Name: 遺伝子改変T細胞の作製のためのGMP準拠手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶGMP準拠のヒト初代T細胞遺伝子導入法。白血球除去採血からのPBMC単離、密度勾配遠心、ウイルスベクター導入を含む。CAR T細胞療法などの遺伝子改変細胞治療開発に応用可能な低コスト手法です。

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この研究は、RESEARCH - CREATE - INNOVATE(プロジェクトコード:T2EDK-00474)の呼びかけの下、Operational Program Competitiveness, Entrepreneurship, and Innovationを通じて、欧州連合とギリシャの国家基金から共同出資されています。また、細胞治療研究所のGMPラボ「Dimitris Lois」に継続的にご支援を賜り、誠にありがとうございます。

この研究は、パトラス大学の倫理委員会とパトラス大学総合病院の治験審査委員会によって承認されました。生物学的標本を取得する前に、健康な個人からインフォームドコンセントが得られました。参加者の適格性評価は、施設の手順に従って、白血球アフェレーシスのJACIE基準に準拠して実施されました。このプロトコルを臨床ACT設定で実施する場合、すべての手順は適正製造基準(GMP)ガイドラインに準拠し、GMP準拠のクリーンルームで実施する必要があります。ウイルスベクターを扱う際には特別な安全対策が必要であり、これらの手順は専用のバイオセーフティキャビネット内で実施する必要があります。この研究では、説明されている手順は、制御および監視された環境を確保するために、検証済みのH35 HEPA催眠( 材料表を参照)内で実施されました。すべての危険な液体の除染は、10%漂白剤溶液を使用して行う必要があります。
1. PBMC単離とT細胞活性化(0日目)
<ol><li>ドナーアフェレーシスバッグ(ロイコパック、 材料表を参照)から細胞を初期容量に応じて50 mLチューブに集めます。</li>
	<li>15 mLの完全な造血培地(+5% HSA、市販の無血清造血培地、 材料表を参照)を注入して、セルバッグを2回洗浄します。</li>
	<li>多糖類ベースの密度勾配遠心分離を1:2(試薬:サンプル)の希釈で実施します。800 x g で室温で30分間遠心分離し、ブレークオフします(A/D、9/0)。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して、PBMCを清潔な50 mLチューブに回収します。</li>
	<li>細胞を1x PBSで2回洗浄し、洗浄ごとに最大50 mLを充填します(400 x g、10分、室温)。細胞を5 mLの完全培地に再懸濁します。</li>
	<li>標準的な血球計算盤または自動セルカウンターのいずれかを使用して、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします( 材料表を参照)。</li>
	<li>細胞を完全培地で希釈し、濃度が 2 x 106 cells/mL になるようにします。</li>
	<li>2 x 10 6開始細胞あたり10 μLのT細胞刺激試薬(材料表を参照)を添加して、20 x 106 PBMCを活性化します。 注:このプロトコルは、20 x 106 PBMC の活性化用に設計されていますが、必要に応じてより大きなセル数に調整できます。</li>
	<li>rhIL-2(20 U/mL)( 材料表を参照)を添加し、穏やかに混合し、適切な容器(6ウェルプレートなど)に移します。</li>
	<li>細胞を37°C、5%CO2 で72時間インキュベートします。</li>
</ol>2.レンチウイルスT細胞形質導入(3日目)
<ol><li>細胞培養液を50 mLのコニカルチューブなどの適切な容器に移します。よく混合し、室温(RT)で300 x g で10分間遠心分離し、活性化試薬を除去します。上清を完全に慎重に廃棄し、ペレットを1 mLの完全な培地に再懸濁します。 注:この段階では、氷の上でウイルスを解凍することが可能です。</li>
	<li>トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。</li>
	<li>細胞を完全培地に再懸濁し、24ウェルプレートにウェルあたり総容量400 μLの0.5 x 106 細胞を播種できる濃度にします。rhIL-7(155 U/mL)およびrhIL-15(290 U/mL)を添加します( 材料表を参照)。 注: 追加するウイルスの量を考慮してください。ステップ2.4を参照してください。</li>
	<li>別のチューブで、ベクトフシン-1( 材料表を参照)をOpti-MEM培地に10 μg/mLの濃度で添加し、使用するウイルス量と同量の量にします。 注:ベクトフシン-1の濃度を計算する際には、細胞培養の総量を考慮してください。ステップ 2.3 を参照してください。あるいは、ベクトフシン-1 GMPをGMPグレードの試薬として使用することもできます。</li>
	<li>感染多重度(MOI)40の濃縮ウイルスとベクトフシン-1/Opti-MEM混合物(1:1の比率)を混合し、完全に混合します。この混合物を細胞培養物に加え、必要に応じて、完全培地を使用してウェルあたり総容量を400μLに調整します。</li>
	<li>プレートに蓋をしてパラフィンフィルムで密封し、1000 x g で32°Cで2時間遠心分離します。 続いて、プレートを37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。</li>
</ol>3.ウイルス除去とT細胞増殖(4日目)
<ol><li>細胞を回収し、50 mLチューブなどの適切な容器にプールします。</li>
	<li>細胞を室温(RT)で400 x g で5分間遠心分離します。上清を慎重に完全に除去し、ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁します。</li>
