Name: カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶ二重色素光学マッピングを用いたCPVTモデルマウスの心臓電気生理学的特性評価法。膜電位と細胞内カルシウムを同時計測し、不整脈メカニズムの解明に貢献する革新的アプローチです。

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本研究は、中国国家自然科学基金会(81700308からXOに、31871181からML、82270334からXTに)、四川省科学技術支援プログラム(CN)(2021YJ0206からXO、23ZYZYTS0433、2022YFS0607からXT、2022NSFSC1602からTC)、広西師範大学薬用資源化学分子工学国家重点実験室(CMEMR2017-B08からXO)、 MRC(G10031871181からML02647、G1002082、ML)、BHF(PG/14/80/31106、PG/16/67/32340、PG/12/21/29473、PG/11/59/29004 ML)、BHF CRE at Oxford(ML)助成金。

実験には、体重20〜25gの10〜14週齢の雄の野生型マウスまたはRyR2-R2474S/+マウス(C57BL/6バックグラウンド)を使用します。すべての手順は、中国四川省の西南医科大学の動物管理および使用委員会(承認番号:20160930)によって承認されており、機関が運営する国のガイドラインに準拠しています。
1. 事前準備
<ol><li>ストックソリューション<ol><li>ブレビスタチン原液:2.924 mgの(-)ブレビスタチン粉末を含む元のフラスコに100%ジメチルスルホキシド(DMSO)1 mLを加え、濃度を10 mMにします。</li>
		<li>電圧指示器RH237原液:1 mLの100%DMSOを1 mgのRH237粉末とともに元のフラスコに加え、濃度を2.01 mMにします。</li>
		<li>カルシウムインジケーター Rhod-2 AM 原液:1 mL の 100% DMSO を 1 mg の Rhod-2 AM 粉末に添加し、濃度を 0.89 mM にします。</li>
		<li>Pluronic F127 原液:100% DMSO 1 mL を 200 mg の Pluronic F127 に添加し、濃度が 20% w/v(0.66 mM)になるようにします。</li>
		<li>ストック溶液を200 μLのPCRチューブに21〜51 μL(RH237 21 μL、Rhod-2 AM31 μL、ブレビスタチン51 μL)で分注し、凍結融解を繰り返さないように単回または2回使用します。次に、溶液をアルミホイルで包み、-20°Cで保存します(Pluronic F127原液は室温の暗室に置いた場合を除く)。</li>
	</ol></li>
	<li>灌流液<ol><li>クレブス溶液(単位:mM):1 Lのクレブス溶液(NaCl 119、NaHCO3 25、NaH 2 PO 4 1.0、KCl4.7、MgCl 2 1.05、CaCl2 1.35、およびグルコース10)を調製します。</li>
		<li>0.22 μmの無菌ニードルフィルターで溶液をろ過し、95% O 2/5% CO2で酸素化します。</li>
		<li>40 mLのクレブス溶液を50 mLの遠心チューブに入れ、フォローアップの心臓分離のために4°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>ランゲンドルフ灌流システムおよび光学マッピング装置<ol><li>ランゲンドルフ灌流システムをセットアップします。<ol><li>ウォーターバスをオンにし、温度を37°Cに設定します。</li>
			<li>ランゲンドルフ灌流システムを1Lの脱イオン水で洗浄します。</li>
			<li>吸気管から溶液を灌流し、流出速度を3.5〜4 mL / minに調整します。次に、灌流液をO 2 / CO2(95%/ 5%)ガスで37°Cで酸素化します。 注:灌流システムでは気泡は決して許可されません。</li>
		</ol></li>
		<li>光学マッピングシステムを準備します。<ol><li>電子増倍電荷結合素子(EMCCD)カメラ(512 × 512ピクセル)、レンズ(倍率40倍)、波長分配器発光ダイオード(LED)、心電図(ECG)モニタ、および刺激電極を取り付けます(図1)。</li>
			<li>レンズから心臓の位置までの適切な作動距離を調整します。</li>
