Name: 単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶ核内フローサイトメトリーによるマウス脳ミクログリアのグローバルヒストン翻訳後修飾定量化法。この高速・高スループット法は神経発達・精神疾患におけるエピジェネティック変化の研究を加速します。

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図5のイムノブロットを手伝ってくれたYanyang Baiに感謝します。この研究は、Canadian Institutes for Health Research [CRC-RS 950-232402 to AC] の支援を受けました。カナダ自然科学工学研究評議会[RGPIN-2019-04450、DGECR-2019-00069からAC];スコティッシュ・ライト・チャリタブル・ファウンデーション[21103からAC]およびブレイン・カナダ・ファウンデーション[AWD-023132からAC];ブリティッシュコロンビア大学アボリジニ大学院フェローシップ(6481からMT);ブリティッシュコロンビア大学院奨学金(6768からMT);Canadian Open Neuroscience Platform Student Scholar Award(10901からJK);ブリティッシュコロンビア大学4年制博士フェローシップ(6569からJK)。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

フローサイトメトリーを用いたマウス脳ヒストン修飾定量

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
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<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
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<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
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<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
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</ol>

著者は何も開示していません。

提示されたプロトコルは、フローサイトメトリーによる全体的なHPTMレベルの定量的評価を可能にします。このプロトコルは新しい方法を示すが、前の調査は同じようなアプローチ26を使用して蛋白質の量的な査定をした。HPTMの全体的なレベルを評価するために使用された以前の方法には、免疫組織化学およびウェスタンブロット16、17、19、20が含まれます。提示されたフローサイトメトリーベースの方法は、定量化が容易な方法ですが、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学は半定量的であり、スループットが低くなります。ウェスタンブロットは細胞溶解に依存しているため、タンパク質の正常化と、実験条件27によって変化しないと想定されるローディングコントロールタンパク質の両方を必要とする。免疫組織化学は半定量的であり、単一細胞レベルで検査せずにタンパク質の量を定量的に評価することは困難であるため、非常に低いスループットです16。同様に、単離されたミクログリアの場合、ウェスタンブロットははるかに多くのタンパク質インプットを必要とするため、収量が限られているため、フローサイトメトリー法を使用することの利点があります19。細胞数が少ないため、同じ動物から複数の染色パネルを実行することができます。
しかし、他の方法と同様に、すべての抗体がフローサイトメトリーでうまく機能するわけではないため、この手法には抗体のコストや入手可能性などの制限があります。さらに、イムノブロットと比較して、必要な抗体の濃度がはるかに高くなります。マルチプレックス化により、同じ細胞パネルに複数の抗体を使用できますが、分析後に細胞から抗体を剥がすことはできないため、細胞の使用は抗体種ごとに1つに制限されます。これは、同じブロットを繰り返し使用できるイムノブロットとは異なります。ただし、抗体の入手可能性とサイトメーターの検出チャネルの数によっては、最大12個のマークを同時に検査することが可能です。
現在の方法では、特定のゲノム位置ではなく、タンパク質発現の全体レベルのみを捕捉しており、グローバルレベルの変化は、個々のゲノム遺伝子座の変化を反映していない可能性があります。同様に、全体レベルで変化が見られないからといって、ゲノム遺伝子座に変化がないというわけではなく、単に全体的な変化の合計が治療間の差がないことを意味するだけである。そのため、この手法は、ゲノム解析に関心のあるHPTMを同定するためのスクリーニングとして使用されることを意図しています。さらに、この方法では、コントロールへの倍数変化として評価される場合を除き、異なるタンパク質マーク間での比較はできません。したがって、これは、タンパク質測定のためのELISAなどの標準曲線ベースの方法と比較して制限されます。