	<li>トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。細胞を完全培地に1 x 106 細胞/mLの濃度で再懸濁します。rhIL-7(155 U/mL)およびrhIL-15(290 U/mL)を添加します( 材料表を参照)。</li>
	<li>細胞を0.3-0.5 x 106 細胞/cm2 の濃度でT25フラスコなどの適切な容器に移し、37°C、5%CO2で2日間インキュベートします。 注:より大きな細胞集団が必要な場合は、rhIL7およびrhIL-15の存在下で、上記と同じインキュベーション条件に従って、目的の細胞数が得られるまで、2日ごとに細胞を継代培養(1:2)することができます。</li>
</ol>4.凍結保存(14日目)
注:このステップでは、クライオバイアルを保管場所に移すには氷が必要です。凍結保存のタイミングは、目的の細胞数によって異なります。このプロトコルでは、凍結保存は 25 倍の拡大を達成した後、14 日目に実施されます。
<ol><li>目的の細胞数に達したら、細胞を回収し、50 mLチューブに移します(総容量に基づいてチューブの数を調整します)。</li>
	<li>チューブを室温(RT)で400 x g で5分間遠心分離します。上清を慎重に完全に除去し、ペレットを10 mLの培地に再懸濁します。必要に応じて、複数のチューブから細胞をプールします。</li>
	<li>トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。ベクターコピー数と形質導入効率を評価するために、各品質管理(QC)テスト(セクション5を参照)ごとに1 x 106 細胞のアリコートを保持します。</li>
	<li>チューブを 400 x g で 10 分間遠心分離します。この時点で、それに応じてクライオバイアルにラベルを付けます。</li>
	<li>上清を完全に除去し、50%HSAおよび40%HBSSからなる凍結保存液に、クライオバイアルあたり1 mLあたり1 x 107 細胞の濃度でペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を適切な数のクライオバイアルに移し、各クライオバイアルに10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加します。</li>
	<li>クライオバイアルを氷上に置き、速やかに制御された速度の冷凍庫に移して凍結保存します。凍結保存後、クライオバイアルを監視対象の液体窒素タンクに移し、長期保存します。</li>
</ol>5.品質管理(14日目)
注:リリーステストでは、微生物の増殖に関する無菌試験やエンドトキシンレベルの評価など、いくつかのテストを受けました。これらの検査は、パトラス大学総合病院とパトラス大学の認定検査室で実施されました。マイコプラズマの存在は、生化学的検出アッセイを用いて社内で測定し、メーカーの指示に従ってルミノメーターで測定しました(材料表を参照)。細胞表現型(図1)、細胞数および生存率は、それぞれフローサイトメトリー(セクション5.1を参照)および自動セルカウンター(材料表を参照)によって社内で評価しました。GMPで製造された細胞製品について、公表されたデータおよび推奨事項10,11に基づいてリリース基準が確立されました(表1)。
<ol><li>形質導入効率-フローサイトメトリー染色の実施(14日目) 注:1 x 106 細胞のアリコートを生存率(7-AAD)およびCD3マーカー2 について染色して、形質導入効率を評価します( 材料表を参照)。CAR-T細胞の場合など、目的の遺伝子を検出する必要がある場合は、代償を避けるために、特異的抗体をCD3マーカーおよび7-AADとは異なる色にする必要があります。適切な対照サンプルを考慮する必要があります。<ol><li>サンプルをFACSチューブに入れ、500μLのFACSバッファーを加えます。</li>
		<li>チューブを室温で400 x g で5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清をピペットで完全に廃棄し、ペレットをCD3:FACSバッファーの1:5希釈溶液に再懸濁します( 材料表を参照)。</li>
		<li>サンプルをボルテックスし、暗所の氷上で30分間インキュベートします。</li>
		<li>500 μLのFACSバッファーを添加します。400 x g で5分間遠心分離します(往復)。</li>
		<li>上清を完全に廃棄し、7-AAD:FACS緩衝液の1:20希釈溶液にペレットを再懸濁します( 材料表を参照)。</li>
		<li>サンプルをボルテックスし、暗所の氷上で10分間インキュベートします。</li>
		<li>200 μLのFACSバッファーを添加し、フローサイトメーターを使用してサンプルを分析します( 材料表を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
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<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+remissions+following+chimeric+antigen+receptor+modified+T+cells+directed+against+CD19+%28CTL019%29+in+patients+with+relapsed+or+refractory+CD19%2B+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas.</a> Blood. 126 (23), 183(2015).</li>
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</ol>