			<li>恒温槽の対角線上に2つのLEDを設置して均一に照らし、励起光を発生させる波長を530nmにします。ET525/50スパッタコーティングフィルタを使用して、LEDの帯域外光を除去します。</li>
			<li>ハンドルスイッチを調整してターゲット表面の正方形を均等にし、電圧とカルシウムの画像がアクイジションインターフェースに適切に表示されるようにします。</li>
			<li>レンズの口径を最大径まで回して、電圧やカルシウム信号の漏れを防ぎます。</li>
			<li>カメラのレンズは、恒温槽までの作動距離が長いため、適切な高さに調整し、主に10cmが使用されます。</li>
			<li>カメラの電源を入れると、サンプリング温度が-50°Cで安定します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 手続き
<ol><li>マウスの心臓採取、カニューレ挿入、灌流<ol><li>動物にアベルチン溶液(1.2%、0.5〜0.8 mL)とヘパリン(200単位)を腹腔内に注射して、苦痛と痛みの反射を最小限に抑え、血栓の形成を防ぎます。.15分後、子宮頸部脱臼で動物を犠牲にします。</li>
		<li>はさみで胸を開き、心臓を慎重に採取し、冷たいクレブス溶液(4°C、95%O 2、5%CO2)に入れて代謝を遅くし、心臓を保護します。</li>
		<li>大動脈の周囲組織を切除し、特注のカニューレ針(外径:0.8mm、内径:0.6mm、長さ:27mm)で大動脈をカニューレ挿入し、4-0のシルク縫合糸で固定します。</li>
		<li>3.5〜4.0 mL / minの一定速度でLangendorffシステムで心臓を灌流し、温度を37〜1°Cに保ち±。 メモ: 以降のすべての手順は、この状態で実行されます。</li>
		<li>小さなプラスチックチューブ(直径0.7 mm、長さ20 mm)を左心室に挿入して、チャンバー内の溶液のうっ血を解放し、過負荷を回避します。</li>
	</ol></li>
	<li>励起収縮と二重色素の担持の非結合器<ol><li>浴槽の灌流液に2本のリード線を入れ、心電図アンプボックスと電気刺激コントローラーの電源をオンにしてから、参照された心電図ソフトウェアを起動し、心電図を継続的に監視します。</li>
		<li>心臓が安定した状態に達したら(心臓が~400 bpmでリズミカルに鼓動している)、暗闇の中で次の手順を実行します。</li>
		<li>50 μL の 10 mM ブレビススタチン原液と 50 mL のクレブス溶液を混合して、濃度を 10 μM にします。 ブレビスタチンとクレブス溶液の混合物を心臓に 10 分間常時灌流して、収縮と興奮を切り離し、撮影中の収縮アーチファクトを回避します。</li>
		<li>赤い懐中電灯を使用して、収縮が染料の負荷品質に影響を与えるため、心臓の収縮が完全に停止するかどうかを確認します。</li>
		<li>励起-収縮を切り離した後、15 μL の Rhod-2 AM 原液と 15 μL の Pluronic F127 原液を 50 mL のクレブス溶液中で混合し、最終濃度が 0.267 μM の Rhod-2 AM と 0.198 μM の Pluronic F127 になるようにします。次に、ランゲンドルフ灌流システムで Rhod-2 AM ワーキング溶液で 15 分間心臓を連続的に灌流します。</li>
		<li>細胞内カルシウム色素のローディング中は酸素供給を維持してください。Pluronic F127では気泡が形成されやすいため、冠動脈のガス塞栓を避けるために、灌流システムに気泡トラップを挿入します。</li>
		<li>RH237原液10 μLを50 mLの灌流液に希釈し、最終濃度の0.402 μMに到達し、10分間ローディングします。</li>
		<li>デュアル色素のローディングが終了したら、一連の写真を撮影して、電圧信号とカルシウム信号の両方が分析に適していることを確認します(2つの信号間に相互作用がない)。</li>
	</ol></li>
	<li>光学マッピングと不整脈誘導 注:光学マッピングは、収縮の停止と適切な色素のローディング後に開始され、心臓は上記の2.1(4)で説明した手順のように連続的に灌流されます。<ol><li>励起光用の2つのLEDを点灯させ、適切な範囲で強度を調整します(照明と比較的簡単な撮影には十分な強度ですが、露出オーバーには堅牢すぎません)。</li>
		<li>心臓を検出装置の下に置き、2つのLEDが適切に照らされていることを確認し、光点の直径を2cmに調整します。</li>
		<li>レンズから心臓までの作動距離を10cmに設定することで、サンプリングレートは約500Hz、空間分解能は1ピクセルあたり120 x 120 μmになります。</li>