提示されたプロトコルは、生きた脳ミクログリアを分離するための戦略を提供します。このプロトコルは、ミクログリアの単離のためにP2RY12タンパク質の発現に依存しています。しかし、P2RY12はミクログリアの恒常性マーカーであり、5XFAD22などの疾患モデルではダウンレギュレーションされ得る。したがって、疾患モデル動物を使用する場合は、ミクログリアの単離を助けるために、TMEM119、CD11b、またはCD45などの他のマーカータンパク質を必ず選択してください23。同様に、このプロトコルを海馬や皮質からの分離として提示します。このプロトコルは、白質領域を含む他の脳領域からミクログリアを分離するために機能しますが、関心領域のサイズによっては、十分なミクログリアを得るために複数の動物が必要になる場合があります。
提示されたプロトコルは、生きた脳ミクログリアを確実に単離することができますが、単離段階では、誤って実行すると細胞収量を低下させる可能性のあるいくつかのステップがあります。
このプロトコルの灌流は、免疫濃縮フラグメント中のミクログリアの割合が高くなり、ソーターでの時間が短縮されます。ただし、灌流は必要なく、必要に応じて他の安楽死方法を使用できます。
ミクログリアの単離中は、ミエリンを完全に除去する必要があります。フローサイトメーターは、細胞が細いチューブを高速で移動できることに依存しています。ミエリンは粘度が高く凝集しやすいため、サイトメーターに問題を引き起こし、しばしば目詰まりを引き起こし、機器の損傷やサンプルの破壊を引き起こし、収量を大幅に低下させます。下流で問題が発生しないように、免疫が豊富な断片の収集中にすべてのミエリンを除去するように注意してください。
プレート染色とチューブ染色:このプロトコルでは、1.5 mLチューブまたは96ウェルプレートのいずれかで細胞を染色するための2つのオプションについて説明しました。それぞれのユースケースは実験によって異なります。しかし、一般的にチューブ染色は、フリックを誤って行うと細胞が失われるリスクがあるため、プレート染色よりも収量に影響を与えるリスクが低くなります。各チューブの上清を吸引するのに時間がかかるため、プレート染色ははるかに高速です。固定前(選別など)は、収率を最大化し、紛失のリスクを減らすためにチューブ染色を行ってください。しかし、HPTM解析では、細胞を核内染色のために固定すると、ペレットはより安定し、フリックによる損失のリスクが軽減されます。
不連続な密度勾配の確立:層状化を確立する際、免疫濃縮画分を得るためには、層を適切に設定することが不可欠です。層が乱れたり混ざり合ったりして曇っているように見えると、細胞が目的の位置に選別されず、免疫が豊富な細胞画分を得ることが困難になります。これが発生した場合は、密度培地でスピンしてミエリンを除去し、残りの画分全体を回収し、3 mLのFACSバッファーで1 mLの密度培地に希釈し、よく混合します(これには複数のチューブが必要です)。ブレーキを0にして、500 x g で10分間スピンします。上清を廃棄し、~300 μL の溶液のみを残します。サンプル全体と染色剤を採取します。これにより、ソート率が低下し、サイトメーターで費やす時間が長くなりますが、収量は同等です。
単離法を用いる場合、RNAとHPTM評価用の細胞を同じマウス脳から採取できることは有益です。この状況では、生きたミクログリアを選別した後、細胞を分割して、RNA評価に一部(適切なRNA収量を得るための最小入力細胞数は75,000細胞)と、さらなるフローサイトメトリー分析(MFIの良好な決定のためのウェルあたり最小10,000細胞)に割り当てることができます。この場合、フローサイトメーターによるソーティングが必要です。ただし、細胞をHPTM解析にのみ使用する場合は、ソーティングは不要であり、免疫画分をP2RY12抗体およびHPTM抗体で染色できます。その後、フローソーティングの場合と同様に、P2RY12+ミクログリアに対してサイトメーターのゲーティングを設定し、ミクログリア内のHPTMシグナルのみを解析することができます。ソートをなくすことで、プロトコルをより速く、より費用対効果の高いものにすることができます。さらに、培養細胞からHPTMを評価する場合は、染色プロトコルから始めるだけで十分であり、 図6に示すように細胞マーカー抗体は必要ありません。HPTM評価プロトコルは、培養細胞、初代細胞、IPSC由来細胞など、多くの細胞タイプに使用できます。
最後に、ミクログリアの分離下流での用途は2つしか紹介していませんが、ChIP、CUT&Tag、CUT&RUNなどのエピジェネティックな手法など、他にも多くの用途があります。ゲノムエピジェネティック技術の場合、特定の遺伝子座での変化を特徴づけることが関心事であるが、実験に合わせたクロマチンマーク11 のライターおよびイレイザー用の特異的阻害剤を選択し、プロファイリングされたミクログリアエピジェネティック修飾が、酵素消化などの単離手順のどのステップからの技術的アーティファクトでもないことを確認する。定量的フローサイトメトリーなどを用いてエピジェネティックマークの全体レベルの変化を評価する場合、手技によって誘発された変化は、全体レベルで検出されるほど大きくはないと予想されます。
全体として、ここで紹介した方法は、フローサイトメトリーによってヒストン修飾やその他のエピジェネティックな変化の全体的レベルを定量化するための新しいシングルセル法を提供します。この手法は、 in vivoでLPSに応答するミクログリアのエンハンサーマーカーH3K27acの全体的な変化を検出するのに十分な感度があることを実証しました。これは、LPS刺激後のH3K27acの以前のChIPシーケンシングと一致しており、LPS28に反応するエンハンサーの劇的なリモデリングが示されています。この方法の応用により、発生および疾患におけるさまざまな脳細胞タイプにわたる全体的なエピジェネティックな変化を調べることができます。

