し、12日目まで4日間インキュベートします。筋肉組織は単離直後に赤みを帯び、低張緩衝液中でインキュベートした後の細胞溶解により白色に変色した。SDSは筋肉を透明にします。DNase処理後、より小さく透明なdECMが得られた。DNA定量により、天然組織と比較してdECMがほぼ100%減少していることが明らかになりました。dECMおよび天然組織は、ラミニンアルファ2およびラミニンタンパク質について同様の尿細管染色を示した。天然組織のウェスタンブロット分析では、ラミニンアルファ2サブユニットについて2つのバンドが示されましたが、dECMでは3つの小さなバンドが検出されました。総ラミニンについて、dECMサンプルは、天然組織と比較した場合にタンパク質断片化を示した。フィブロネクチンおよびコラーゲンは天然組織とdECMsの細胞間質腔に存在した。同様のフィブロネクチンバンドが両方のサンプルに存在し、脱細胞化の影響を受けないことを示しています。dECMではコラーゲンIバンドが観察されませんでした。IV型コラーゲンについては、両サンプルとも同様の管状染色を示した。しかしながら、dECMバンドの分子量は低かった。C2C12細胞はdECMにコロニーを形成して増殖し、多核筋管に融合しました。これらは分化培地中で4日間インキュベートした後にミオシン重鎖タンパク質を発現させた。細胞内および細胞周囲染色は、ラミニンα二鎖、総ラミニン、およびフィブロネクチンについて観察された。脱細胞化マウス骨格足場は、共培養系で細胞を増殖させることで、in vivo環境に近づけることができるため、筋疾患の理解に貢献します。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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心臓の細胞外マトリックス (ECM) は、人生を通して生理学的な改造に耐えながら組織や臓器における主要なプロセスを調整する分子の複雑なネットワークです。胎児と大人の心の標準化された decellularization 3 D コンテキスト ネイティブ...

生体外研究における 3 D のようなプラットフォームとして胎児と成人の心筋組織を外植体の対等な Decellularization

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3 D プリントのための新規プロセス脱行列

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いけにえの中空糸膜細胞培養による細胞外マトリックス繊維の生産

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。...

FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。...

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

このプロトコルは、メタクリル化ゼラチン(GelMA)ハイドロゲルに埋め込まれたヒト骨細胞を用いて、脱細胞化細胞外マトリックスを補完した3D骨構造の製造を説明しています。この方法は低コストで拡張性が高く、基本的な実験機器と互換性があり、筋骨格系疾患の研究のための翻訳プラットフォームを提供します。...

ヒト骨細胞と脱細胞化細胞外マトリックスを用いて筋骨格系疾患をモデル化する3D骨培養プラットフォーム

学ぶ マウス胎児骨格筋の脱細胞化マトリックス調製法。C2C12筋芽細胞の増殖・分化をサポートし、子宮内で発症する筋ジストロフィーのメカニズム解明と新規治療標的発見に貢献するモデルを提供します。

細胞培養のためのマウス胎児骨格筋からの3D脱細胞化マトリックスの調製

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