		<li>信号サンプリングソフトウェアを開き、カメラをデジタルで制御して、電圧信号とカルシウム信号を同時にキャプチャします。</li>
		<li>ミオペーサー電界刺激装置を起動し、ペーシングパターンをトランジスタトランジスタロジック(TTL)、各パルスのペーシング期間2ms、初期強度として0.3Vに設定します。</li>
		<li>30 回の連続した 10 Hz S1 刺激を使用して、ECG 記録ソフトウェアによって駆動される心臓の拡張期電圧しきい値をテストします。1:1の捕捉が実現されるまで、電圧振幅を徐々に増やします(ECGモニターからのQRS波、活動電位(AP)、およびカルシウム過渡現象(CaT)信号を確認します)。</li>
		<li>電圧閾値を決定した後、左心室 (LV) 頂点 (ELVA) の心外膜に取り付けられた一対の白金電極を使用して、拡張期電圧閾値の 2 倍の強度で心臓のペースを調整します。</li>
		<li>S1S1プロトコルを実装して、カルシウムまたは活動電位の代替および反発特性を測定します。基本サイクル長100msで連続して心臓のペースを調整し、50msに達するまで、次のシーケンスごとにサイクル長を10ms減らします。各エピソードには、2msのパルス幅を持つ30の連続した刺激が含まれています。同時に、刺激の前に光学マッピングを開始します(サンプリング時間には、~10の洞リズムとペーシング時間が含まれます)。</li>
		<li>S1S2 刺激プロトコルを使用して心室有効耐火期間 (ERP) を測定するには、S1S1 ペーシング サイクル長を 100 ms とし、S2 を 60 ms で結合し、S2 が異所性 QRS 複合体を捕捉できなくなるまで 2 ms ずつ減らします。</li>
		<li>不整脈誘発の場合、50 Hzのバーストペーシング(パルス幅2msで50回の連続電気刺激)を永続的に行い、2秒の安静後に同じペーシングエピソードを実行します。</li>
		<li>興味深い不整脈性心電図波が発生したときに同時光マッピング記録をすぐに開始できるように、連続的な高周波ペーシング期間中に心電図記録を注意深く観察します(ほとんどの不整脈は電気ペーシングによって誘発されるため、光信号はサンプリングされます重要な心臓イベントが失われた場合、バーストペーシングの2〜3秒前に)。</li>
		<li>EMCCDカメラ(サンプリングレート:500Hz、画素サイズ:64×64)による画像。</li>
	</ol></li>
	<li>データ解析<ol><li>画像読み込みと信号処理<ol><li>[フォルダの選択]と[画像の読み込み]を押して、画像を画像取得ソフトウェアにロードし、前述のセットアップとプロトコルに従って半自動的に大量のビデオデータ分析を行います15,16。</li>
			<li>正しいサンプリングパラメータ( ピクセルサイズ や フレームレートなど)を入力します。</li>
			<li>手動入力でイメージのしきい値を設定し、関心領域 (ROI) を選択します。</li>
			<li>3 x 3 ピクセルのガウス空間フィルター、Savitzky-Goaly フィルター、およびトップハット ベースライン補正を実装します。</li>
			<li>[画像の処理]を押してベースラインを削除し、APD80やCaTD50などの電気生理学的パラメータを計算します。</li>
		</ol></li>
		<li>電気生理学的パラメータ解析<ol><li>APD80を計算するために、ピークでのAPDの開始時間と80%再分極(APD80)での終点を設定します。同様に、CaTDの開始時間はピークとして定義され、終点は80%の緩和として定義されます。</li>
			<li>伝導速度(CV)の測定は、画素サイズと2つ以上の画素間の活動電位伝導時間に依存します。選択したすべてのピクセルから平均速度を計算します-これは選択した領域の平均伝導速度です。対応する等時性マップを同時に生成して、伝導方向を明確に表示します。 注:O'Sheaら15 はCV測定を詳細に報告しています。</li>
			<li>オルタナンおよび不整脈の解析では、カルシウムオルタナンは、交互に現れる連続した大小のピーク振幅として定義されます。ピーク振幅比を使用して、周波数依存のオルタナン(1-A2 / A1)の重症度を評価します。心室頻拍(VT)などの複雑な不整脈を分析するためにフェーズマップを適用します。ローターが移動するにつれて、特定の領域にはっきりと現れるローターを探します。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者の誰一人として、宣言すべき利益相反はありません。