エピジェネティクスは、基礎となるDNA配列を変化させることなく遺伝子発現を調節するメカニズムの研究です。遺伝子発現のエピジェネティックな制御は細胞内で動的であり、さまざまな環境刺激に対して迅速かつ協調的な応答を可能にします。この動的調節は、ヒストンタンパク質(H2A、H2B、H3、H4)がDNA1によってしっかりと巻かれた八量体コアに組み立てられたヌクレオソームのレベルでのクロマチン構造の変化によって部分的に起こります。ヒストンタンパク質とDNAの相互作用は、DNAの転写機構へのアクセスを制御し、最終的に遺伝子発現やクロマチン生物学の他の側面を制御することができます2。ヒストンタンパク質は、負に帯電したDNA骨格と静電相互作用を形成する正に帯電した残基を特徴とする非構造化テールを持っています。これらの相互作用により、DNAが密集し、DNAへのアクセス性が低下します。ヒストン翻訳後修飾(HPTM)と呼ばれるヒストンテールへの共有結合修飾は、これらの相互作用を調節することができます3,4。最もよく特徴づけられているHPTMには、ヒストンテールのアセチル化とメチル化があり、ヒストンテールとDNAの間の静電相互作用の親和性を変化させ、基礎となるDNAへのアクセス性に差があり、特定の部位でこれらのHPTMを認識する転写因子が動員されます。HPTMは、HPTMを認識するリーダー、沈着するライター、HPTMを除去する消しゴムと呼ばれる3つの重要な酵素によって制御されています。したがって、リーダー、ライター、または消しゴム酵素の動員または溶解は、最終的にHPTMの状況を変え、クロマチンの構造と機能を支配し、それらの制御と読み出しを細胞生物学と機能の理解に不可欠にすることができます3,4。
中枢神経系(CNS)の細胞は、環境刺激に適応するためにトランスクリプトームを変化させるため、エピジェネティックに柔軟です。DNAメチル化、ノンコーディングRNA、HPTMなどのエピゲノムの変化が、記憶形成やシナプス機能に重要な役割を果たしていることが示唆されています5。関連するリーダー、ライター、または消しゴムの操作によってHPTMダイナミクスを混乱させると、連想学習と長期的な増強がブロックまたは強化される可能性があります6,7,8。中枢神経系に常在する免疫細胞であるミクログリアは、エピゲノムのダイナミックな変化を通じて免疫刺激に応答してトランスクリプトームを急速に制御します9,10,11。ミクログリアのエピゲノムとトランスクリプトームは、脳環境から除去された後、培養培地中でわずか数時間で変化することが研究で示されているため、局所的な脳環境へのこの高いレベルの適応は、孤立した状況での調査を困難にします11。さらに、ミクログリアは脳細胞の10%しか構成していないため、組織全体のレベルでの変化を調べる測定は感度と特異性に欠けています12,13。その結果、ミクログリアを迅速に単離して、HPTMレベルなどのエピジェネティックな変化を調べる必要があります。
HPTMの検査に一般的に使用される方法には、クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)やターゲット下での切断、タグメンテーションシーケンシング(CUT&Tag-seq)などがあります4。これらの手法は、個々のHPTMに高度に特異的であり、特定のゲノムコンテキスト内のHPTMの存在を知らせることができるが、1回の実験で多くの可能なHPTMのうちの1つしか調べることができない11,14したがって、多大な時間と費用の投資を必要とするそのような実験を進める前に、まず地球規模の変化を調べることによって、さらなる調査のために潜在的に興味深いHPTMのリストを絞り込むことは非常に価値があるHPTM のレベル。世界のHPTMレベルを調べるための2つの主要なアプローチは、免疫組織化学とウェスタンブロット分析ですが、どちらのアプローチも半定量的でスループットが低く、多数の組織切片または単離細胞を必要とします15,16。そこで、全球のHPTMレベルを迅速かつ単一細胞レベルで調べることができる高感度で定量的な手法の開発を目指しました。
提示されたプロトコルは、核内フローサイトメトリーを使用して、全体的なHPTMレベルを迅速に検出することを可能にします。がん細胞に関する以前の研究は、臨床的観点からグローバルレベルを調べることの重要性を正当化しています17,18。また、関心のある特定のHPTMのゲノム位置を評価する前に、スクリーニング方法としてグローバルレベルを使用する研究も一般的です19,20。ミクログリアの場合、細胞収量が低いため、単離後の全体的なレベルの評価は困難です。Panらは、3匹の動物のミクログリアをプールしてウェスタンブロットによるタンパク質レベルの検出を可能にした単離されたミクログリアからの全体的なHPTMレベルを提示しています19。当社のプロトコルを使用することで、はるかに少ない細胞インプットで全体的な変化を検出できるため、動物ごとに複数のマークをスクリーニングでき、サンプルをプールする必要がなくなります。
ここでは、単離されたミクログリアの定量的核内フローサイトメトリーを介してHPTMレベルを迅速に検出するプロトコルについて説明します。簡潔にするためにHPTM定量に特化していますが、このプロトコルは、リーダー、ライター、および消しゴム酵素のグローバルレベルの定量化にも同じ方法で使用できます。このプロトコルは、ミクログリアの単離法と、HPTMレベルを決定するためのフローサイトメトリーベースの方法の2つの部分に分かれています。単離法により、RNA単離とHPTMレベル評価の両方に使用できる細胞が得られ、同じサンプルから遺伝子発現とHPTMレベルを評価できます。さらに、HPTM評価の方法は、プロトコルに示されているように、他の細胞タイプで使用できます。

