モノクローナル抗体の安全性予測のためのサイトカイン放出アッセイの頑健性を確認するための参照試薬の使用

新薬の安全性試験は重要であり、このプロトコルでは、検証済みの標準を使用してCRSプラットフォームの再現性、堅牢性、および潜在的な制限を評価する方法を説明しています。この技術は、11の異なるラボでこれらの試薬を用いて検証されており、国際共同研究では同様の反応パターンが観察されており、調和と再現性の向上が図られています。この技術の応用は、新規治療用抗体のCRSリスク試験の改善に向けて拡大し、潜在的な副作用の臨床管理の準備にも役立ちます。

この作業は、再現性と調和を向上させるためのものであり、視覚的なデモンストレーションにより再現性の可能性が高まります。まず、参照試薬アンプルの内容物を1ミリリットルの滅菌蒸留水に再構成し、5〜10分間の水分補給を行います。次に、各抗体溶液を適切に混合してから、滅菌キャップ付きチューブに移します。

次に、再構成した抗体と試験抗体をそれぞれ1ミリリットルあたり10μgに滅菌PBSで希釈します。無菌でTC処理されていないU底ポリプロピレン96ウェルマイクロタイタープレートを用意し、プレートの指定ウェルに100マイクロリットルの希釈抗体溶液を加えます。次に、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートしてから、固相アッセイを実施します。

ヘパリン処理チューブに最低30ミリリットルの末梢全血を採取した後、血液サンプルとヘパリンナトリウムが適切に混合されるように、数回反転させます。15ミリリットルの全血サンプルを別のチューブに入れておき、後で水相の全血アッセイで使用します。残りの15ミリリットルの全血を、PBSまたは無血清のRPMI 1640培地を等量添加して希釈します。

希釈した血液を、50ミリリットルのチューブ内の15ミリリットルの密度勾配培地の上に穏やかに重ねます。ブレーキのないスイングアウトローターを使用し、500G、室温で20分間加速を抑えてチューブを遠心分離し、血液をさまざまな成分に分離します。遠心分離後、密度勾配は血漿の最上層として分離し、続いてPBMCを含むバフィーコートの薄層、RBCおよび好中球や好酸球などの多形核顆粒球を含む最下層として分離します。

上部のプラズマ層を慎重に取り除き、続いて次の層を取り除き、PBMCを採取します。洗浄するには、収穫したバフィーコートを10ミリリットルのPBSまたは無血清のRPMI 1640培地に再懸濁します。チューブを500 Gから10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。

上清を捨てて、再度洗濯を繰り返します。次に、得られたペレットを2ミリリットルの完全RPMI培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、完全なRPMIでPBMC濃度を1ミリリットルあたり100万細胞に調整します。

水相全血サイトカイン放出アッセイでは、前に置いておいた全血サンプルを取り出し、190マイクロリットルのサンプルを96ウェルU底ポリスチレンプレートのウェルに加え、熱処理抗体およびPBSで100マイクログラム/ミリリットルに予め希釈した参照試薬を加え、190マイクロリットルの全血を含む指定ウェルに所望の希釈抗体10マイクロリットルを加えます。プレートを37°Cの加湿インキュベーターで48時間インキュベートします。固相PBMCサイトカイン放出アッセイでは、事前に調製したコーティングプレートを入手してください。

マルチチャンネルピペットを使用して、コーティングされたプレートから抗体溶液を廃棄します。試薬リザーバーにPBSを充填した後、プレートを200マイクロリットルのPBSで3回洗浄し、結合していないモノクローナル抗体を除去します。事前に調製したPBMC懸濁液を200マイクロリットル各ウェルに加えます。

プレートを加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で48時間インキュベートします。コントロールおよび試験モノクローナル抗体と48時間インキュベートした後、プレートを400 Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに細胞馴染培地または血漿を回収します。

採取した上清または血漿をマイナス20°Cで凍結します。PBMC固相アッセイの結果は、ポジティブコントロール抗体が、一致したアイソタイプコントロールと比較して有意に高いレベルのサイトカインを誘導することを示しました。また、抗CD28スーパーアゴニストは、その適合したアイソタイプよりもインターロイキン-2またはIL-2放出の有意に高い倍数の変化を誘導したのに対し、抗CD3および抗CD52は、IL-2発現を誘導しながらも、より低い倍率の変化をもたらすことが観察されました。

全血水相アッセイでは、検出可能なサイトカインのレベルは固相アッセイよりも比較的少なかったが、抗CD52による刺激に対する感受性が高いことが特徴であった。