私たちの経験から、マウスの心臓の二重色素光学マッピングを成功させるための鍵は、十分に準備された溶液と心臓、色素のローディング、最高のS/N比の達成、およびモーションアーチファクトの低減です。
溶液の調製 クレブス溶液は、心臓実験を成功させるために不可欠です。MgCl 2 と CaCl2 の原液 (1 mol/L) は、Mg 2+ と Ca2+ が CO32+ で沈殿しやすいため、吸水性を考慮して事前に調製し、他のすべての成分を純水に溶かした後にクレブス溶液に添加します。クレブス溶液を95%O2/5%CO2で少なくとも30分間バブリングし、酸素化を確保します。マウスの心臓は特にpHに敏感であるため、酸素化後の溶液のpHは約7.4である必要があります。溶液中に微小な粒子があっても、これらの粒子が毛細血管を塞ぎ、灌流効果に影響を与える可能性があるため、実験結果に影響を与える可...

遺伝性心疾患カテコールアミン作動性多形性心室頻拍 (CPVT) は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンの挑戦に続く多形性心室頻拍 (PVT) エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります 1,2,3,4 .1995年に臨床症候群として最初に報告された最近の証拠は、この状態での筋小胞体(SR)ストアCa2+放出に関与する7つの遺伝子の変異に関与しています:最も頻繁に報告されているCa 2+放出チャネル5,6、FKBP12.67、心臓カルセクエトリン8をコードするCASQ2、TRDNのリアノジン受容体2(RyR2)をコードするRYR2接合部SRタンパク質トリアジン9をコードし、CALM1 9、CALM2 10、およびCALM3をコードするカルモジュリン11,12をコードする。 これらの遺伝子型パターンは、不整脈事象をSR貯蔵Ca2+12の無秩序な病理学的放出に起因させる。
SRからの自発的なCa2+放出は、Ca2+スパークまたはCa2+波として検出され、Na+/Ca2+交換体(NCX)を活性化します。1つのCa2+を3つのNa+に交換すると、内向きの電流が発生し、拡張期の脱分極が加速し、膜電圧が活動電位(AP)の閾値まで上昇します。RyR2ノックインマウスでは、洞房リンパ節(SAN)におけるRyR2R4496Cの活性の増加により、拡張期のCa、LおよびSR Ca2+の枯渇のCa2+依存性の減少によるSANの自動性の予期せぬ低下が起こり、CPVT患者のSAN機能障害に寄与する細胞内病態生理学的変化が特定されました13,14。関連する心筋細胞細胞質Ca2+波の発生は、イソプロテレノール(ISO)を含むカテコールアミンによるRyR感作後のバックグラウンド細胞質[Ca2+]の増加に続いてより可能性が高くなります。
無傷の心臓CPVTモデルで観察された心室性不整脈の原因である可能性のある活動電位(AP)活性化に応答したRyR2を介したCa2+放出後のCa2+シグナル伝達の詳細な動態変化は、報告されたRyR2遺伝子型の全範囲について決定されるべきです12。この論文では、マウス野生型(WT)およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCa2+シグナルと膜貫通電位(Vm)のハイスループットマッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前後のプログラムされた電気的ペーシングと組み合わせて紹介します。このプロトコルは隔離されたマウス中心のCPVTの病気のメカニズムの調査に方法を提供する。