N.S.はプロトコルを開発し、A.S.によって査読され、監督された原稿を書きました。K.S.、G.A.は追加の実験を行いました。D.K., M.L. は、実験と V.Z., N.T. と共に、レビュープロセスにおいて貴重なサポートを提供してくれました。N.T.はProtATonce Ltd.のメンバーです。他のすべての著者は、競合する利害関係がないことを宣言します。

遺伝子送達担体としてのレンチウイルスベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入する能力があるため、細胞および遺伝子治療の分野で重要なツールです12。しかし、GMP適合法を用いたレンチウイルスベクターの大量生産は、トランスフェクション法や精製ステップなどのさまざまなパラメータにより、レンチウイルスバッチにばらつきが生じる可能性があるため、依然として困難です。アカデミックセンターは、ウイルス生産バイオテクノロジー企業からウイルスストックを入手することが多く、リリース基準13,14を満たすためにウイルスの機能と安全性に関する文書を提供します。
形質導入プロトコルの成功は、ウイルスストックの品質だけでなく、標的細胞の適合性にも依存します。活性化ステップで失敗すると形質導入効率が低下する可能性があるため、PBMCの効率的な刺激は非常に重要です。さらに、プロモーターとエンベロープタンパク質の選択は、形質導入プロトコルの効率に...

養子細胞療法(ACT)とキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の出現は、現代の臨床診療に革命的な変化をもたらし、個別化医療の新しいパラダイムを確立しました。特に、CD19を標的とするCAR-T細胞は、優れた臨床反応を示しており、B細胞悪性腫瘍に対する最先端のT細胞療法を表しています1,2,3,4,5。しかし、現在市販されている遺伝子改変T細胞治療は、遺伝子導入をウイルスベクターに大きく依存しています。ACTにおけるウイルスベクターの実装は、特に学術環境における適正製造基準(GMP)条件下では、スケーラビリティの制限、特殊な機器要件、高度なスキルを持つ人材の必要性、およびプラスミドを介したウイルス粒子生産のためのGMP準拠の試薬の使用により、大きな課題を提示します6,7,8。
その結果、遺伝子改変T細胞治療の製造プロセスは複雑であり、通常、白血球アフェレーシス製品から末梢血単核細胞(PBMC)を分離することから始まります。T細胞はしばしばPBMCプールから濃縮され、抗CD3/CD28マイクロ複合体を用いて活性化される7,9。その後、T細胞はウイルスまたは非ウイルスベクターのいずれかで遺伝子改変され、その場で生産することも、外部委託することもできます。注入に必要な細胞数を達成するために、遺伝子改変細胞は、最終的な製剤化および/または凍結保存の前に増殖されます。最後に、細胞産物は、複数の品質管理アッセイに基づく様々な放出基準を満たさなければならない9。
このプロトコルはGMP迎合的な条件の下で遺伝子変更されたT細胞プロダクトを製造するのに健康なPBMCsの 生体外で の処理のための簡単な技術を利用する広範囲の方法論を示す。このプロトコルにはレンチウイルスベクターの使用が組み込まれており、必要なすべての定量的/機能的、純度、および安全性試験(ウイルス力価、宿主細胞DNA複製適格レンチウイルスの検出など)を提供するウイルス製造会社に委託できます。本研究では、VSV-g(水疱性口内炎ウイルスGタンパク質)ベースの第2世代レンチウイルスベクターに、目的遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)を構成的に発現させたベクターを採用しました。