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 遠心分離チューブ、ポリプロピレン、滅菌&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24-well Clear Not Treated Plates</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear Polystyrene Microplate, Clear Round bottom, non treated surface</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>9649S</td><td>希釈: 1:100</td></tr><tr><td>アセチルHistone H4 K8 (2594)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>2594S</td><td>希釈率: 1:100</td></tr><tr><td>アセチルヒストン H3 K27 (D5E4)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>8173S</td><td>希釈率: 1:100</td></tr><tr><td>アセチルヒストン H3 Lys27 (MA523516)</td><td>Invitrogen</td><td>MA523516</td><td>希釈率: 1:100</td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>アンチヒストン H3 (トリメチル K4)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>希釈率: 1:100</td></tr><tr><td>抗ラクチルヒストン H4 (Lys 12) Rabbit mAb</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>希釈率: 1:250</td></tr><tr><td>抗 L-ラクチルリジン Rabbit pAb</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>希釈率: 1:250</td></tr><tr><td>Apc 抗 P2RY12 抗体、クローン: S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Cyto-Last Buffer</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド、無菌</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチマウス AlexaFluor488</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>715-546-150</td><td>希釈率: 1:500</td></tr><tr><td>ロバ アンチウサギ AlexaFluor488</td><td>ABclonal</td><td>AS035</td><td>希釈:1:500</td></tr><tr><td>ロバ アンチ ウサギ アレクサフルオロ568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>希釈率: 1:500</td></tr><tr><td>ロバ アンチ ウサギ ブリリアント バイオレット 421</td><td>バイオレジェンド</td><td>406410</td><td>希釈率: 1:500</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 使い捨て目盛り付きトランスファー ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 使い捨て PES フィルターユニット、250mL&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>H3K18ac ポリクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>720095</td><td>希釈率: 1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>希釈: 1:100</td></tr><tr><td>KONTESダウンスティッシュグラインダー 125mm 7mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>希釈: 1:250</td></tr><tr><td>リポポリサカライド&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads Compensation Beads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical</td><td>Cedarlane</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>VWR</td><td></td><td></td>RC57004</tr><tr><td>QIAシュレッダー</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>レインボー蛍光粒子、1 ピーク (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity</td><td>BioLegend</td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free Microfuge Tubes、1.5 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>丸底ポリプロピレンチューブ、キャップ付き、5 mL</td><td>コーニング</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>トリプトライド</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>真の核転写因子バッファーセット</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS (抗マウス CD16/32) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>ゾンビ アクア フィックス可能 バイアビリティ キット</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