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m シリンジフィルター</td><td>上海医療機器工場 上海医療器械有限公司、上海、</td>中国 <td>N/A</td><td>フィルター液</td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離管</td><td>広州ジェットバイオろ過有限公司 中国</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL パスツールピペット</td><td>北京ラボジックテクノロジー株式会社 中国</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &MU;L PCRチューブ</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. 上海中国</td><td>F611541-0010</td><td>Aliquote ストックソリューション&nbsp; 50 mL遠心分離管の凍結と解凍の繰り返しを避けるために</td></tr><tr><td></td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. 中国</td><td>CFT011500</td><td>Tyrode's solution at 4 >フォローアップ心臓隔離のためのC</td></tr><tr><td>585/40 nmフィルター</td><td>クロマテクノロジー</td><td>N/A</td><td>カルシウム信号用フィルター</td></tr><tr><td>630 nmロングパスフィルター</td><td>クロマテクノロジー</td><td>G15604AJ</td><td>電圧信号用フィルター</td></tr><tr><td>アバーチン(2,2,2-トリブロモエタノール)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td><td>T48402-100G</td><td>苦痛と痛みを最小限に抑えるために 反射</td></tr>ブレ<tr><td>ビスタチン</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td><td>SLBV5564</td><td>CaCl</td></tr><tr><td>2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td></td><td>SLBK1794V For Tyrode's solution</td></tr><tr><td>カスタムメイドのサーモスタットバス</td><td>MappingLab, United Kingdom</td><td>TBC-2.1</td><td>灌流溶液</td></tr><tr><td>の温度を保つためジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)</td><td>染料用溶剤</td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>医療機器工場 上海医療機器有限公司、上海、中国</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMapソフトウェア</td><td>バーミンガム大学</td><td>N/A</td><td>電気パラメータの定量化</td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States</td><td>A18G150001</td><td>光信号の画像を取得する</td></tr><tr><td>ET525/36 スパッタコーティングフィルター</td><td>クロマテクノロジー</td><td>319106</td><td>励起フィルター</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBT4811V</td><td>Tyrode's solution</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td>成都海通製薬有限公司, 成都, 中国</td><td>(H51021209)</td><td>冠状動脈の血栓を防ぐため</td></tr><tr><td>&nbsp;上海医療機器有限公司のアイリス鉗子</td><td>医療機器工場、上海、中国</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress、カールスバッド、カリフォルニア州、米国</td><td>HY-B0468/CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国</td><td></td><td>SLBS5003 Tyrodeのソリューションのために</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research、Faversham、英国</td><td>7355/7356</td><td>蛍光プローブの励起光</td></tr><tr><td>MacroLED光源</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>7352</td><td>LED</td></tr><tr><td>Mayo はさみ</td>を制御する <td>Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China の医療機器工場</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>光信号サンプリング</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>BCBS6841V</td><td>For Tyrode's solution</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td><td>M5337</td><td>電気刺激装置とSpike2ソフトウェアを接続する</td></tr><tr><td>MyoPacer EP フィールド刺激装置</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, United States</td><td>S006152</td><td>電気刺激装置</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBS2340V</td><td>Tyrodeのソリューション</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>BCBW9042</td><td>For Tyrode's solution</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBX3605</td><td>For Tyrode's solution</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>For ECG amplifier</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, United Kingdom</td><td>N/A</td><td>カルシウムオルタナン不整脈分析</td></tr><tr><td>眼科用ハサミ</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>6970</td><td>Ca2+ と Vm&nbsp; 同時に</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,</td><td>BT100-2J</td><td>溶液をポンピングするために</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td><td>1899021</td><td>To enhance the loading with Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td><td>1971387</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, United States</td><td>1890519</td><td>カルシウム インジケーター</td></tr><tr><td>シリカ ゲル チューブ</td><td>ロンガー プレシジョン ポンプ Co., Ltd., Baoding, China,96402-16</td><td></td> <td>蠕動ポンプと接続</td></tr><tr><td>シルク縫合</td>糸 <td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,揚州, 中国</td><td>20172650032</td><td>大動脈を固定するには</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom</td><td>N/A</td><td>心電図データを記録および分析するには</td></tr><tr><td>刺激電極</td><td>MappingLab, United Kingdom</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>光源用</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>光源用</td></tr></tbody></table>

カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の ryr2r2474s ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

不整脈誘発性心疾患であるカテコールアミン作動性多形性心室頻拍(CPVT)は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンチャレンジ後の多形性心室頻拍エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります。マウスの心臓は、CPVTを含む遺伝性不整脈疾患のモデル化に広く用いられている種です。ランゲンドルフ灌流マウス心臓の膜貫通電位(Vm)とカルシウム過渡現象(CaT)の同時光学マッピングは、不整脈発生のメカニズムを解明する可能性を秘めています。細胞レベルの調査と比較して、光学マッピング技術は、活性化、伝導速度、活動電位持続時間、CaT持続時間の決定など、いくつかの電気生理学的パラメータをテストできます。この論文では、マウス野生型およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCaTおよびVmのハイスループット光学マッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前および最中にプログラムされた電気ペーシングと組み合わせて紹介します。このアプローチは、ex vivoマウスの心臓調製物におけるCPVT疾患を機構的に研究するための実行可能で信頼性の高い方法を実証しました。

光学マッピングは、過去10年間、複雑な不整脈を研究する上で一般的なアプローチでした。光学マッピングのセットアップはEMCCDカメラで構成されており、各ピクセルで最大1,000Hzのサンプリングレートと74 x 74 μmの空間分解能を提供します。これにより、信号サンプリング時にかなり高い信号対雑音比が可能になります(図1)。ランゲンドルフ灌流された心臓が安定した状態に達し、色素のローディングが終了すると、心臓は2つの530 nm LEDの照明下でホモエザミックチャンバーに入れられ、電圧指示器RH237とCa2+指示薬Rhod-2 AMの励起に使用されます。発光光は600nm(Ca2+の場合)と670nm(Vmの場合)の2つの波長に分割され、EMCCDカメラで同時に検出されます。アベルチンとヘパリンを15分間灌流した後、手術器具(図2A)を使用して胸部を開き、心臓をすばやく抽出してから、冷たいクレブス溶液(4°C、95%O 2、5%CO2)に移します(<strong cl...

このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能の膜貫通電圧および細胞内Ca2+ トランジェントの電気生理学的測定を含む、カテコールアミン作動性多形心室頻拍の影響を受けた野生型およびノックイン動物から得られるマウス心臓の二重染料光学マッピングを導入します。

カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

この方法は、カテコールアミン作動性多形性心室頻拍などの疾患に関連する心室停止塗抹標本の電気生理学的特性とメカニズムを明らかにするのに役立ちます。この技術を用いることで、様々なプログラムされた電気ペーシングプロトコルで膜電位と細胞間カルシウムシグナルを同時に得ることができ、CPVTなどの不整脈疾患の根底にあるメカニズムや動態を探るのに特に適しています。この実験を成功させるには、心臓の灌流が良好であること、適切な色素のローディング、励起収縮のアンカップリング、および慎重なカメラ設定が必要です。まず、光学マッピングシステムをセットアップし、カメラの電源を入れて、摂氏マイナス50度の安定したサンプリング温度を実現します。採取したマウスの心臓を冷たいCREB溶液に入れて、代謝を遅らせ、心臓を保護します。大動脈の周囲の組織を取り除きます。カスタムメイドのカニューレ針を使用してカニューレを挿入し、4-0シルク縫合糸で固定します。次に、毎分3.5〜4.0ミリリットルの一定速度でランゲンドルフシステムを使用して心臓を灌流します。小さなプラスチックチューブを左心室に挿入してチャンバー内の溶液のうっ血を解放し、過負荷を回避し、プラスチックチューブをカニューレ挿入針に固定します。次に、2本のリード線をバスの灌流液に入れ、心電図増幅器ボックスと電気刺激コントローラーの電源をオンにします。次に、参照される心電図またはECGソフトウェアを起動し、ECGを継続的に監視します。心臓が安定した状態に達したら、暗闇の中で次のステップを実行します。ブレビスタチンCREBs溶液混合物を心臓に10分間絶えず灌流して、収縮と興奮を切り離し、撮影中の収縮アーチファクトを回避します。次に、赤い懐中電灯を使用して心臓を調べ、収縮が完全に停止することを確認します。励起収縮を切り離した後、ランゲンドルフ灌流システムでRhod-2 AM作業溶液で心臓を15分間灌流します。細胞内カルシウム色素のローディング中に酸素供給を維持します。プルロニックF-127による気泡形成を防ぐために、気泡トラップを灌流システムに挿入します。10マイクロリットルのRH 237ストック溶液を50ミリリットルの灌流液に希釈し、10分間ロードします。デュアル染料のローディングが完了したら、一連の写真をキャプチャします。電圧信号とカルシウム信号が解析に適していることを確認してください。励起光用の2つのLEDを点灯させ、その強度を適切な範囲に調整します。心臓を検出装置の下に置き、光点の直径を2センチメートルに調整する2つのLEDによって心臓が十分に照らされていることを確認します。レンズと心臓の間の作動距離を10センチメートルに設定して、目的のサンプリングレートと空間分解能を実現します。信号サンプリングソフトウェアを開き、カメラの制御と電圧信号とカルシウム信号のキャプチャを同時に行います。MyoPacer Field Stimulator を起動し、ペーシングパターンをトランジスタトランジスタロジックに設定し、パルスごとに 2 ミリ秒のペーシング期間を設定します。初期強度を 0.3 ボルトに設定します。左心室の心外膜に取り付けられた一対の白金電極を配置します。10ヘルツのS1刺激を30回連続して適用し、ECG記録ソフトウェアを使用して心臓の拡張期電圧しきい値をテストします。1対1のキャプチャが得られるまで、電圧振幅を徐々に増やします。S1-S1プロトコルを実装して、カルシウムまたは活動電位の代替物と反発特性を測定します。100ミリ秒の基本サイクル長から順番に心臓のペースを刻みます。サイクル長が 50 ミリ秒に達するまで、後続の各シーケンスで 10 ミリ秒ずつ減らします。刺激の前に同時に光学マッピングを開始します。S1-S2刺激プロトコルを使用して心室有効耐火期間を測定するには、S1-S1ペーシングサイクル長を100ミリ秒から開始します。S2を60ミリ秒で結合し、S2が異所性QRS複合体を捕捉できなくなるまで、2ミリ秒刻みで減少させます。不整脈誘発の場合は、50ヘルツバーストペーシングを永続的に投与し、2秒間の休息間隔を待った後、同じペーシングエピソードを実行します。連続的な高周波ペーシング期間中の心電図記録を注意深く監視し、興味深い不整脈波が発生したときに同時に光マッピング記録を速やかに開始します。電子増倍電荷結合素子カメラを使用して画像を撮影します。画像取得ソフトウェアで、フォルダ選択を押し、画像を読み込むと、半自動の大量ビデオデータ解析プロセスが開始されます。解析の正しいサンプリングパラメータを入力します。画像のしきい値を手動で設定し、関心領域を選択します。3 x 3 ピクセルのガウス空間フィルター、Savitzky-Golay フィルター、シルクハットベースライン補正を適用します。