Name: フェリチノファジー:ヒト線維芽細胞におけるオートファジーによる鉄の選択的分解の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぶフェリチノファジー評価法。ヒト線維芽細胞を用いて、オートファジーによるリソソーム内フェリチン分解を定量的イメージングで解析し、BPANにおける鉄恒常性異常のメカニズム解明に貢献する。

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<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>初代皮膚由来ヒト線維芽細胞&nbsp;</td><td>皮膚生検、健康なヒトドナー、バイオバンク大学クリニックT&uuml;bingen、倫理承認 389/2019BO2</td><td>F-CO-60、継代 9</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養治療</td><td></td><td></td><td>最終濃度 (化合物)</td></tr><tr><td>対照培地</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>(DMSOのみ)</td></tr><tr><td>対照培地 + バフィロマイシンA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>100 nM バフィロマイシンA1</td></tr><tr><td>対照培地 + deferasiox (DFX)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 & マイクロ;M DFX</td></tr><tr><td>コントロール培地 + DFX + バフィロマイシンA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 &M DFX、100 nM バフィロマイシン A1</td></tr><tr><td>対照培地 + クエン酸第二鉄アンモニウム (FAC)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0.05 mg/mL FAC</td></tr><tr><td>対照培地 + FAC + バフィロマイシンA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>0.05 mg/mL FAC、100 nM バフィロマイシン A1</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin [BSA] フラクション V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 ヤギ a-ウサギ</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-11008</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ 546 ヤギ a-マウス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-11003</td><td></td></tr><tr><td>バフィロマイシン A1</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 細胞培養 10cm皿</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>アプリケム</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>デフェラシオックス (ICL-670)</td><td>セレックケム</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS カルシウムもマグネシウムも使用しない</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸第二鉄アンモニウム (FAC)</td><td>メルク</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>抗フェリチン (ヒト脾臓)</td><td>ロックランド</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco's</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U/mL ペニシリン、100 mg/mL ストレプトマイシン)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%) with phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 well glass-bottom #0 plates</td><td>Cellvis</td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td></td><td></td><td>PBSに溶解したPFA、pH 7.5&nbsp;</td></tr><tr><td>バフィロマイシンA1 100 mMストック</td><td></td><td></td><td>バフィロマイシンA1をDMSOで希釈</td></tr> ク<tr><td>エン酸第二鉄アンモニウム(FAC) 100 mg/mLストック</td><td></td><td></td><td>FACをオートクレーブ二重蒸留水で希釈</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td><td>PBS、10% Tween20&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS / T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS、10%Tween20、1%BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Version 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

フェリチノファジー:ヒト線維芽細胞におけるオートファジーによる鉄の選択的分解の評価

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

健康なドナー(図 1A)に由来するヒト皮膚由来の初代線維芽細胞(F-CO-60)を、バフロマイシン A1 処理とそれに続く内因性フェリチンおよび LAMP2 の免疫染色、自動画像解析、および CellProfiler ベースの解析(図 1B)を用いたフェリチノファジー評価用に調製しました。
内因性フェリチンとLAMP2の共局在は、バフィロマイシンA1の添加によりフェリチンのリソソーム分解が阻害された後に増加し、これはリソソームV-ATPase酵素を阻害し、したがってフェリチノファジーを阻害する能力と一致しています7（図2)。さらに、ソフトウェアベースの細胞認識、フェリチン認識、LAMP2認識を例として示します(図2)。
この点で、ここで概説したCellProfilerパイプラインは非常に汎用性が高く、機能的なシングルセルマーカーシステムのコンテキストで、特定のBPAN変異が細胞増殖、ミトコンドリア、またはその他のオルガネラに及ぼす影響を評価するなど、追加のおよび/または代替の読み出しに適応できることに注意する必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> 図1:実験の概要。 (A)フェリチノファジーのプロセス、および(B)このプロトコルに記載されているように、初代皮膚由来ヒト線維芽細胞のフェリチノファジーを評価するための実験ワークフローのグラフ表現。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> 図2:代表的な画像。 (A)バフィロマイシンA1の不存在下または(B)存在下で、対照培地(供給条件)中の初代皮膚由来ヒト線維芽細胞を、抗フェリチン抗体および抗LAMP2抗体を用いた間接免疫蛍光分析を行い、細胞核をDAPIで染色した。共焦点レーザー走査型顕微鏡法の自動化により取得された例示的な蛍光画像を示します(スケールバー:10μm)。フェリチンとLAMP2の存在量と共局在の変化は、バフィロマイシンA1投与によるリソソーム阻害で観察できました。.CellProfilerベースの解析も表示され、細胞認識(紫)、核(青)、フェリチン(緑)、LAMP2(赤)、共局在フェリチン/LAMP2(黄)プンクタのソフトウェア由来の画像オーバーレイが表示されます。(C)拡大画像切片(スケールバー=10μm)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:この研究で使用した共焦点レーザー走査型顕微鏡の設定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:この研究で使用したCellProfilerの数値設定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:この研究で使用したCellProfilerパイプライン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 2: CellProfiler パイプライン (補足ファイル 1 を参照) と、連続した順序で撮影されたスクリーンショット (表 2 を参照) の表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

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