ニワトリ胚の脳内移植による腎オルガノイドの効率的な血管新生

in vitroで培養された腎臓オルガノイドは未成熟なままであり、その適用性は限られています。そして、この体腔内移植の方法は血管新生を誘発し、オルガノイドの成熟を促進します。この手順は非常に効率的で、1回の実験で多数のオルガノイドの移植と分析が可能です。

HIPSC由来の腎臓オルガノイドを調製し、受精したレグホーン卵を孵化させた後、孵卵3日目に卵殻に窓を作ります。卵の先のとがった先端に透明なテープの小片を置きます。透明なテープの真ん中にある卵殻に、解剖ハサミの鋭い端で軽くたたくことで小さな穴を開けます。

次に、5ミリリットルの注射器に19ゲージの針を45度の角度で穴に挿入します。卵から2〜3ミリリットルのアルブミンを吸引して、卵の中の胚を下げます。2枚目の透明テープで穴を隠し、卵の上向きの側にマークされた鉛筆に大きな透明テープを置きます。

透明なテープの真ん中にある卵殻に、解剖ハサミの鋭い端で軽くたたくことで穴を開けます。湾曲した解剖ハサミを使用して、この穴から卵殻の小さな円形の窓を切り取ります。このウィンドウを通して胚を見つけます。

次に、ウィンドウを拡大して、胚へのアクセスを最適化します。鉗子を使用して、胚の上に落ちた可能性のある大きな卵殻を取り除きます。プラスチック製のトランスファーピペットで胚にカルシウムとマグネシウムを含むDPBSを数滴入れ、卵殻でDPBSをピペットに吸引して、小片を取り除きます。

プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、0.5%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDPBSを3滴卵に加えます。孵卵の4日目まで卵をインキュベーターに戻す前に、大きな透明なテープで窓を慎重に密封します。湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。

卵を解剖顕微鏡下のゴムホルダーまたは卵パックの上に置きます。ニワトリの胚は現在、ハンバーガーハミルトンステージ23から24にあり、右側が視聴者に面して左側に横たわっています。胚の右翼と脚のつぼみを見つけ、体腔がこれらの2つの四肢のつぼみの間で評価されるようにします。

右翼と脚のつぼみの間の領域に、2対の解剖鉗子で保持し、反対方向にそっと引っ張って、卵子膜、絨毛膜、羊膜に連続して開口部を作ります。体腔への障害物のないアクセスがあるかどうかを確認します。翼と四肢のつぼみの間の体壁の端を解剖鉗子でそっとつかみ、視聴者に向かって少し引っ張ります。

体腔腔ははっきりと見えなければなりません。鈍いが細い器具を体腔腔に慎重に挿入します。硬膜ディセクタを使用して、尿膜の上の卵の中に半分のオルガノイドを置きます。

解剖鉗子を使用して、体壁の端を注意深くつかみ、それを視聴者に向かってわずかに引っ張って、腔腸への開口部が見えるようにします。オルガノイドを体壁の開口部に向かってゆっくりと動かし、鈍いタングステンワイヤーとマイクロメスホルダーを使用してコエルムに入れます。オルガノイドを少し頭蓋骨に押して、体腔内に留まります。

翼のつぼみのすぐ後ろに見えるようになりました。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して卵に3滴のDPBSを加えます。卵を孵卵の12日目までインキュベーターに戻す前に、大きな透明テープで窓を慎重に密封します。

湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。卵を解剖顕微鏡下のゴム製ホルダーに入れます。血管系を評価し、わずかに明るい赤色で動脈と区別できる静脈を見つけます。

血管系へのアクセスを改善するために、湾曲した解剖ハサミでそれを切って慎重に窓を拡大します。静脈を選択したら、マイクロキャピラリー針の先端を0〜20度の角度で静脈に挿入します。先端をゆっくりと左右に動かして、針が静脈にあることを確認します。

注入システムに穏やかかつ着実に吹き込み、水晶体凝集素を注入します。そして、卵をインキュベーターに10分間戻し、循環させます。卵をベンチのゴム製ホルダーに入れます。

次に、湾曲した解剖ハサミで胚を囲む膜を切り取ります。穴あきスプーンで卵から胚をすくい上げ、すぐにハサミを使って胚を斬首します。解剖顕微鏡下で、胚の体をペトリ皿に入れる。

胚をペトリ皿に仰向けに置き、手足を広げます。鉗子を使用して縦軸に沿って胚の腹壁を慎重に開きます。胚の中のオルガノイドを見つけます。

オルガノイドは、ほとんどの場合、胸郭のすぐ下の頭蓋骨の先端または頭蓋のいずれかで、右肝葉に付着します。したがって、これらの場所を確認することから始めることをお勧めします。オルガノイドが見つかったら、マイクロハサミで胚の周りを切り取って胚から取り除きます。

オルガノイドを、解剖顕微鏡下のペトリ皿に必然的に付着しているニワトリ組織に入れます。両刃のステンレス鋼のかみそりの刃でできるだけ多くの鶏組織を取り除きます。非移植腎オルガノイドと移植腎オルガノイドの免疫蛍光画像は、どちらも糸球体構造と尿細管構造を含んでいます。

未移植オルガノイドには、いくつかのヒトリンパ管内皮細胞が存在する。移植されたオルガノイドでは、灌流された血管網がオルガノイド全体に見られます。四角で囲んだ部分の拡大画像は、移植オルガノイドで区別できる3種類の内皮細胞、灌流されたヒトリンパ管内皮細胞、および灌流されたニワトリ由来内皮細胞を示しています。

移植されていないオルガノイドでは、内皮細胞は糸球体構造を取り囲んでいますが、それらに浸潤していません。しかしながら、移植されたオルガノイドでは、糸球体構造は灌流された毛細血管によって血管新生される。移植されたオルガノイドは、実験の目的に応じて異なる手法を用いて解析することができる。

移植されていない対照との直接比較は、血管新生と成熟のプロセスへの洞察を提供することができます。