遺伝子発現制御は、ヒストンテールへの翻訳後修飾の付加や除去など、クロマチン構造の修飾によって部分的に行われます。ヒストン翻訳後修飾(HPTM)は、遺伝子発現または抑制を促進することができます。例えば、ヒストンテールリジン残基のアセチル化は、正電荷を中和し、テールと負電荷を帯びたDNAとの相互作用を減少させます。ヒストンテールDNA相互作用の減少により、基礎となるDNAへのアクセス性が向上し、転写因子へのアクセスが増加します。アセチル化マークは、ブロモドメイン含有転写活性化因子の認識部位としても機能し、遺伝子発現の亢進をもたらします。ヒストンマークは、細胞分化中、およびさまざまな細胞環境や刺激に応答して動的に制御できます。次世代シーケンシングアプローチにより、個々のヒストン修飾のゲノム位置を特徴付け始めていますが、同時に調べることができるのは1つの修飾のみです。HPTMには何百もの異なるものがあるため、より広範なゲノムシーケンシングアプローチを実施する前に、ヒストン修飾のスクリーニングに使用できるグローバルHPTMのハイスループットで定量的な測定方法を開発しました。このプロトコルは全体的なHPTMsを検出する流れのcytometryベースの方法を記述し、生体 内の ティッシュからの文化のセルか隔離されたセルを使用して行なうことができる。細菌由来の免疫刺激(リポ多糖)に応答するHPTMの全体的なシフトを検出するためのアッセイの感度を実証するために、単離されたマウス脳ミクログリアからの例データを提示します。このプロトコルは、HPTMの迅速かつ定量的な評価を可能にし、抗体によって検出できるあらゆる転写調節因子またはエピジェネティック制御因子に適用できます。

成体マウスを経心灌流し、ミクログリア単離のために犠牲にした。ミクログリアを氷上で単離し、P2RY12-APCおよびバイオレット525生死抗体で染色した。P2RY12が陽性で、バイオレット525の生死染色が陰性と判定された細胞を、生きたミクログリアとして選別した。解剖したマウス脳からのミクログリアの平均収量は、1.28 x 105 ± 0.05(平均±標準誤差(SEM)、N = 100)でした。雌(1.25 x 105 ± 0.09 [平均±SEM、N=46])および雄(1.32 x 105 ± 0.07 [平均±SEM、N=54])マウス(t(98)=0.6365、p=0.526)のミクログリアの収量に差はありません。特定の脳領域から単離した場合、マウス皮質からのミクログリアの平均収量は8.3 x 104 ± 0.08(平均± SEM、N = 15)であり、マウス海馬からのミクログリアの平均収量は4.1 x 104 ± 0.02(平均±SEM、N = 16)です。予想通り、各脳領域からのミクログリアの収量には有意差があります(F(2, 128)=25.25, P&lt;0.0001)。ミクログリア単離後、低インプットRNA単離キットを用いて単離細胞からRNAを抽出した。一貫して RNA 完全性スコア (RIN) は 9.0 (9.62 ± 0.05) を超え、細胞あたりの RNA の平均収量は 0.25 ± 0.01 pg でした (平均 ± SEM、N=32; 補足ファイルS2)。
成体マウスは、犠牲の24時間前に1 mg / kgのリポ多糖(LPS)を腹腔内に注射されました。.マウスにHBSSを経心灌流し、記載されたプロトコルに従って脳全体からミクログリアを単離した(図5A)。各染色について、20,000〜30,000個の細胞を抗体の各パネルに割り当てました。ヒストン3リジン27アセチル化(H3K27Ac)の全体的なレベルを、単離されたミクログリアでフローサイトメトリーによって評価しました。雌雄マウスでは、LPS処理により、雌性でMFIが正常化されると、H3K27Acの増加が誘発された(t(6)=9.676, p&lt;0.0001;図5B)。染色された細胞のヒストグラムを調べると、集団は同様の変動で正規分布したままです。しかし、細胞は蛍光の増加にシフトし、その結果、MFIが増加しました(図5C)。同じ処理でH3K9Acを調べると、H3K9Acも同様に増加しています(t(6)= 7.299、p = 0.0003;図5D,E)しかし、H3K9AcシグナルのPBSに対するLPSの倍率変化はH3K27Acシグナルよりも小さい。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg"> 図5:単離されたミクログリアにおけるヒストンのアセチル化の全体的な変化。 (A)マウスは、犠牲の24時間前にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または1 mg / kgのリポ多糖(LPS)を腹腔内に注射されます。ミクログリアは免疫濃縮画分から採取され、フローサイトメトリーおよび全体的なヒストン翻訳後修飾評価のために固定されます。蛍光強度の中央値は、タンパク質発現の代理として評価されます。BioRender.com で作成。(B)H3K27Acの全体的なレベルは、LPS処理に応答して増加しました。PBSへのフォールド変化は、実験とセックスで正規化されています。対応のない両側t検定、t(6)=9.676、p&lt;0.0001。棒グラフはSEM±平均を示しています。 N = 8匹の動物。2 つの独立した実験で条件ごとに 2 つ。(C)H3K27Ac蛍光強度のシフトを示すヒストグラムの例。モーダルは、PBSを注入したマウスとLPSを注入したマウスのヒストグラムを示しています。(D)H3K9Ac蛍光強度のシフトを示すヒストグラムの例。モーダルは、PBSを注入したマウスとLPSを注入したマウスのヒストグラムを示しています。(E)H3K9Acの全体的なレベルは、LPS処理に反応して増加しました。PBSへのフォールド変化は、実験とセックスで正規化されています。対応のない両側 t 検定、t(6)=7.299、p=0.0003。棒グラフはSEM±平均を示しています。 N = 8匹の動物。2 つの独立した実験で条件ごとに 2 つ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