次に、[画像の処理]を押してベースラインを削除し、APD-80やCATD-50などの電気生理学的パラメータを計算します。APD-80を計算するために、ピークでの活動電位時間の開始時間と80%の再分極での終点を設定します。同様に、カルシウム過渡期間の開始時間をピークとして定義し、終点を 80% 緩和します。APD-80 と CATD-80 のヒートマップの典型的なトレースを示します。イソプロテレノールは、APD-80および野生型およびカテコールアミン作動性多形性心室頻拍またはCPVTマウスを短縮しますが、イソプロテレノールチャレンジ後に差は見られませんでした。CATD-80およびCPVTマウスは、イソプロテレノールチャレンジ後、野生型よりも期間が長かったが、治療前は有意性がなかった。電圧信号によると、野生型とCPVTの心臓は、ベースライン時とイソプロテレノール介入後に心外膜を横切る同じ伝導能力を持っていました。ヒートマップは、CPVTマウスがイソプロテレノールチャレンジの前後で野生型マウスと同じ伝導能を持つことを示しました。カルシウム振幅代替分析では、野生型心臓のカルシウムシグナルは、14.29ヘルツと16.67ヘルツで連続したS1-S1ペーシング中にベースラインで安定していたが、CPVT心臓は周波数依存的な代替を示した。イソプロテレノールチャレンジ後、CPVT心臓はS1-S1ペーシング中に周波数依存性交互およびカルシウムシグナルを示したが、野生型心臓は影響を受けなかった。頻変性不整脈解析では、野生型とCPVTの両方の心臓が、ベースラインでの50ヘルツバーストペーシング中に正常な伝導を示すことが示唆されました。イソプロテレノールを多量に投与した後、CPVT心臓は50ヘルツバーストペーシング後に高周波ローターを示しましたが、野生型心臓は正常な伝導を維持しました。この手順に続いて、アドゲン型および野生型マウスを用いて、これらのモデルまたは医薬品の発明における電気生理学的および機能的特性を例示する。光学マッピングは、不整脈を研究するための強力なツールですが、励起収縮の結合解除下での蛍光色素の制限により、臨床的に使用することはできません。高回転計算技術の開発による異なる標的分子に適した蛍光の開発により、心臓光学マッピング技術はアプリケーションのみを達成するためにバインドされています。

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、電位差色素（ジ- 8 -...

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

このレポートは、ストレッチ誘発性心房細動時のランゲンドルフ灌流羊の心臓の無傷の左心房の電気的興奮を同時に心内膜と心外膜の光学的マッピングの方法論と結果の詳細な説明を提供します。...

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ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

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イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

ここでは、高い空間分解能と時間分解能で、マウス右心房、特に洞房結節から電気活動の光学マッピングするためのプロトコルを提示します。...

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このプロトコルを記述する高時空分解能、膜電位のデュアル録音を含む光学マッピング システムを利用したマウスの心房の電気生理学的評価と Ca2...

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

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マウス心臓における光遺伝学的マルチサイト光刺激の適用による高度な心調律管理

学ぶ二重色素光学マッピングを用いたCPVTモデルマウスの心臓電気生理学的特性評価法。膜電位と細胞内カルシウムを同時計測し、不整脈メカニズムの解明に貢献する革新的アプローチです。

カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2^R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

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