<table><tbody><tr><td>24ウェルTC処理プレート</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>5 mL FACSチューブ&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Greiner biomedica</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6-well TC-treated plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS CANTO II</td><td>BD Biosciences</td><td>V96300084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter&nbsp;</td><td>コーニング セル Cytosmart</td><td>J21E0081</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>グライナー バイオメディカ</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコS Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10.6.2&nbsp;</td><td>TreeStar</td> <td>Inc-Gibco</td><td></td></tr> <tr><td>CTS Opti-MEM I Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4124801</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-15</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-114</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-146</td><td></td></tr><tr><td>GMP rhIL-7</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-111</td><td></td></tr><tr><td>Hanks's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>HEPA Whitley H35 Hypoxystation</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>HA0315172H</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin (HSA)</td><td>Baxter</td><td>B05AA01</td><td></td></tr><tr><td>Junior LB 9509 Portable Luminometer</td><td>Berthold Technologies</td><td>6506</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Provirus Quantitation Kit</td><td>Takara Bio</td><td>631239</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP T cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-156</td><td></td></tr><tr><td>マウス アンチヒューマン&nbsp;CD3 (クローン: UCHT-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>557706</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Plus 検出キット</td><td>Lonza Bioscience</td><td>LT07-703</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム超拡張型クロージングフィルムテープ 5 cm x 75 m</td><td>D.Dutscher</td><td>90261</td><td></td></tr><tr><td>PeriStem PS-650-DB (アフェレーシスバッグ)</td><td>Biomed Device</td><td>SC00816</td><td></td></tr><tr><td>Planer Kryo10 Series III</td><td>Planer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>Greiner biomedica</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Vectofusin-1 GMP</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-165</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVOTM 15 無血清造血細胞培地</td><td>Lonza Bioscience</td><td>A1048501</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子改変t細胞の作製のためのgmp準拠手順

A GMP-Compliant Procedure for the Generation of Gene-Modified T cells

養子細胞療法(ACT)の分野は、遺伝子組み換え細胞、特にキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の開発によって革命を起こしました。これらの改変細胞は、血液悪性腫瘍の患者において顕著な臨床反応を示しています。しかし、これらの治療法を製造し、広範な品質管理評価を実施するには高いコストがかかるため、より幅広い患者がアクセスできるように制限されています。この問題に対処するために、多くの学術機関は、国内外の規制当局によって設定されたガイドラインを遵守しながら、遺伝子組み換え細胞の内製化の実現可能性を模索しています。
遺伝子組み換えT細胞製品を大規模に製造するには、特に施設の生産能力と輸液量の要件を満たす必要性の点で、いくつかの課題があります。大きな課題の1つは、GMP(Good Manufacturing Practice)ガイドラインの下で大規模なウイルスベクターを製造することであり、外部企業に委託することがよくあります。さらに、T細胞形質導入プロセスを簡素化することで、生産バッチ間のばらつきを最小限に抑え、コストを削減し、人材育成を促進することができます。この研究では、蛍光マーカーを目的の遺伝子として用いた初代ヒトT細胞のレンチウイルス形質導入の合理化されたプロセスの概要を説明します。プロセス全体はGMP準拠の基準に準拠しており、当社の学術機関内で実施されています。

形質導入効率の評価 形質導入した細胞は、フローサイトメトリーを用いて目的遺伝子(GFP)の発現を評価しました。代表的な結果を 図1に示します。14日目には、細胞の95%以上がCD3+であり、T細胞の活性化と増殖が成功したことが示されました。CD3+集団内の形質導入効率は58.7%(TD、 図1C)で測定され、形質導入されていない細胞(UNTD、 図1B)では0.51%の形質導入効率を示しました。生存率解析では、7-AAD+細胞を除外した後、95%以上の細胞が生存していることが示されました(図1A)。データ解析にはFlowJoソフトウェア( 材料表参照)を使用しました。
膨張プロファイルの評価<...

このプロトコルは、適正製造基準(GMP)規格との互換性を確保し、関心のある遺伝子を持つ初代ヒトT細胞を形質導入するプロセスを概説します。

遺伝子改変T細胞の作製のためのGMP準拠手順

The field of Adoptive Cell Therapy (ACT) has been revolutionized by the development of genetically modified cells, specifically Chimeric Antigen Receptor ...