私たちの研究は、脳内の遺伝子発現を制御する基本的な制御メカニズムを理解することを目的としており、特に、これらのメカニズムの破壊が神経発達および神経精神医学的状態にどのように寄与するかを理解することに関心があります。私たちは、遺伝的危険因子と環境的危険因子がどのように組み合わさって細胞機能を変化させ、行動障害を引き起こすかを理解することに焦点を当てています。このプロトコルには、単離されたミクログリアにおけるヒストン修飾のハイスループットスクリーニングのための方法が含まれており、ハイスループットシーケンシングおよび機能フォローアップ研究にコミットする前に、数十の異なるエピジェネティック修飾をスクリーニングすることができます。私たちのプロトコルは、西洋のプロットと同様のグローバルな組織修飾の尺度を提供します。しかし、私たちの手法は、より高速で、必要な入力セルが少なく、定量的であり、多重化が可能です。

quantification-global-histone-post-translational-modifications-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、胚性マウス脳から一次海馬ニューロンを培養する方法を説明する。培養ニューロンの細胞外表面上の主要な組織適合性複合体クラスIの発現は、次いでフローサイトメトリック解析によって評価される。...

フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

ここでは、フローサイトメトリーを使用してvGLUT1陽性シナプスとpHRodo...

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

このプロトコルは、フローサイトメトリーとシングルセルRNAシーケンシングを組み合わせて、出生後早期マウス脳の小脳におけるミクログリア細胞の状態を単離し、特徴付けます。酵素解離、パーコール遠心分離、免疫染色を使用してミクログリアの不均一性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるミクログリアの役割の理解を深めます。...

出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析

フローサイトメトリーは、特定の細胞集団を単離して解析するための強力なツールです。本プロトコルでは、新生仔トランスジェニックマウスの蝸牛組織からLacZ発現細胞を単離する手順について説明します。単離した蝸牛細胞を、フローサイトメトリーによる分離に先立ち、蛍光標識されたβ-galactosidase基質を用いて標識しました。...

フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

ここでは、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルスの脳室内注射による広範なニューロン伝達の技術を示しています。...

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

マウスの脳の血管コンパートメントの浄化を可能にするプロトコルを記述します。単離された脳血管には、タイトジャンクションによってリンクされ、連続した基底層、周皮細胞、血管平滑筋細胞、および血管周囲星膠膜に囲まれた内皮細胞が含まれます。...

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膜輸送の研究は、神経機能を理解するために重要である。ここでは、ニューロンの小胞の運動性を定量化する方法を紹介します。これは、神経系における膜輸送の定量化に適合させることができる便利な方法である。...

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

マウスの坐骨神経内のセルのコンテンツの定量的解析は組織の欠乏のために困難です。このプロトコルでは、組織の消化と個々...

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ニューロン、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ稚魚の脳生理学的および病理学的条件の下でからを分離するためのプロトコルを提案します。分離時にこれらの細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するから RNA を抽出します。このプロトコルは、qPCR とトランスクリプトミクスのような下流の分析を実行するため高品質の RNA...

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

この資料の目的は、ヒストン H3、H4...

H3 ・ H4 ヒストン蛋白質細胞および脳組織におけるアセチル化ヒストンの定量化の浄化

学ぶ核内フローサイトメトリーによるマウス脳ミクログリアのグローバルヒストン翻訳後修飾定量化法。この高速・高スループット法は神経発達・精神疾患におけるエピジェネティック変化の研究を加速します。

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

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