このプロトコルは興味の遺伝子の人間の第一次T細胞をtransducing簡単であり、GNPの迎合的なプロセスを記述する。この特定の技術は、現在多くの学術センターで利用可能な高価なクローズドシステム製造プラットフォームを使用することなく、費用対効果が高く、GNPに準拠するように設計されています。この方法は、血液悪性腫瘍に取り組むためのパラダイムシフトとなっているCAR-T細胞を含むがこれに限定されない遺伝子改変細胞療法の生成に適用できる可能性があります。ドナー血液の白血球アフェレーシス後に採取した細胞からPBMCを単離するには、試薬とサンプルの比率を1:2に維持しながら、ブレーキをオフにした状態で室温で30分間、混合物を800 Gで遠心分離することにより、サンプルの多糖類ベースの密度勾配遠心分離を行います。次に、マイクロピペットを使用して、PBMCを清潔な50ミリリットルのチューブに集めます。遠心分離により細胞をPBSで2回洗浄します。洗浄した細胞を完全な造血培地に再懸濁する前に。得られた細胞のうち約2,000万個を活性化するには、細胞200万個ごとに10マイクロリットルのT細胞刺激試薬を添加します。次に、組換えヒトインターロイキン-2を1ミリリットルあたり20単位で添加した後、溶液を穏やかに混合し、6ウェルプレートに移します。ウイルス形質導入を行う前に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。3日目に、細胞培養液を50ミリリットルのコニカルチューブに移し、完全に混合します。チューブを室温で300Gで10分間遠心分離し、活性化試薬を除去します。上清を完全に廃棄し、細胞を数える前にペレットを1ミリリットルの完全な培地に再懸濁します。24ウェルプレートでウェルあたり50万個の細胞をプレーティングできる濃度になるように、完全培地を使用して細胞懸濁液量を調整します。組換えヒトインターロイキン-7および組換えヒトインターロイキン-15を適切な濃度で細胞に添加します。別のチューブで、使用する最終的なウイルス量を考慮して、所望の量のベクトフシン-1をOpti-MEM培地に添加します。この混合物を濃縮ウイルスと1対1の比率で混合し、完全に混合します。次に、得られたウイルスを含む混合物を細胞に加えます。必要に応じて、完全培地を使用して各ウェルの総容量を400マイクロリットルに調整します。プレートに蓋をした後、パラフィンフィルムで密封し、1000g、32°Cで2時間遠心分離します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、各ウェルから細胞を集めて50ミリリットルのチューブに引き込みます。次に、細胞を400G、室温で5分間遠心分離します。上清を慎重に除去した後、細胞をカウントする前に、ペレットを1ミリリットルの完全な培地に完全に再

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。...

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

このビデオでは、CRISPR-Cas9システムを通じて遺伝子組み換えCAR-T細胞を作成するプロセスの概要を示しています。T細胞にCRISPRおよびCARレンチウイルスを感染させると、標的遺伝子が改変され、キメラ抗原受容体またはCARが合成され、最終的には遺伝子改変CART細胞が形成されます。...

CRISPR-Cas9システムを用いたCAR-T細胞の遺伝子改変

このビデオでは、CRISPR-Cas9技術を用いてヒトT細胞の遺伝子編集を行うアッセイを実演しています。初代CD4+およびCD8+...

T細胞の遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9技術

CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞は、私たちのファースト·イン·ヒトの遺伝子治療の臨床試験におけるB細胞悪性腫瘍の治験治療として注入される。我々は、使用して、T細胞の遺伝子改変を記述...

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

化学療法と放射線標準治療のリンパ球除去および免疫調節効果は、T細胞免疫療法の抗腫瘍効果を高めるために活用することができます。EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製し、膠芽腫の標準治療の文脈でそれらを投与する方法を概説します。...

ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのCAR T細胞の生成

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。...

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

ここでは、CRISPR/Cas9システムを介してCAR-T細胞を遺伝的に編集するプロトコルを提示する。...

CRISPR/Cas9を使用してCAR-TセルのGM-CSFをノックアウト

本稿では、臨床用のキメラ抗原受容体T細胞の製造プロセス、特にT細胞のウイルス形質導入および培養を行うことができる自動細胞プロセッサーの使用について詳述する。私たちは、初期段階の臨床試験のプロセス開発と実施中に考慮すべき推奨事項を提供し、落とし穴について説明します。...

自動セルプロセッサーでのキメラ抗原受容体T細胞製造

このプロトコルは、レトロウイルスベクターの生産とマウスT細胞の形質導入を合理化し、マウスCAR-T細胞の効率的な生成を促進します。...

マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

このプロトコールは、ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞(CAR制御性T細胞)を生成および試験するための合理化されたワークフローを提供します。...

ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

本プロトコルは、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞およびサイトカイン誘導キラー(CIK)細胞を含む採用細胞療法(ACT)製品の拡張のためのスケーラブルな手法を、ガス透過性急速増殖(G-Rex)デバイスを用いたもので、臨床的に関連性の高い環境で効率的かつ堅牢な成長を示しています。...

GMPスケーラブルデバイスにおけるCAR-Tおよびサイトカイン誘導キラー細胞の効率的かつ迅速な生成

学ぶGMP準拠のヒト初代T細胞遺伝子導入法。白血球除去採血からのPBMC単離、密度勾配遠心、ウイルスベクター導入を含む。CAR T細胞療法などの遺伝子改変細胞治療開発に応用可能な低コスト手法です。

遺伝子改変T細胞の作製のためのGMP準拠手順

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